酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种酸性耐高温α?淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，该生产方法采用的经过基因工程改良的枯草芽孢杆菌不会产生芽孢、适应能力强、不容易染菌、活力高、周期短。生产过程中通过调整风量控制，培养基的配比以及有效控制pH，最终制得的酸性耐高温α?淀粉酶最佳反应条件在90?110℃、pH在4.0?5.5，酶活力达到40000U/mL，发酵周期仅为120小时，是目前国内在最短的发酵周期内酶活力最高的耐酸性淀粉酶。
【专利说明】
酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物酶制剂的生产方法，特别是涉及一种酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法。
【背景技术】
[0002]α-淀粉酶(α-l，4-D_葡萄糖-葡萄糖苷水解酶)普遍分布在动物、植物和微生物中，是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α_1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。
[0003]酸性高温α-淀粉酶一般最佳反应条件在80-100°C、pH在3.0-6.0之间，能在适应工业生产中的高温偏酸性环境，提高工业生产效率。目前我国自主研究生产的耐酸性高温α-淀粉酶还不是很多，常见的OGO耐高温酸性α-淀粉酶是采用地衣芽孢杆菌(BacillusIicheniformis )经液体深层发酵、超滤等工序精制而成，然而其酶活一般只能达到20000U/mL，并且发酵周期较长。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种在更短的发酵周期内酶活更高的酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法。
[0005]为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是:
酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶提取制得，其特征在于:其步骤如下:
(1)平皿培养:培养基配方:蛋白胨:0.5-1.5%，酵母粉:0.1 -0.3%，牛肉粉:0.1 -0.5%，氯化钠:0.1-0.3%，葡萄糖:3-7%，玉米淀粉:0.5-1.5%，琼脂粉:1.5_2%，余量为水，各组分以重量百分计，控制pH为6.5-7.0，然后在温度121°C、压力0.1Mpa条件下灭菌30min，接种后36°C十旦温培养36_48h ；
(2)摇瓶培养:培养基配方:酵母粉1_2%，葡萄糖0.3-0.7%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁0.05-0.15%，余量为水，各组分以重量百分计；调pH至7.5后灭菌，接种，37 °(:摇瓶培养8_12h，当pH下降至6.5-6.7时进入种子罐；
(3)种子罐发酵:配料A:硫酸铵:3.5kg，脱脂大豆粉:17kg，磷酸二氢钠:13kg，磷酸二氢钾:4.2kg，玉米浆:60kg，硫酸镁:1.39kg，硫酸亚铁:3.06g，硫酸锰:18.2g，硫酸锌:4.8g，消泡剂:1.51^，在种子罐中121-123°(:条件下灭菌501^11;配料8:结晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C灭菌35min，冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中，然后将种子罐调整到温度32-340C，pH为6.6-6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接种后在温度32-340C，pH为6.6-6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h的条件下发酵20_30h，当溶氧68-72%，镜检菌体正常时转入发酵罐； (4)发酵罐发酵:配料A:脱脂大豆粉:180kg，玉米浆:500kg，磷酸氢二钾:175kg，磷酸二氢钾:57kg，硫酸铵:33kg，硫酸镁:0.77kg，硫酸亚铁17g，硫酸锰6.67g，硫酸锌5g，消泡剂:12kg，在发酵罐中121-123°C灭菌50min;配料B:氯化钙33kg在另一罐中121-123°C灭菌40min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；配料C:结晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123°C灭菌35min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；将发酵罐调整到pH为6.6-6.8，罐压0.4Mpa，空气流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接种后在温度38°C，pH为6.6-6.8，风量650 m3/h，罐压0.4Mpa条件下发酵100-120h ；
(5)酶的提取:取发酵醪液，调pH至9.0，然后依次加入醪液体积量2.5-4%的CaCl2,2.5-4%的Na2HPO4，稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理，加热至65-70°C后，经板框压滤、超滤栗超滤后获得滤液，然后向滤液中依次加入干糊精2%、醋酸钠8-10%、氯化钠18-22%进行调配，之后用醋酸调节pH至6.0-6.5，迅速加热至65-70°C，保持5_10min，立即冷却，取样测酶活，酶活力可达20000-40000U/mL，之后用硅藻土进行成品精过滤，装入成品储罐。
[0006]所述摇瓶培养中每150mL种母液接1-2个培养好的单菌落，每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。
[0007]所述发酵罐发酵过程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%时可通过提高风量、提高罐压、降低补糖速度来提高溶氧。
[0008]所述超滤栗超滤时维持系统压力在正常范围之内，初始压力0.3MPa，后期0.5MPa。
[0009]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
1、本发明酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法采用的经过基因工程改良的枯草芽孢杆菌不会产生芽孢、适应能力强、不容易染菌、活力高、周期短。
[0010]2、通过调整风量控制，培养基的配比以及有效控制pH，最终制得的酸性耐高温α-淀粉酶最佳反应条件在90-110 °C、ρΗ在4.0-5.5，酶活力达到40000U/mL，发酵周期仅为120小时，是目前国内在最短的发酵周期内酶活力最高的耐酸性淀粉酶。
【具体实施方式】
[0011]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0012]实施例1酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，其特征在于:其步骤如下:
(I)平皿培养:培养基配方:蛋白胨:1%，酵母粉:0.2%，牛肉粉:0.3%，氯化钠:0.2%，葡萄糖:5%，玉米淀粉:1%，琼脂粉:1.7%，余量为水，各组分以重量百分计，控制pH为6.7，然后在温度121°C、压力0.謂?&条件下灭菌3011^11，接种后36°(:恒温培养4011;
(2 )摇瓶培养:培养基配方:酵母粉1.5%，葡萄糖0.5%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.1%，余量为水，各组分以重量百分计；调PH至7.5后灭菌，接种，37°C摇瓶培养10h，当pH下降至6.6时进入种子罐；
(3)种子罐发酵:配料A:硫酸铵:3.5kg，脱脂大豆粉:17kg，磷酸二氢钠:13kg，磷酸二氢钾:4.2kg，玉米浆:60kg，硫酸镁:1.39kg，硫酸亚铁:3.06g，硫酸锰:18.2g，硫酸锌:4.8g，消泡剂:1.5kg，在种子罐中122°C条件下灭菌50min;配料B:结晶葡萄糖35kg在另外一罐中122°C灭菌35min，冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中，然后将种子罐调整到温度33°C，pH为6.7，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接种后在温度33 °C，pH为6.7，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h的条件下发酵20h，当溶氧70%，镜检菌体正常时转入发酵罐；
(4)发酵罐发酵:配料A:脱脂大豆粉:180kg，玉米浆:500kg，磷酸氢二钾:175kg，磷酸二氢钾:57kg，硫酸铵:33kg，硫酸镁:0.77kg，硫酸亚铁17g，硫酸锰6.67g，硫酸锌5g，消泡剂:12kg，在发酵罐中122°C灭菌50min;配料B:氯化钙33kg在另一罐中122°C灭菌40min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；配料C:结晶葡萄糖70kg在另一罐中122°C灭菌35min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；将发酵罐调整到PH为6.7，罐压0.4Mpa，空气流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接种后在温度38 °C，pH为6.7，风量650 m3/h，罐压0.4Mpa条件下发酵10h ；
(5)酶的提取:取发酵醪液，调pH至9.0，然后依次加入醪液体积量3%的CaCl2，3%的Na2HPO4，稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理，加热至68 °C后，经板框压滤、超滤栗超滤后获得滤液，然后向滤液中依次加入干糊精2%、醋酸钠9%、氯化钠20%进行调配，之后用醋酸调节PH至6.3，迅速加热至68°C，保持Smin，立即冷却，取样测酶活，酶活力为40000U/mL，之后用娃藻土进行成品精过滤，装入成品储罐。
[0013]所述摇瓶培养中每150mL种母液接2个培养好的单菌落，每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。
[0014]所述发酵罐发酵过程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%时可通过提高风量、提高罐压、降低补糖速度来提高溶氧。
[0015]所述超滤栗超滤时维持系统压力在正常范围之内，初始压力0.3MPa，后期0.5MPa。
[0016]实施例2酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，其特征在于:其步骤如下:
(1)平皿培养:培养基配方:蛋白胨:0.5%，酵母粉:0.1%，牛肉粉:0.1%，氯化钠:0.1%，葡萄糖:3%，玉米淀粉:0.5%，琼脂粉:1.5%，余量为水，各组分以重量百分计，控制pH为6.5，然后在温度121°C、压力0.謂?&条件下灭菌3011^11，接种后36°(:恒温培养3611;
(2)摇瓶培养:培养基配方:酵母粉1%，葡萄糖0.3%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，余量为水，各组分以重量百分计;调PH至7.5后灭菌，接种，37°C摇瓶培养8h，当pH下降至6.5时进入种子触;
(3)种子罐发酵:配料A:硫酸铵:3.5kg，脱脂大豆粉:17kg，磷酸二氢钠:13kg，磷酸二氢钾:4.2kg，玉米浆:60kg，硫酸镁:1.39kg，硫酸亚铁:3.06g，硫酸锰:18.2g，硫酸锌:4.8g，消泡剂:1.51^，在种子罐中121-123°(:条件下灭菌501^11;配料8:结晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C灭菌35min，冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中，然后将种子罐调整到温度320C，pH为6.6，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接种后在温度32-34°C，pH为6.6，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h的条件下发酵25h，当溶氧68%，镜检菌体正常时转入发酵罐；
(4)发酵罐发酵:配料A:脱脂大豆粉:180kg，玉米浆:500kg，磷酸氢二钾:175kg，磷酸二氢钾:57kg，硫酸铵:33kg，硫酸镁:0.77kg，硫酸亚铁17g，硫酸锰6.67g，硫酸锌5g，消泡剂:121^，在发酵罐中121<€灭菌50111；[11;配料13:氯化|丐331^在另一罐中121°C灭菌40min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；配料C:结晶葡萄糖70kg在另一罐中121°C灭菌35min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；将发酵罐调整到PH为6.6，罐压0.4Mpa，空气流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接种后在温度38 °C，pH为6.6，风量650 m3/h，罐压0.4Mpa条件下发酵I 1h;
(5)酶的提取:取发酵醪液，调pH至9.0，然后依次加入醪液体积量2.5%的CaCl2，2.5%的Na2HPO4，稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理，加热至65 °C后，经板框压滤、超滤栗超滤后获得滤液，然后向滤液中依次加入干糊精2%、醋酸钠8%、氯化钠18%进行调配，之后用醋酸调节PH至6.0，迅速加热至65°C，保持5min，立即冷却，取样测酶活，酶活力为30000U/mL，之后用娃藻土进行成品精过滤，装入成品储罐。
[0017]所述摇瓶培养中每150mL种母液接I个培养好的单菌落，每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。
[0018]所述发酵罐发酵过程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%时可通过提高风量、提高罐压、降低补糖速度来提高溶氧。
[0019]所述超滤栗超滤时维持系统压力在正常范围之内，初始压力0.3MPa，后期0.5MPa。
[0020]实施例3酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，其特征在于:其步骤如下:
(1)平皿培养:培养基配方:蛋白胨:1.5%，酵母粉:0.3%，牛肉粉:0.5%，氯化钠:0.3%，葡萄糖:7%，玉米淀粉:1.5%，琼脂粉:2%，余量为水，各组分以重量百分计，控制pH为7.0，然后在温度121°C、压力0.謂?&条件下灭菌3011^11，接种后36°(:恒温培养4811;
(2)摇瓶培养:培养基配方:酵母粉2%，葡萄糖0.7%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.15%，余量为水，各组分以重量百分计；调PH至7.5后灭菌，接种，37°C摇瓶培养12h，当pH下降至6.7时进入种子罐；
(3)种子罐发酵:配料A:硫酸铵:3.5kg，脱脂大豆粉:17kg，磷酸二氢钠:13kg，磷酸二氢钾:4.2kg，玉米浆:60kg，硫酸镁:1.39kg，硫酸亚铁:3.06g，硫酸锰:18.2g，硫酸锌:4.8g，消泡剂:1.5kg，在种子罐中123°C条件下灭菌50min;配料B:结晶葡萄糖35kg在另外一罐中123°C灭菌35min，冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中，然后将种子罐调整到温度34°C，pH为6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接种后在温度34 °C，pH为6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h的条件下发酵30h，当溶氧72%，镜检菌体正常时转入发酵罐；
(4)发酵罐发酵:配料A:脱脂大豆粉:180kg，玉米浆:500kg，磷酸氢二钾:175kg，磷酸二氢钾:57kg，硫酸铵:33kg，硫酸镁:0.77kg，硫酸亚铁17g，硫酸锰6.67g，硫酸锌5g，消泡剂:12kg，在发酵罐中123 °C灭菌50min;配料B:氯化I丐33kg在另一罐中123°C灭菌40min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；配料C:结晶葡萄糖70kg在另一罐中123°C灭菌35min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；将发酵罐调整到PH为6.8，罐压0.4Mpa，空气流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接种后在温度38 °C，pH为6.8，风量650 m3/h，罐压0.4Mpa条件下发酵120h;
(5)酶的提取:取发酵醪液，调pH至9.0，然后依次加入醪液体积量4%的CaCl2，4%的Na2HPO4，稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理，加热至70°C后，经板框压滤、超滤栗超滤后获得滤液，然后向滤液中依次加入干糊精2%、醋酸钠10%、氯化钠22%进行调配，之后用醋酸调节PH至6.5，迅速加热至70°C，保持lOmin，立即冷却，取样测酶活，酶活力为35000U/mL，之后用娃藻土进行成品精过滤，装入成品储罐。
[0021]所述摇瓶培养中每150mL种母液接2个培养好的单菌落，每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。
[0022]所述发酵罐发酵过程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%时可通过提高风量、提高罐压、降低补糖速度来提高溶氧。
[0023]所述超滤栗超滤时维持系统压力在正常范围之内，初始压力0.3MPa，后期0.5MPa。
[0024]1、超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，其特征在于:其步骤如下:
(1)平皿培养:培养基配方:蛋白胨:0.5-1.5%，酵母粉:0.1 -0.3%，牛肉粉:0.1 -0.5%，氯化钠:0.1-0.3%，葡萄糖:3-7%，玉米淀粉:0.5-1.5%，琼脂粉:1.5_2%，余量为水，各组分以重量百分计，控制PH为6.5-7.0，然后在温度121°C、压力0.1Mpa条件下灭菌30min，接种后36°(:恒温培养36-48h;
(2)摇瓶培养:培养基配方:酵母粉1_2%，葡萄糖0.3-0.7%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁0.05-0.15%，余量为水，各组分以重量百分计；调pH至7.5后灭菌，接种，37 °(:摇瓶培养8_12h，当pH下降至6.5-6.7时进入种子罐；
(3)种子罐发酵:配料A:硫酸铵:3.5kg，脱脂大豆粉:17kg，磷酸二氢钠:13kg，磷酸二氢钾:4.2kg，玉米浆:60kg，硫酸镁:1.39kg，硫酸亚铁:3.06g，硫酸锰:18.2g，硫酸锌:4.8g，消泡剂:1.51^，在种子罐中121-123°(:条件下灭菌501^11;配料8:结晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C灭菌35min，冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中，然后将种子罐调整到温度32-340C，pH为6.6-6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接种后在温度32-340C，pH为6.6-6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h的条件下发酵20_30h，当溶氧68-72%，镜检菌体正常时转入发酵罐；
(4)发酵罐发酵:配料A:脱脂大豆粉:180kg，玉米浆:500kg，磷酸氢二钾:175kg，磷酸二氢钾:57kg，硫酸铵:33kg，硫酸镁:0.77kg，硫酸亚铁17g，硫酸锰6.67g，硫酸锌5g，消泡剂:12kg，在发酵罐中121-123°C灭菌50min;配料B:氯化钙33kg在另一罐中121-123°C灭菌40min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；配料C:结晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123°C灭菌35min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；将发酵罐调整到pH为6.6-6.8，罐压0.4Mpa，空气流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接种后在温度38°C，pH为6.6-6.8，风量650 m3/h，罐压0.4Mpa条件下发酵100-120h ；
(5)酶的提取:取发酵醪液，调pH至9.0，然后依次加入醪液体积量2.5-4%的CaCl2,2.5-4%的Na2HPO4，稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理，加热至65-70°C后，经板框压滤、超滤栗超滤后获得滤液，然后向滤液中依次加入干糊精2%、醋酸钠8-10%、氯化钠18-22%进行调配，之后用醋酸调节pH至6.0-6.5，迅速加热至65-70°C，保持5_10min，立即冷却，取样测酶活，最终发酵酶可达20000-40000U/mL，之后用硅藻土进行成品精过滤，装入成品储触。
[0025]2.根据权利要求1所述的超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，其特征在于:摇瓶培养中每150mL种母液接1-2个培养好的单菌落，每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。
[0026]3.根据权利要求1所述的超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，其特征在于:发酵罐发酵过程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%时可通过提高风量、提高罐压、降低补糖速度来提尚溶氧。
[0027]4.根据权利要求1所述的超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，其特征在于:超滤栗超滤时维持系统压力在正常范围之内，初始压力0.3MPa，后期0.5MPa。
【主权项】
1.超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，选用基因改良的枯草芽孢杆菌，通过平皿培养、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、酶的提取制得，其特征在于:其步骤如下: (1)平皿培养:培养基配方:蛋白胨:0.5-1.5%，酵母粉:0.1-0.3%，牛肉粉:0.1-0.5%，氯化钠:0.1-0.3%，葡萄糖:3-7%，玉米淀粉:0.5-1.5%，琼脂粉:1.5_2%，余量为水，各组分以重量百分计，控制PH为6.5-7.0，然后在温度121°C、压力0.1Mpa条件下灭菌30min，接种后36°(:恒温培养36-48h; (2)摇瓶培养:培养基配方:酵母粉1_2%，葡萄糖0.3-0.7%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁0.05-0.15%，余量为水，各组分以重量百分计；调pH至7.5后灭菌，接种，37 °(:摇瓶培养8_12h，当pH下降至6.5-6.7时进入种子罐； (3)种子罐发酵:配料A:硫酸铵:3.5kg，脱脂大豆粉:17kg，磷酸二氢钠:13kg，磷酸二氢钾:4.2kg，玉米浆:60kg，硫酸镁:1.39kg，硫酸亚铁:3.06g，硫酸锰:18.2g，硫酸锌:4.8g，消泡剂:1.51^，在种子罐中121-123°(:条件下灭菌501^11;配料8:结晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C灭菌35min，冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中，然后将种子罐调整到温度32-340C，pH为6.6-6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接种后在温度32-340C，pH为6.6-6.8，罐压0.5Mpa，空气流量40m3/h的条件下发酵20_30h，当溶氧68-72%，镜检菌体正常时转入发酵罐； (4)发酵罐发酵:配料A:脱脂大豆粉:180kg，玉米浆:500kg，磷酸氢二钾:175kg，磷酸二氢钾:57kg，硫酸铵:33kg，硫酸镁:0.77kg，硫酸亚铁17g，硫酸锰6.67g，硫酸锌5g，消泡剂:12kg，在发酵罐中121-123°C灭菌50min;配料B:氯化钙33kg在另一罐中121-123°C灭菌40min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；配料C:结晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123°C灭菌35min，冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中；将发酵罐调整到pH为6.6-6.8，罐压0.4Mpa，空气流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接种后在温度38°C，pH为6.6-6.8，风量650 m3/h，罐压0.4Mpa条件下发酵100-120h ； (5)酶的提取:取发酵醪液，调pH至9.0，然后依次加入醪液体积量2.5-4%的CaCl2，2.5-4%的Na2HPO4，稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理，加热至65-70°C后，经板框压滤、超滤栗超滤后获得滤液，然后向滤液中依次加入干糊精2%、醋酸钠8-10%、氯化钠18-22%进行调配，之后用醋酸调节pH至6.0-6.5，迅速加热至65-70°C，保持5_10min，立即冷却，取样测酶活，最终发酵酶可达20000-40000U/mL，之后用硅藻土进行成品精过滤，装入成品储触。2.根据权利要求1所述的超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，其特征在于:摇瓶培养中每150mL种母液接1-2个培养好的单菌落，每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。3.根据权利要求1所述的超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，其特征在于:发酵罐发酵过程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%时可通过提高风量、提高罐压、降低补糖速度来提高溶氧。4.根据权利要求1所述的超酸性耐高温α-淀粉酶的生产方法，其特征在于:超滤栗超滤时维持系统压力在正常范围之内，初始压力0.3MPa，后期0.5MPa。
【文档编号】C12N9/26GK105861467SQ201610494431
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】温文伟, 温明
【申请人】温文伟