一种新型中温α-淀粉酶的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型中温α-淀粉酶的应用。氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶AmyM在处理淀粉制备富含麦芽六糖糖浆方面的应用。其中，所述的糖浆组分组成为：麦芽四糖以上低聚糖含量50％以上；麦芽三糖含量8-10％，麦芽糖含量低于6％，其他低聚糖低于35％。本发明淀粉酶制得的糖浆与现有的麦芽六糖糖浆相比，葡萄糖含量较低，麦芽六糖含量更高，酶处理后糖组分相对单一，应用性更广，且由于本发明涉及到的新型α-淀粉酶 AmyM的优良特性，使得低聚糖的制备过程简单，产物易纯化。
【专利说明】-种新型中温α-淀粉酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于淀粉及淀粉糖制品制备技术、食品添加剂技术和含淀粉产品处理领 域，涉及一种新型中温α-淀粉酶的应用，具体涉及一种新型中温α-淀粉酶在处理各种淀 粉制备富含麦芽六糖糖浆的应用。
【背景技术】
[0002] 低聚麦芽糖一般指由3 -9个单糖组成的聚合体，包含麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五 糖以及麦芽六糖等。低聚麦芽糖浆主要采用优质玉米淀粉，经过淀粉酶水解而制得的糖浆， 产品甜度低，口感佳。经过酶水解制备的低聚麦芽糖，食用后血糖上升缓慢，且发热量低，对 于糖尿病、心血管患者以及肥胖者都有较好的保健作用。低聚麦芽糖引起的胰岛素反应平 稳，克服了运动中服用单、双糖引起的回跃性低血糖反应，在运动饮料中具有重要的应用前 景。生产高麦芽六糖含量糖浆由于所用的淀粉酶的性质的原因，产量较低，目前市场上富含 麦芽六糖糖浆 7 y'才U 3' G67,其麦芽六糖/七糖总含量只有40%左右。而其他非产麦芽 六糖的α -淀粉酶制备的糖浆其麦芽低六糖含量一般低于30%。
[0003] 麦芽低聚糖（3-6糖）可以阻止面包存储过程中支链淀粉的重结晶，改善面包品 质。面包等面制品加工过程中淀粉颗粒在高温下会发生糊化，在冷却/存储过程中其中的 支链淀粉会重新结晶，从而导致面包变硬，货架期缩短。在面包等面制品中添加高产麦芽六 糖的中温淀粉酶可以产生大量麦芽六糖等低聚麦芽糖，增加发酵率，改进产品的体积和质 地，改变面制品的口感，延长面制品的保鲜时间。1955年美国FDA和英国1963年分别经过 "公认无害"(General Recognized As Safe, GRAS)验证后，真菌淀粉酶允许作为面包添加剂 用于面包工业中。但真菌淀粉酶产物是麦芽糖，其抑制支链淀粉重结晶的效果较差。2009 年，来自于Pseudomonas saccharophila的麦芽四糖酶通过FDA的GRAS认证，作为面包烤 制的添加剂被使用。本发明发现的高产麦芽六糖的新型中温淀粉酶由于其高产麦芽六糖活 性，具有作物面包烤制添加酶的潜力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新型中温α-淀粉酶的应用。
[0005] 本发明所述的目的可通过以下技术方案实现：
[0006] 本发明所述的α -淀粉酶AmyM为申请日为2013年2月4日，专利号为"ZL 201310043628. 5"名称为"一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用" 的中国发明专利中请求保护的α -1，4淀粉酶外切酶。该淀粉酶的制备方法详见"ZL 201310043628. 5"专利说明书实施例1?2。
[0007] 氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的α -淀粉酶AmyM在处理淀粉制备富含麦芽六 糖糖浆方面的应用。
[0008] 其中，所述的糖浆组分组成为：麦芽四糖以上低聚糖含量50%以上；麦芽三糖含 量8-10%，麦芽糖含量低于6% (包括6%)，其他低聚糖低于35% (包括35%)，所述的麦 芽四糖以上低聚糖为4?7个单糖聚合形成的低聚糖；所述的其他低聚糖为八个及以上单 糖聚合形成的低聚糖。
[0009] 所述的糖浆中七糖及以下低聚糖的组成为：G1_葡萄糖3-5% ;G2_麦芽糖5-7% ; 63-麦芽三糖6-8%;64-麦芽四糖7-9%;65-麦芽五糖8-10%;66-麦芽六糖55-60% ; G7-麦芽七糖约4-6%。
[0010] 所述的淀粉的来源优选玉米、小麦、土豆。
[0011] 氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的α-淀粉酶AmyM酶解淀粉产物在制备运动饮 料、发酵饮料和/或啤酒发酵中的应用。
[0012] 麦芽低聚糖可以在不改变食品的原味的情况下可达到食品低甜度化效果。其保 湿、吸湿性能稳定能维持适当的水分，防止烘烤制品中淀粉回生，维持食品的柔软性、延长 保质期。本发明高产麦芽六糖的a-淀粉酶在制备低葡萄糖、高麦芽六糖含量糖浆方面具 有较好的应用价值，并且可以作为添加剂来延长烤焙面制品的货架期。
[0013] 有益效果
[0014] 专利号为"ZL 201310043628. 5"虽然公开了 a-淀粉酶具有高酶活，以及中温特 性、耐盐性和良好的稳定性，但是并没有公开其产物的组成。发明人在后续研究中惊喜的发 现该淀粉酶不止具有前述的诸多优点，而且其酶解产物中麦芽六糖占据了很大的比例，超 过50%。且本发明淀粉酶制得的糖浆与现有的麦芽糖糖浆、麦芽四糖糖浆和麦芽六糖糖浆 相比，葡萄糖含量较低，酶处理后糖组分相对单一，应用性更广，且由于本发明涉及到的新 型a -淀粉酶AmyM的优良特性，使得低聚糖的制备过程简单，产物易纯化。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1利用申请号为"201310043628. 5"涉及的a -淀粉酶处理生淀粉产物HPLC分 析
[0016] 图2利用申请号为"201310043628.5"涉及的a-淀粉酶处理生淀粉后产物中的 寡糖组分HPLC分析
[0017] a图为麦芽寡糖标准品HPLC分析图；b图为AmyM处理生淀粉后水解产物中寡糖组 分HPLC分析图，其中Ml为葡萄糖，M2为麦芽糖，M3为麦芽三糖，M4为麦芽四糖，M5为麦芽 五糖，M6为麦芽六糖，M7为麦芽七糖。
[0018] 图3利用申请号为"201310043628.5"涉及的α-淀粉酶处理生淀粉后产物中的 寡糖组分TLC分析
[0019] 其中1 - 7为分别为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦 芽七糖标准品，8 -10为可溶性淀粉经α -淀粉酶AmyM处理10分钟，30分钟和1小时后的 产物组成
[0020] 图4商业化淀粉酶ΒΑΝ800和新型α -淀粉酶对比处理生淀粉后产物HPLC分析
[0021] 其中a图：新型α -淀粉酶不同时间（I. 5h，3h，5h，12h)处理生淀粉HPLC图；b图： 商业化淀粉酶BAN800与新型α-淀粉酶3h处理生淀粉HPLC图；c图：商业化淀粉酶BAN800 与新型α -淀粉酶12h处理生淀粉HPLC图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1新型α -淀粉酶的制备
[0023] 详见中国发明专利201310043628. 5说明书实施例1?2。
[0024] 实施例2.新型α -淀粉酶活性测定及产物薄板层析分析
[0025] I. Oml 0· 5%可溶性淀粉（50mM pH7. OTris - HCl缓冲液）（先加热到50°C )添加 1 μ 1酶液（原液稀释10倍后），50°C条件下反应IOmin后，加入2ml DNS即定容到3ml后， 沸水浴5min，冷却，于OD54tl下测定其吸光值，对照组为热失活1 μ 1酶液（原液稀释10倍 后），处理同上。根据葡萄糖标准曲线计算所测淀粉酶活，50°C条件下每分钟产生1 μ mol的 还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。
[0026] 淀粉酶AmyM处理淀粉10分钟，30分钟和1小时后利用薄板层析（TLC)分析其产 物组分，TLC条件是：展层剂为正丁醇：甲醇：水=4:2: 1，显色剂为H2SO4/甲醇（1: 1，v/v)， 显色条件为90°C烘干lOmin，结果见图3,发现该酶作用于淀粉后的主要产物是麦芽六糖。
[0027] 实施例3.新型α -淀粉酶水解淀粉产生以麦芽六糖为主的低聚麦芽糖
[0028] 将蜡质玉米淀粉（不限于蜡质玉米），配成8 %的悬浮液，用磷酸缓冲溶液将pH值 调节到6,置于99°C超级恒温水浴锅中至完全糊化，之后将完全糊化的淀粉糊冷却到50°C 后添加 a-amylase AmyM淀粉酶，a - amylase的添加量为淀粉干基的5% (相当于100U 每g干淀粉基质），并分别收集3、12h的产物，酶解12h后升温到100°C保温20min灭酶，收 集的产物使用KS803柱分析。色谱柱为Shodex KS - 803 (8mmX 300mm)，检测器为示差检测 器。样品配制成2g/L的溶液，过0. 45 μ m的膜，以超纯水为流动相，进样量20 μ L，流速为 0. 8mL/min，柱温70°C，检测器温度为50°C。
[0029] 玉米淀粉酶解后的产物分析发现（图1)，四糖以上，52. 24%;三糖，8. 14%，二糖， 5. 94%;其他寡糖，33. 68%。通过对酶解产物HPLC分析其具体麦芽低聚糖组分的相对含量 (图2)，发现Gl -葡萄糖，3.9% ;G2 -麦芽糖，6. 2% ;G3 -麦芽三糖，8. 1% ;G4 -麦芽四糖， 8.3%;65-麦芽五糖，8.8%;66-麦芽六糖，59.4%;67-麦芽七糖，5.3%。
[0030] 同时选取商业化淀粉酶BAN800作为对比试验，将上述蜡质玉米淀粉，配成8%的 悬浮液，用磷酸缓冲溶液将PH值调节到6,置于99°C超级恒温水浴锅中至完全糊化，之后将 完全糊化的淀粉糊冷却到70°C后添加 BAN800 a - amylase，淀粉酶添加量和后续检测分析 方法同上，结果见图4。
[0031] 产物分析发现商业化淀粉酶BAN800 (购自诺维信公司）水解产物较复杂，在3h生 长低聚糖较少，在12h才趋向稳定，其G6 -麦芽六糖产量明显低于本发明淀粉酶。
[0032] 实施例4.利用新型α -淀粉酶制备富含麦芽麦芽六糖糖浆
[0033] 利用新型α -淀粉酶制备富含麦芽麦芽六糖糖浆可以在现有的淀粉加工工艺过 程中实现。在配料罐内，把粉浆乳调到25 %?35 %淀粉悬浆，pH值用Na2CO3调到5. 0 -7. 0， 料液搅拌均匀后用泵把粉浆泵入喷射液化器，在喷射其中粉浆和蒸汽直接相遇进行糊化， 出料温度控制在110 - 115°C，从喷射器中出来的糊化料液降温至50°C，按IOOU/克干淀粉 的量加入淀粉酶AmyM，保温处理3小时。终点后，将料液喷射加热80°C灭酶。首先用过滤 机除渣过滤，再加入活性炭脱色半小时，进行脱色过滤，然后将糖液进行二次脱色，脱色后 进行离子交换。将离交后的糖液用五效降膜式蒸发器浓缩至产品要求。
[0034] 取样对制备的麦芽六糖糖浆进行产物分析，发现该糖浆麦芽六糖组分占总组分的 约53%，其他寡糖组分占总组分的约4%，其他组分约43%，说明该糖浆主要组分为麦芽六 糖，为富含麦芽六糖糖浆。
【权利要求】
1. 氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM在处理淀粉制备富含麦芽六糖 糖浆方面的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的糖浆组分组成为：麦芽四糖以上 低聚糖含量50%以上，麦芽三糖含量8-10%，麦芽糖含量低于6%，其他低聚糖含量低于 35%;所述的麦芽四糖以上低聚糖为4?7个单糖聚合形成的低聚糖；所述的其他低聚糖为 八个及以上单糖聚合形成的低聚糖。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的糖浆中七糖及以下低聚糖的组成 为：G1-葡萄糖3-5% ;G2-麦芽糖5-7% ;G3-麦芽三糖6-8% ;G4-麦芽四糖7-9% ;G5-麦 芽五糖8-10% ;G6-麦芽六糖55-60% ;G7-麦芽七糖约4-6%。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的淀粉来源于玉米、小麦、土豆。
5. 氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM酶解淀粉产物在制备运动饮料、 发酵饮料和/或啤酒发酵中的应用。
6. 氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM在面包烘培中的应用。
【文档编号】C12P19/02GK104404107SQ201410713567
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】崔中利, 李周坤, 黄彦 申请人:南京农业大学