一种耐高温淀粉酶的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种来源于地衣芽孢杆菌的耐高温淀粉酶，并通过构建黑曲霉工程菌高效表达所述淀粉酶，发酵酶活达1650U/mL。重组淀粉酶的最适作用pH为6.5，最适作用温度为55℃，为耐高温淀粉酶，可广泛用于食品添加剂领域，尤其是啤酒生产领域。
【专利说明】一种耐高温淀粉酶
[0001]【技术领域】
本发明属于微生物工程【技术领域】，具体涉及一种耐高温淀粉酶及其重组表达工程菌。【背景技术】
[0002]淀粉酶是指能水解淀粉、糖原和有关多糖中的O-葡萄糖键的酶类总称，根据作用的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。α -淀粉酶既可以作用于直链淀粉，也可作用于支链淀粉，无差别的切断α-1，4_链。因此其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面，在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6_键的α-极限糊精。β_淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1，
4-葡聚糖链。主要见于高等植物中，但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于像直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1，6_键的前面反应就停止了，因此，生产分子量比较大的极限糊精。
[0003]淀粉酶可广泛应用于麦芽糖、糖浆、糊精等的生产，在纺织工业中，淀粉酶可催化织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。在酒精生产和酿酒工业中使用霉菌淀粉酶能有效提高糖化率，酒精出率和酶母的生长。淀粉酶还可应用于出来淀粉生产过程中的废水，减轻对环境的污染。因此现在对淀粉酶的研究成为热点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提·供一种耐高温淀粉酶及其应用。本发明通过将来源于地衣芽孢杆菌Cfeci77w5.Iicheniformis)的淀粉酶基因转化入黑曲霉niger)中，构建得到了高效重组表达淀粉酶的工程菌株，为实现淀粉酶的规模化生产奠定基础。
[0005]本发明的一方面提供了一种淀粉酶，所述的淀粉酶为:
a)氨基酸序列为SEQID NO:1的淀粉酶；
b)在a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有I)中淀粉酶活性的酶。
[0006]本发明一方面提供了编码上述淀粉酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
[0007]本发明还涉及上述淀粉酶在啤酒生产领域的应用。
[0008]一种酶组合物,包含上述淀粉酶。
[0009]本发明通过将地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因导入黑曲霉宿主细胞中，构建了重组表达该基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表达淀粉酶，发酵酶活达1650U/mL。重组淀粉酶的最适作用PH为6.5，最适作用温度为55°C，为耐高温淀粉酶，可广泛用于食品添加剂领域，尤其是啤酒生产领域。利用本发明所述淀粉酶进行糊化，比传统的麦芽糊化方法更简单，原料液化效果好，麦汁组成合理，啤酒理化指标和口感质量都得到明显改善，尤其是麦汁得率大幅度提闻。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明所述淀粉酶作用PH-相对酶活曲线；
图2为本发明所述淀粉酶作用温度-相对酶活曲线。
【具体实施方式】
[0011]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0012]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
[0013]除非另作说明，核酸是按5,至3,方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。
[0014]如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。
[0015]术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。
[0016]如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0017]术语“核酸”包括DNA、RNA,单链或双链的，以及它们的化学修饰物。
[0018]术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。
[0019]术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭 载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。
[0020]术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
[0021]术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。
[0022]与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。[0023]由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0024]术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0026]实施例1淀粉酶基因的克隆
将地衣芽孢杆菌过夜培养，取1.5ml, 12000rpm离心I分钟，除上清；加入200 μ I裂解缓冲液(配方为:60mM Tris-HCl，pH7.8，20mM Na-Ac, ImM EDTA, 1.5% SDS)，用移液器剧烈吹打；加入66 μ I 5Μ高氯酸钠溶液混匀，12000rpm离心10分钟，取上清；加入等体积苯酹抽提一次，12000rpm离心2分钟,取上清；加入等体积异丙醇沉淀5分钟，12000rpm离心5分钟;70%乙醇洗涤两次；最后将干燥的DNA溶于ddH20。
[0027]以上述提取的基因组总DNA为模板，利用引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95°C4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
[0028]将回收的扩增产物连接到pMD18T载体，得到的克隆载体命名为pMDT_Amy，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，该扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。通过NCBI Blast比对分析发现，该序列与地衣芽孢杆菌的淀粉酶序列相似性最高，为77%。
·[0029]实施例2表达载体的构建
以质粒pMDT-Amy为模板，利用引物进行PCR扩增，PCR扩增条件是95°C 4min ；94°C30S ；55°C 40S,72°C 1.2min 30 个循环；72°C 7min。凝胶回收扩增产物；RI 和 Not I双酶切。对表达质粒PPIC9K也进行RI和Not I双酶切；用T4连接酶把上述双酶切产物4°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-Amyο
[0030]实施例3黑曲霉工程菌的构建
将表达质粒pPIC-Amy用Sal I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3 μ g/μ L浓度稀释质粒片段保存备用。制备黑曲霉GSl 15电转化感受态细胞，最后重悬于
ImL预冷的电泳缓冲液中(配方为:lmM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM蔗糖，pH 7.8)。在80μ L感受态细胞中加入5μ L线性化重组质粒；电转化(条件为1500V、200Q、25yF);最后涂布于丽平板(丽培养基组分:1.34%YNB, 4X 10-5%生物素，0.5%甲醇)，挑选一个重组菌% Aspergillus niger Amy-1。
[0031]实施例4发酵和酶学性质测定
将黑曲霉工程菌Amy-1接种于5ml BMGY (培养基配方为:1 %酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基(培养基配方为:I %酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，0.5%甲醇)，每12小时补加50 μ L甲醇，诱导培养5天，200rpm，离心5分钟，取发酵液上清液，进行酶学性质和耐受性分析。经测定发酵液上清的酶活为1650U/mL，说明本发明构建的黑曲霉工程菌能高效重组表达淀粉酶。
[0032]、最适pH分析
用 pH 值分别为 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的缓冲液进行稀释测定，在温度55°C条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，本发明所述淀粉酶的最适作用PH值为6.5，且在pH5.5-7.0范围内能保持80%以上的酶活性。
[0033]、最适温度分析
分别在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、7(TC，ρΗ5.5 的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明所述淀粉酶的最适作用温度为55°C，且在55-67°C范围内能保持70%以上的酶活性。
[0034]实施例5淀粉酶在啤酒生产中的应用
在啤酒生产工艺中，用本发明的耐高温淀粉酶替代麦芽，用于啤酒辅料液化，具体工艺过程如下:
1)在原料中加入0.5%耐高温淀粉酶进行糊化，具体条件:50°C IOs ；95°C 25s ； 100°C
IOs ；
2)然后进行糖化，具体条件:37°C20s ；50°C 60s ；68°C 60s ； ;78°C过滤，大米比例为30-40%，淀粉酶添加量为12U/g大米，糊化pH7.5，料水比6:1，平均糖化时间45min。
[0035]利用本发明所述淀粉酶进行糊化，比传统的麦芽糊化方法更简单，原料液化效果好，麦汁组成合理，啤酒理化指标和口感质量都得到明显改善，尤其是麦汁得率大幅度提闻。
【权利要求】
1.一种淀粉酶，其特征在于，所述的淀粉酶为: a)氨基酸序列为SEQID NO:1的淀粉酶； b)在a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有I)中淀粉酶活性的酶。
2.编码权利要求1所述淀粉酶的基因，其一种编码核苷酸序列为SEQID NO: 2。
3.权利要求1所述的淀粉酶在啤酒生产中的应用。
4.一种酶组合物，所·述的组合物包含有权利要求1所述的淀粉酶。
【文档编号】C12N9/28GK103849608SQ201310671003
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】李佩佩, 张慧丹, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司