一种来自真菌的低温α-淀粉酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供的来自真菌的低温α-淀粉酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ?ID?NO.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ?ID?NO.19的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明提供的编码基因是如下(1)或(2)的脱氧核糖核苷酸：(1)具有SEQ?ID?NO.17的所示核苷酸序列；(2)具有SEQ?ID?NO.18所示核苷酸序列。本发明提供的重组宿主细胞包括具有上述编码基因的重组表达载体。根据本发明的α-淀粉酶最适温度为40℃，比常温淀粉酶低10℃左右，且低温适应性好，在0～30℃仍保持最高活力20％以上，在洗涤剂和纺织退浆中有巨大的应用前景。
【专利说明】—种来自真菌的低温α-淀粉酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在低温下具有较好的活性的真菌α -淀粉酶，本发明还涉及该低温淀粉酶的编码基因与应用。
技术背景
[0002]Ct-淀粉酶(a-1,4-D-glucan-glucanhydrolase, EC3.2.1.1)属于内切型淀粉酶，是可对支链淀粉直链淀粉或其他-1，4-葡聚糖分子内部的-1，4-糖苷键以随机的方式进行水解，生成长度不等的直链和支链寡糖的一类酶的总称，是淀粉工业主要酶，在食品加工、洗漆剂、纺织退衆、造纸工业等领域具有重要商业价值。低温淀粉酶(cold-adaptedamylase)是指能在低温下有效发挥催化作用的淀粉酶，一般最适温度在35~45°C，除了以上所述应用外，还能用于低温环境生物修复，在工业应用中因其低能耗而具有广阔的前景。α -淀粉酶广泛存在于包括人、动物、植物、真菌和细菌等各种生物中，从1956年首次报道分离α-淀粉酶开始，目前已经分离并鉴定的超过120种α-淀粉酶，从数量上看微生物来源的ct -淀粉酶占大部分。微生物中能产生ct-淀粉酶的属有:Bacillus,Thermomonospor,Acinetobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus, Penicillus 等。目前在工业上大量使用的α -淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis),解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。
[0003]当前市场上应用的α-淀粉酶主要是由米曲霉发酵生产得到的中温真菌淀粉酶(TAKA-amyIase，真菌淀粉酶)和芽孢杆菌产生的高温细菌α -淀粉酶，虽然酶活力较高，但是最适温度较高(50V -90V )，且在较低温度(常温)活力很低，导致在洗涤剂和纺织退浆中需要加热处理，工艺繁琐且增加能耗；而低温淀粉酶因其结构柔韧性能有效克服该工艺中的缺陷，且因其热易变性可以在中温环境下即可破坏结构，降低污染。
[0004]国内外虽然筛选出一些新的低温α-淀粉酶生产菌，但普遍因低温菌生长较慢，表达活力很低，而限制了在工业上的应用。因此，如何筛选到既具有优良性质，又可以获得高表达活力的低温α-淀粉酶成为研究热点。早在1992年，Georges Feller等曾报道交替单胞菌(Alteromonas haloplanctis)能产低温α -淀粉酶(GeorgesFeller et al.1992.Purificat1n, Characterizat1n, and Nucleotide Sequence of theThermolabile a -Amylase from the Antarctic Psychrotroph Alteromonas haloplanctisA23.THE JOURNAL OF B1LOGICAL CHEMISTR.267 (8)):5217-5221.)，近年来，一系列来自于低温细菌的低温淀粉酶相继被筛选出来并在大肠杆菌中实现了异源表达。同时，不少南极产淀粉酶低温真菌被分离和鉴定出来，1997年，M.FenicediL等从南极维多利亚岛上分离到五株都具有淀粉酶活力的不同的G.pannorum var.pannorum,其中n0.1显示出了显著的活力，有产业化的应用前景(M.FeniceaL et al.1997.Product1n of extracellularenzymes by Antarctic fungal strains.Polar B1l, 17:275-280) ；2011 年，AbiramyKrishn等再次在南极岛上筛选到了数株低温下分泌淀粉酶的真菌，其主要菌属为Geomycespannorum(Abiramy Krishn et al.2011.Extracellular hydrolase enzyme product1n bysoil fungi from King George Island, Antarctica.Polar B1l, 34:1535 - 1542)。虽然对Geomyces pannorum具有可观的淀粉酶活性,但关于其淀粉酶基因序列和蛋白序列并无报道，且由于该菌培养条件限制，至今还没有分离纯化出该菌的淀粉酶，对其酶学性质尚未研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种来自真菌的低温α-淀粉酶及其编码基因。
[0006]本发明提供的来自真菌的低温α -淀粉酶，是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由SEQID N0.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID N0.19的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
[0007]该低温α -淀粉酶具有与SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少70%同源性的序列。更优选地，该低温α -淀粉酶具有与SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少80%同源性的序列。进一步优选地，该低温α -淀粉酶具有与SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少90%同源性的序列。最佳地，该低温α -淀粉酶具有与SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少99%同源性的序列。
[0008]本发明提供的低温α-淀粉酶的编码基因选自如下(1)-(4)的脱氧核糖核苷酸:(I)具有SEQ ID N0.17所示核苷酸序列；(2)具有SEQ ID N0.18所示核苷酸序列；(3)具有与所述(I)或(2)所示核苷酸序列至少70%同源性的序列；(4)该核苷酸序列不限于SEQ IDN0.17或SEQ ID N0.18所示序列，任何经过密码子优化后得到如SEQ ID N0.19所示氨基酸序列组成的蛋白质或其衍生的功能类似的蛋白质的核苷酸序列均落入本专利保护范围内。
[0009]该编码基因具有与SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少70%同源性的序列。更优选地，该编码基因具有与SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少80%同源性的序列。进一步优选地，该编码基因具有与SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少90%同源性的序列。最佳地，该编码基因具有与SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少99%同源性的序列。
[0010]本发明提供的重组表达载体包括上述编码基因。
[0011]所述重组表达载体为在曲霉表达载体PBC12FNH的多克隆位点间插入上述编码基因而得到的重组表达载体。
[0012]本发明提供的重组宿主细胞包括上述重组表达载体。
[0013]所述重组宿主细胞是将上述重组表达载体转入到米曲霉RIB40pyrF营养缺陷型菌株PFl (CGMCC NO:9129)中得到的重组宿主细胞。
[0014]本发明提供一种制备重组真菌低温α -淀粉酶的方法。
[0015]本发明所提供的制备重组真菌低温α -淀粉酶的方法，是低温(20°C )发酵培养上述含有低温α-淀粉酶编码基因的重组菌，得到低温α-淀粉酶。
[0016]本发明成功地公开了 Geomyces Pannorumα -淀粉酶基因和蛋白质氨基酸序列。根据本发明的低温α -淀粉酶最适温度40°C，且低温下酶活较高，适于工业上应用的要求。本发明得到的重组宿主细胞，低温下发酵培养，适于上述低温α-淀粉酶基因的表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1示出了表达载体PBC12FNHA2构建图；
[0018]图2示出了 GpA2在米曲霉RIB40-PF1-A2重组菌诱导表达和纯化的蛋白电泳图；
[0019]图3示出了 GpA2最适作用温度为40°C (ρΗ5.0的条件下测定)，且在O~40°C保持较高酶活力；
[0020]图4示出了 GpA2在40°C条件下稳定，在40°C条件下孵育30min，仍有65%残余酶活力，而在60°C下孵育5min基本失活；其中40°C ( )，50°C (.)，60°C ( ▲);
[0021]图5示出了 GpA2最适作用pH为5.0，在ρΗ3.0~6.0区间内(40°C的条件下测定)具有较高酶活力；
[0022]图6示出了 GpA2在ρΗ4.0~9.0的区间内30°C孵育30min后均具有较好的pH稳定性。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明保护的范围。
[0024]下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。如《分子克隆:实验室手册》(NewYork =Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中用到的缓冲液和培养基如下:
[0025](I)TE(100ml):
[0026]ZnSO4.7H200.35g, MnCl2.4H200.5g, H3BO30.03g, CoCl2.6H200.945g,CuCl2.2H200.01g, NiCl.6H200.12g, NaMoO4.2H200.18g，6M HCl 13ml，加去离子水定容至500mLo
[0027](2)磷酸钠缓冲液(100ml，ρΗ5.8):
[0028]Na2HPO4.12Η200.5788g, NaH2PO4.2Η202.8996g。
[0029](3)Tris-HCl 缓冲液(100ml, ρΗ7.5):
[0030]Tris0.6057g，用 HCl 调节 pH 至 7.5。
[0031](4)溶液 1:
[0032]NaCl0.7M，蔗糖1.0g,溶于50ml磷酸钠缓冲液中，定容(加水)至10ml。
[0033](5)溶液 II:
[0034]山梨醇22.3085g, CaCl20.578g, NaCl0.204如，溶于 2Oml Tr1-HCl 缓冲液中，定容(加水)至100ml。
[0035](6)溶液 II1:
[0036]PEG400030g, CaCl20.289g,溶于 10ml Tr1-HCl 缓冲液中，定容(加水)至 50ml。
[0037](7) CM 培养基(100ml):
[0038]NaNO30.6g, KC10.05g, KH2PO40.08g, K2HPO40.104g,葡萄糖 lg，MgSO40.052g,Peptone0.2g, Yeast extract0.lg,尿苷 0.1221g, TElOOul ;若配成斜面，则加入 1.5 ~2.0g
琼脂粉。
[0039](8) MM 培养基(100ml):
[0040]NaNO30.6g, KC10.05g, KH2PO40.08g, K2HPO40.104g,葡萄糖 lg，MgSO40.052g,TElOOul，蔗糖 20.54g。
[0041]琼脂粉:上层0.8g，下层1.2g。
[0042](9)发酵培养基(100ml):
[0043]糊精2g,鹿糖 0.3g, Peptone0.lg, Yeast extract0.5g, NaNO30.lg,MgSO4.7H200.05g, FeSO4.7H200.001g。
[0044]实施例1.低温α -淀粉酶基因的扩增
[0045]1.1菌株及其培养
[0046]从马来西亚大学生物科学学院课题合作项目中获赠Geomyces pannorumAK07KGI1001R1-2(1)(菌种鉴定 NCBI 登录号 JF720026.biramy Krishn et al.2011.Extracellular hydrolase enzyme product1n by soil fungi from King GeorgeIsland, Antarctica.Polar B1l, 34:1535 - 1542)。
[0047]用无菌水从培养10天的PDA斜面上洗下G.pannorum孢子,接种液体培养基,20°C培养7天收集菌丝体，用于基因组提取；用牙签接种淀粉固体培养基，20°C培养5天收集菌丝体，用于总RNA提取。
[0048]1.2基因组提取
[0049]参照Omega真菌基因组提取试剂盒说明书
[0050]1.3 总 RNA 提取
[0051 ] 按照Takara RNA提取试剂说明书进行操作。
[0052]1.4cDNA 第一链合成
[0053]以抽提的总mRNA为模板，用Takara试剂盒的方法获得cDNA第一链，PCR体系及步骤如下:
[0054]
OligadTIpL
dNTP MixtureIjaL
模板(总RNA)SuI
RNaseFreedH^O3 ItL
总体枳1pL
[0055]65°C保温5min，冰上迅速冷却，向上述反应管中加入
[0056]
5 X PrimeScripl II Buffer4ul
RNase inhibitor (40U/uDOJul
[0057]
PrimeScript II RTase (200U/ul)Iul
RNascFrcc dH1_4, Sxil
总体1?20ul
[0058]42°C 45min,95°C 5min，冰上冷却。
[0059]1.5Geomyces pannorum a -淀粉酶保守区域克隆
[0060]在NCBI上找到与Geomyces pannorum相近种属的菌种以及其它丝状真菌的α -淀粉酶氨基酸序列。在α-淀粉酶氨基酸保守区域TDRFARTDGS的位置设计正向兼并引物JGpfl，在氨基酸保守区域RGMYLMVD的位置设计反向兼并引物JGprl。其中:
[0061]JGpfl的序列为SEQ ID N0.1:ACNGA TMGTN TTGCR MGBAC (该引物由上海捷瑞生物工程有限公司生物工程公司合成，下同)
[0062]JGprl 的序列为 SEQ ID N0.2:ACNAY RTCRA CCATN ARRTA CAT
[0063]以Geomyces pannorum基因组为模板,用兼并引物JGpfl和JGprl,进行PCR扩增α -淀粉酶保守区域，PCR体系为:
[0064]
【权利要求】
1.一种来自真菌的低温α -淀粉酶，是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID N0.19的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.一种根据权利要求1所述的低温α-淀粉酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是如下⑴或⑵的脱氧核糖核苷酸: (1)具有SEQID N0.17所示核苷酸序列； (2)具有SEQID N0.18所示核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体包括根据权利要求2或3所述的编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pBC-Hygro为原始质粒。
6.一种重组宿主细胞，其特征在于，该重组宿主细胞包括根据权利要求4所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞是将根据权利要求4所述的重组表达载体转入到米曲霉的尿嘧啶营养缺陷型菌株中得到的重组宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞是将根据权利要求4所述的重组表达载体转入到保藏号为CGMCC NO:9129的米曲霉的尿嘧啶营养缺陷型菌株RIB40-PF1中得到的重组宿主细胞。
【文档编号】C12N1/15GK104178471SQ201410261362
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】高蓓, 魏东芝, 毛佑志 申请人:华东理工大学