一种耐酸性高温β-淀粉酶突变体及其应用的制作方法【专利摘要】一种耐酸性高温β-淀粉酶突变体及其应用，以热硫梭菌（Thermoanaerobacterium?thermosulfurigenes）高温β-淀粉酶为亲本，采用分子酶工程技术，将催化功能域附近的小氨基酸，包括第115位半胱氨酸、312位丙氨酸、351位苏氨酸和354位半胱氨酸改造为丝氨酸，具体为含有SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列，所获得的变体β-淀粉酶在保持耐温特性的同时将最适pH值由亲本酶的pH6.0降低为pH4.0，活力提高1.4倍，该耐酸性高温变体β-淀粉酶比野生型更有利于淀粉工业的工业化生产。【专利说明】一种耐酸性高温P-淀粉酶突变体及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生物【
技术领域：
】，具体是一种耐酸性高温0-淀粉酶突变体，以及该突变体酶在淀粉降解和含淀粉材料的处理中的应用，尤其是用于生产高纯麦芽糖浆的应用【
背景技术：
】[0002]@-淀粉酶又称为a-1，4-葡聚糖-麦芽糖水解酶(1，4-a-D-glucanmaltohydrolase,EC3.2.1.2),可以从淀粉的非还原性末端水解a-1,4_糖苷键生成^-型麦芽糖，因此被广泛应用于制造饴糖、麦芽糖、麦芽糖醇、麦芽糊精以及酿造啤酒、酒精和醋等发酵工业(吴林德，郑大鹏.介绍一种新型酶制剂-淀粉酶[J].微生物学杂志，1986，(3))。(6-淀粉酶可以由高等植物和一些微生物产生，然而由于细菌产生的^-淀粉酶具有结合生淀粉的能力，并且具有较高的温度耐受性和催化活性，从而更加适应于工业化生产(L.J.Derde,S.V.Gomand,C.M.Courtin,J.A.Delcour.Characterisationofthreestarchdegradingenzymes:Thermostable旦-amylase,maltotetraogenicandmaltogenica-amylases.FoodChemistry,135(2012)713-721.)。目前已经获得的细菌(6-淀粉酶的最适pH值大约为6.5-7.0，植物P-淀粉酶的最适pH约为5.0-6.0(AkiraHirata,MotoyasuAdachi,ShigeruUtsumi,BunzoMikam1.EngineeringofthepHoptimumofBacilluscereusBeta-Amylase:ConversionofthepHOptimumfromaBacterialTypetoaHigher-PlantType.Biochemistry2004,43,12523-12531.)?Hirata等报道了基因工程手段将Bacilluscereus^-淀粉酶的最适pH从6.7降低到4.2,但是突变酶的活力仅为野生型的3%，同时最适温度仍为37°C(AkiraHirata,MotoyasuAdachi,ShigeruUtsumi,BunzoMikam1.EngineeringofthepHoptimumofBacilluscereusBeta-Amylase:ConversionofthepHOptimumfromaBacterialTypetoaHigher-PlantType.Biochemistry2004,43,12523-12531.)。商品化的P-淀粉酶主要是从高等植物如大麦、大豆和甘薯等中提取，如杜邦-杰能科公司的OPTIMALTBBA，其最适作用温度为57°C，最适的pH在5.5左右。在温度高于60°C或者pH低于4.5时迅速失活。P-淀粉酶的生产与研究的目前状况，显然与淀粉工`业中普遍存在的高温、低PH操作环境存在明显的差距。例如，淀粉糖工业、发酵饮料、发酵废液处理及酒精行业中通常存在酸性条件下加工淀粉质原料的步骤，具有明显的耐酸性将使3-淀粉酶具有更大的应用潜力和开发前景。因此，为了满足一些在酸性条件下进行淀粉原料加工工艺的要求，实现与其他酸性酶类的联用，进一步简化工艺、降低成本、节约水和能源，迫切需要开发一种耐酸高温(6-淀粉酶。【
发明内容】[0003]本发明提供一种耐酸性高温(6-淀粉酶突变体，解决了现有(6-淀粉酶不能同时兼顾耐酸性和耐温性的问题。[0004]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种耐酸性高温P-淀粉酶突变体，以热硫梭菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)3-淀粉酶基因ctba,GenBank序列号为M22471.1为模板为模板，通过引物介导的聚合酶链式反应技术引入突变，分别将115位半胱氨酸、312位丙氨酸、351位苏氨酸和354位半胱氨酸改变为丝氨酸，改造得到新的耐温耐酸P-淀粉酶突变体。该P-淀粉酶最适pH值为4.0，最适温度为70°C,最大酶活为1308U/mg，可用于高效降解淀粉质原料，尤其适用于酸性高温条件下的应用。[0005]所述耐酸耐温P-淀粉酶变体酶序列特征如SEQIDNO:1所示。[0006]所获得变体P-淀粉酶TBA-S4在淀粉降解和含淀粉材料处理中的应用，主要应用在淀粉质麦芽糖、麦芽糖醇、麦芽糊精、饴糖以及酿造啤酒、酒精和醋等发酵工业中，尤其适用于与淀粉工业中其他酸性酶类如a-淀粉酶、普鲁兰酶、糖化酶等的联用开发新的同步工艺。将该耐酸性3-淀粉酶突变体应用于食品、医药、化工都能领域，可以在强耐酸性环境下高效降解淀粉生成麦芽糖，具有广阔的应用前景。[0007]本发明与已有技术相比，具有以下实质性特点和显著的进步:[0008]1、这个新的(6-淀粉酶突变体与原始酶相比，最适pH值由中性的6.0降低为酸性的4.0，活力提高1.4倍。[0009]2、本发明公开的P-淀粉酶变体酶，其序列为SEQID:1，由519个氨基酸组成，与GenBank中序列号为AAA23204.1的亲本酶相比，只保留了成熟肽区域33-551氨基酸肽段，同时有四个位点不同，即分别将115位半胱氨酸、312位丙氨酸、351位苏氨酸和354位半胱氨酸改变为丝氨酸。[0010]3、本发明公开的(6-淀粉酶变体酶，最适pH值为4.0，在pH3.0-5.0的酸性范围内可以保留75%以上的活性,最适温度为70°C,最大比活力为1308U/mg，水解木薯淀粉和可溶性淀粉的产物只有麦芽糖生成。与之相比，亲本酶的最适pH为5.5-6.0，在pH3.0条件下活力大约为50%，最大比活力为553.78U/mg0商品化的P-淀粉酶,如杜邦-杰能科公司的大麦@-淀粉酶OPTIMALTBBA的最适pH为5.5，最适温度为57°C，70°C即被灭活。[0011]因而本专利公开的变体P-淀粉酶TBA-S4明显不同于已有的亲本P-淀粉酶及商品化3-淀粉酶、显著地取得了预料不到的技术效果，其提高的催化活性和酸稳定性更加适应于淀粉工业中水解淀粉过程对酶耐受高反应温度、高酸性以及高生产效率的要求。[0012]应当理解的是，本发明具有重要的经济效益，突变体酶的高催化效率和高麦芽糖转化率有利于降低生产成本，耐温性和耐酸特性满足一些在酸性条件下进行淀粉原料加工工艺的要求，有利于实现与其他酸性酶类的联用，进一步简化工艺、降低成本、节约水和能源。【专利附图】【附图说明】[0013]图1是P-淀粉酶突变体TBA-S4纯化酶的SDS-PAG电泳图。1_纯化的P-淀粉酶突变体TBA-S4；M-蛋白质标准样品。[0014]图2是P-淀粉酶野生型和突变体TBA-S4酶活随pH变化图。其中?代表TBA-S4，代表野生型。[0015]图3是P-淀粉酶突变体TBA-S4水解1%可溶性淀粉产物的高效液相色谱图。其中1-代表流动相乙腈，2代表麦芽糖。【具体实施方式】[0016]以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但是这些实施例不应当被理解为对本发明的限制。[0017]实施例1[0018]本实施例说明0-淀粉酶基因ctba的获得及重组表达载体的构建[0019]I)提取热硫梭菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes),美国典型培养物保藏中心编号为ATCC33743，染色体DNA作为模板；[0020]2)以SEQIDNO:2为上游引物(含有一个NcoI酶切位点)和以SEQIDNO:3(含有一个BamHI酶切位点，并引入一个6x组氨酸标签编码序列)为下游引物，通过聚合酶链式反应PCR扩增P-淀粉酶基因ctba，GenBank序列号为M22471.1，的成熟肽编码区域，对应于ctba基因中660-2219片段，所得PCR目的产物长度为1605bp；[0021]3)将目的产物和pSE380载体质粒分别用NcoI和BamHI酶双酶切，胶回收后，用T4DNA连接酶进行连接，并转化入大肠杆菌(E.coli)XLl-Blue感受态细胞；[0022]4)挑选转化子进行酶切验证和DNA测序分析，验证连接正确的转化子即为P_淀粉酶基因重组表达载体，命名为pSBA。[0023]实施例2[0024]本实施例说明突变体表达质粒的构建[0025]采用PCR引物介导的定点突变方法，以全质粒pSBADNA为模板，构建单点突变体，然后以含有单点突变的重组质粒为模板，用含有第二个突变位点的引物引入第二个突变，依次类推构建含有多个突变位点的突变体质粒。具体如下:[0026]I)以pSBA质粒DNA为模板，分别以SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为上、下游引物，构建PCR反应体系。25iiLPCR反应体系的构建如下:liiLpSA7D质粒DNA，0.5yL上游引物Amy7_S(浓度为IOmmol/L),0.5yL下游引物Amy7_A(浓度为IOmmol/L),2uLdNTPs(每样dNTP2.5mmol/L),5uL5xPrimerSTAR?buffer,0.25uL(2.5U/uL)PriincrSTAR'8DNA聚合酶，加入16.75uLddH20补足至25uL。体系混匀后置于PCR以上执行扩增反应。PCR扩增条件均为:第一步:95°C3min;第二步:98°C10s，68°C6min，如此循环30次；第三步:72°CIOmin0PCR产物经DpnI(购自加拿大Fermentas公司)37°C消化2h，消化产物于80°C失活20min后，直接转化E.coliXLl-Blue感受态细胞，转化产物在含有IOOyg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取单菌落接种于含100ug/mL氨苄青霉素抗性的液体LB培养液中培养，提取质粒委托上海生工测序验证。验证正确的质粒即为将3-淀粉酶115位半胱氨酸突变为丝氨酸的重组表达质粒，标记为pSBA-Sl；[0027]2)以突变体重组质粒pSBA-Sl为模板，以SEQIDN0:6和SEQIDN0:7为上、下游引物，采用与步骤I)中相同的PCR体系构建、扩增、产物DpnI酶消化、转化及验证操作，所得验证正确的重组子，即为分别将P-淀粉酶第115位半胱氨酸和312位丙氨酸突变为丝氨酸的重组表达质粒，标记为PSBA-S2；[0028]3)以重组质粒pSBA-S2为模板，以SEQIDNO:8SEQIDNO:9为上、下游引物，采用与步骤I)中操作方法，所得验证正确的重组子，即为分别将P-淀粉酶第115位半胱氨酸、第312位丙氨酸和第351位苏氨酸均突变为丝氨酸的重组表达质粒，标记为PSBA-S3；[0029]4)以重组质粒pSBA-S3为模板，以SEQIDNO:10和SEQIDNO:11为上、下游引物，采用与步骤I)中操作方法，所得验证正确的重组子，即为分别将(6-淀粉酶(6-淀粉酶第115位半胱氨酸、第312位丙氨酸、第351位苏氨酸和第354位半胱氨酸均突变为丝氨酸的重组表达质粒，标记为pSBA-S4。[0030]实施例3[0031]本实施例说明突变体酶的诱导表达纯化和表征[0032]I)挑取含有重组表达质粒pSBA-S4的大肠杆菌工程菌单菌落，接种于5ml含有100Iig/ml氨节青霉素的LB培养液(酵母膏10g/L,蛋白胨5g/L,氯化钠10g/L,天然pH),于37°C、220r/min条件下培养过夜。将过夜培养之菌液，按照1%的接种量转接于500ml含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养液中。待菌液培养至0D_为0.6左右，加入终浓度为lmmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h；[0033]2)于9000r/min、4°C离心收集诱导表达的工程菌,沉淀用0.05mol/L醋酸酸缓冲液(PH6.0)洗涤一次后，重悬于100ml同样的缓冲液中，菌悬液通过高压细胞破碎机JN-10HC(广州聚能生物科技有限责任公司)破胞，流速10L/H，4°C，压力为150MPa，破胞液于12000r/min4°C下离心30min,上清液为粗酶液；[0034]3)采用金属螯合层析的方法纯化重组酶TBA-S4，首先，粗酶液上清液加入终浓度为300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，用0.22ym滤膜过滤所得透过液直接用TALON金属亲和树脂纯化重组酶。纯化所得酶液，通过分子截留量为IOKDa的Millipore超滤管，反复换洗缓冲液两次，以除去盐分及咪唑成份。纯化蛋白的纯度和均一性通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE进行检测，蛋白的含量通过Bradford法，以BSA为标准蛋白进行检测。检测结果如图1所示，可见得到了电泳纯的条带；[0035]4)(6-淀粉酶突变体TBA-S4的酶学表征，酶活的测定方法是，取10iU适当稀释的TBA-S4纯化酶液加入390UI溶解于0.05mol/LpH4.0醋酸缓冲溶液中的1%可溶性淀粉(质量百分比)，于60°C水浴中反应30min，然后加入400iilDNS试剂(蒸馏水:372.63ml，DNS:2.79g,NaOH:5.21g,酒石酸钾钠:80.53g，苯酚:2.00ml，亚硫酸氢钠:2.18g)，于沸水浴煮沸5min，冷却至室温，采用分光光度法测定OD540值，通过麦芽糖标准曲线确定酶活。最适温度的测定通过将上述400Ul反应体系分别置于45-85°C区间范围内测定酶活，用相对酶活的最大值对应的温度表示。最适PH值通过测定pH2.5-7.5范围内的相对酶活，用最大相对酶活对应的PH值表示。采用双倒数法，在最适pH和最适温度条件下对酶进行酶学参数测定。表征结果表明，TBA-S4的最适pH为4.0，最适温度为70°C，最大比活力为1308U/mg。每单位(U)酶活定义为:pH4.0，60°C条件下每分钟转化生成Iymol麦芽糖的酶量。突变体(6-淀粉酶突变体TBA-S4和突变前的亲本酶相比，TBA-S4将最适pH降低了2个单位，活力提高1.4倍。酶活随pH变化如图2所示。[0036]实施例4[0037]本实施例说明突变体酶TBA-S4在水解淀粉质原料生产高纯麦芽糖浆中的应用[0038]取Ig马铃薯可溶性淀粉加入0.05mol/LpH4.0醋酸缓冲溶液中调制为1%(质量百分比)的淀粉浆，按照1.2mg酶/g干物质淀粉的量加入纯化的酶液，然后置于60°C水浴中温浴，分别于4h、20h、28h和92h各取2ml样品，于100°C水浴热处理IOmin后，12000r/min离心5min,上清液通过0.22ym滤膜过滤,取20yL过滤液通过氨基柱对酶解产物进行高效液相色谱HPLC检测。HPLC法采用依利特HypersilNH2(4.6mmX300mm,5ym)氨基色谱柱，柱温为30°C，示差折光检测器，流动相为乙腈:水(70:30，V/V)，流速为lml/min，采用外标标准曲线法计算样品中麦芽糖含量。淀粉麦芽糖转化率用生成的麦芽糖量与初始淀粉量之比表示。HPLC检测结果如图3所示。从中可以看出，在酸性条件下，TBA-S4水解可溶性淀粉产物只有麦芽糖的生成，酶解24h的转化率为55%。[0039]对本领域技术人员而言，可以根据本发明对热硫梭菌或者其他来源的(6-淀粉酶加以改进或者替换。例如对热硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)TBA的相同位点引入其他的氨基酸突变达到相同的改善PH稳定性、热稳定性、催化效率和转化率的效果，或者在本发明公开的热硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)TBA位点的附近位点引入突变间接地达到相类似的效果，或者在其他来源3-淀粉酶对等位点或者附近位点引入同样或者类似的突变达到同样的改造效果。这些(6-淀粉酶的来源包括巨大芽抱杆菌(Bacillusmegaterium)、多粘芽抱杆菌(Bacilluspolymyxa)、腊状芽抱杆菌(Bacilluscereus)、环状芽抱杆菌(Bacilluscirculans)、热硫梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)>假单胞菌(Pseudomonas)、土佐链霉菌(Streptomycestosaensisnov)、高温放线菌(Thermeoactinomycessp.)和诺卡氏菌(Nocaridasp.)等。应当理解的是，所有这些改造和改进都应属于本发明所要求保护的权利要求范围。【权利要求】1.一种耐酸性高温(6-淀粉酶突变体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQIDN0:1所/Jno2.权利要求1所述的耐酸性高温(6-淀粉酶突变体，其特征在于:它是以热硫梭菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)高温P-淀粉酶为亲本酶，将催化功能域附近的小氨基酸，包括第115位半胱氨酸、312位丙氨酸、351位苏氨酸和354位半胱氨酸改造为丝氨酸。3.权利要求1所述的耐酸性高温P-淀粉酶突变体，其特征在于:该突变体酶最适PH为4.0，最适温度为70°C。4.一种宿主细胞，其特征在于:它是具有权利要求1中所述耐酸性高温(6-淀粉酶突变体的原核细胞或真核细胞。5.权利要求1所述的耐酸性高温(6-淀粉酶突变体在淀粉降解和含淀粉材料的处理中的应用，尤其是在生产高纯`麦芽糖浆中的应用。【文档编号】C12R1/01GK103695386SQ201310730539【公开日】2014年4月2日申请日期:2013年12月25日优先权日:2013年12月25日【发明者】王成华,蒙健宗,梁莲华,程婷婷,李晓明,韦航,陈发忠,杜奇石,周礼芹申请人:南宁邦尔克生物技术有限责任公司