一种来源于绿色巴夫藻的delta9延伸酶新基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请属于基因克隆分离的技术领域，尤其设及于一种来源于微藻的有关多不饱 和脂肪酸合成的延伸酶基因及其分离方法。
【背景技术】
[0002] 多不饱和脂肪酸是人体必需的重要的营养物质，微藻因富含多不饱和脂肪酸而成 为重要的生物资源。绿色己夫藻（Pavlovaviridis)含有丰富的多不饱和脂肪酸，是进行 多不饱和脂肪酸相关合成基因识别与克隆的良好实验材料。
[0003]RACE全称rapid-amplificationofcDNAends,是一种常用的通过PCR进行cDNA 末端快速克隆的技术。本实验采用RACE技术来获得目的mRNA片段的全长序列。
[0004] 在微藻的多不饱和脂肪酸的体内合成途径中，起到最关键作用的是多不饱和脂肪 酸去饱和酶和多不饱和脂肪酸延伸酶两大酶类。但由于其为与内质网结合的膜蛋白，上述 酶类在分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta9延伸酶是催化亚麻酸（C18 :3n-3)生 成化rA(C20: 3n-3)的关键酶，后者可进一步被deltas去饱和酶催化生成二十碳四締酸， 该途径区别于常见的deltas途径，存在于某些微藻中，是EPA和DHA生物合成途径的重要 补充。其中，delta9延伸是该途径的限速步骤。目前在微藻中已经有数个来自于不同物种 的delta9延伸酶获得了分离和识别，但不同物种的同源酶显然都存在序列上和结构上的 差异，进而导致其酶活性和功能的不同。因此，从绿色己夫藻中分离得到其delta9延伸酶 的同源酶是对该部分研究资源的很好补充，本申请就试图从运个角度展开相关的工作。
【发明内容】
阳0化]绿色己夫藻（化Woks.Kiri扣6·)为常用微藻，购自中国科学院青岛海洋研究 所。
[0006] 绿色己夫藻delta9延伸酶基因的分离过程为： (1) 利用本领域常规的mRNA提取分离手段获得绿色己夫藻的总mRNA,并使用引物 OligodTW本领域常规手段将之反转录为cDNA; (2) 使用cDNA作为模板，根据delta9延伸酶同源基因的保守性设计引物P9F、P9R来 进行保守区基因的扩增，其引物序列为：P9F: 5' -GCCACCTACAGTTTGTCCGCGA-3' ;P9R: 5，-GGTGATGTCCGCTTCATCGAGA-3' ；PCR反应条件为：94乂 3min;94°C30S,60乂 30S, 72乂 1min, 30个循环；72°C10min;所获PCR产物大小约为360bp; (3) 3'末端的扩增反应WcDNA为模板、使用SMARTRACEcDNA扩增试剂 盒来进行，使用的扩增引物分别是：UPM(10Xuniversalprimermix) ;elo9-3 CTAACTACGGCGCGACGGCA。梯度PCR反应程序为：94乂 3min; 94°C30s, 72°C3min, 5 个循环；94°C30s, 70T30s, 72T3min, 5个循环；94°C30s，68°C30s，72°C3min， 30个循环；72°C10min。所获PCR产物大小约为420bp. (4) 5'末端的扩增反应使用总mRNA为模板并使用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒来进 行，使用的引物分别为：UPM5,（lOXuniversalprimermix);GSPlCAAGTTCTAGGCGTCCT;GSP2 GTAACCCGTGAGCTCGC。反应程序为：加入GSPl于mRNA中后W94乂 3min; 94°C30s, 6(TC30s，72°C1min反应1个循环；随后加入TdT于37oC反应30min获得特定末端产物； 然后向体系中加入UPM5'和GSP2，W如下程序完成反应：94°C3min; 94乂 30S，72°C3 min, 5 个循环；94。0 30s, 70T30s, 72。0 3min, 5 个循环；94。0 30s，68乂 30s，72°C 3min，30个循环；72°C10min。所获目的片段约为59化P。
[0007] W上所有的片段均连入PMD18T载体后进行测序后拼接。
[0008] (5)开放阅读框的扩增：在经过拼接获得了表达基因的全长之后，分别设计上下 游引物ATGGCGACCGAAGGGATGC和CTACTCGGTTTTCATTAAAG，经PCR扩增获得完整的delta9 延 伸酶开放阅读框片段。PCR反应条件为：94°C3min;94°C30S，58乂 30S，72°C1min, 30个循环；72°C10min;片段大小为81化p。
[0009] 最终所得来自绿色己夫藻的推定的多不饱和脂肪酸delta9延伸酶的全长多核巧 酸序列如SEQIDNO. 1所示。该基因所编码的氨基酸序列与来自于化vlovasalina的 delta9延伸酶的活性区域具有较高的序列相似性巧日图1所示)，并经过在毕赤酵母中的 异源表达功能验证，证实其为一种多不饱和脂肪酸delta9延伸酶。
[0010] 本申请首次从绿色己夫藻的基因组中分离获得了多不饱和脂肪酸delta9延伸酶 基因，丰富了该类酶的重要的基因资源，为进一步研究该酶的体内和体外的作用机制奠定 了基础。
【附图说明】
[0011] 图 1 沈QIDNo. 1与来自化vlovasalina的delta9延伸酶基因的比对结果【具体实施方式】
[0012] 绿色己夫藻delta9延伸酶基因的分离过程为： (1) 利用本领域常规的mRNA提取分离手段获得绿色己夫藻的总mRNA，并使用引物 OligodTW本领域常规手段将之反转录为cDNA; (2) 使用cDNA作为模板，根据delta9延伸酶同源基因的保守性设计引物P9F、P9R来 进行保守区基因的扩增，其引物序列为：P9F: 5' -GCCACCTACAGTTTGTCCGCGA-3' ;P9R: 5，-GGTGATGTCCGCTTCATCGAGA-3' ；PCR反应条件为：94乂 3min;94°C30S,60乂 30S, 72乂 1min, 30个循环；72°C10min;所获PCR产物大小约为360bp; (3) 3'末端的扩增反应WcDNA为模板、使用SMARTRACEcDNA扩增试剂 盒来进行，使用的扩增引物分别是：UPM(10Xuniversalprimermix) ;elo9-3 CTAACTACGGCGCGACGGCA。梯度PCR反应程序为：94乂 3min; 94°C30s, 72°C3min, 5 个循环；94°C30s, 70T30s, 72T3min, 5个循环；94°C30s，68°C30s，72°C3min， 30个循环；72°C10min。所获PCR产物大小约为420bp. (4) 5'末端的扩增反应使用总mRNA为模板并使用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒来进 行，使用的引物分别为：UPM5,（lOXuniversalprimermix);GSP1CAAGTTCTAGGCGTCCT; GSP2 GTAACCCGTGAGCTCGC。反应程序为：加入GSPl于mRNA中后W94乂 3min; 94°C30s, 60乂 30s，72°C1min反应1个循环；随后加入TdT于37oC反应30min获得特定末端产物； 然后向体系中加入UPM5'和GSP2，W如下程序完成反应：94°C3min; 94乂 30S，72°C3 min, 5 个循环；94。0 30s, 70T30s, 72。0 3min, 5 个循环；94。0 30s，68乂 30s，72°C 3min，30个循环；72°C10min。所获目的片段约为59化P。
[001引 W上所有的片段均连入PMD18T载体后进行测序后拼接。
[0014] (5)开放阅读框的扩增：在经过拼接获得了表达基因的全长之后，分别设计上下 游引物ATGGCGACCGAAGGGATGC和CTACTCGGTTTTCATTAAAG，经PCR扩增获得完整的delta9 延 伸酶开放阅读框片段。PCR反应条件为：94°C3min;94°C30S，58乂 30S，72°C1min, 30个循环；72°C10min;片段大小为81化p。
[0015] (6)delta9延伸酶功能的验证 获得表达基因片段之后，随后通过本领域常用的亚克隆手段将该片段连接到载体PPIC3. 5k，得到毕赤酵母表达质粒PPIC3.化-delta-9,随后将该质粒与空载体分别电转 化入毕赤酵母中得到GS115-9和GS115-PPIC3. 5K。挑取阳性转化子接种到装有5mlBMGY液 体培养基的试管中，29oC，ISOrpm摇床培养过夜。然后吸取500μ1过夜培养的菌液接种 至50mlBMGY液体培养基的Ξ角瓶中，正常条件培养至0D600达到4-6。离屯、收集菌体，稀 释4-6倍将菌体转移至BMMY液体培养基中，使初始的菌密度值达到1.0。向培养基中加入 终浓度为0. 5%的甲醇100μΜ的底物亚麻酸开始诱导。要每隔半天添加甲醇维持0. 5%的 诱导浓度。培养9化后离屯、收集菌体，超声法提取脂肪酸并进行甲醋化，气相色谱分析脂肪 酸组成变化。脂肪酸变化的结果如表1所示。通过表1的结果可W看出，重组菌具备了将 亚麻酸合成二十碳Ξ締酸（η3族）的能力，表明我们所克隆得到的基因为一种新的脂肪酸 delta9延伸酶的编码基因。
[0016] 表1重组毕赤酵母的长链脂肪酸组成（数值为含量百分比）
ND表示测量不到 W上所述BMGY培养基的组成为1%酵母粉，2%蛋白腺，1%甘油，外加十分之一体积的 13. 4%YNB，4*10 5%生物素W及1/10体积的抑6. 0的憐酸盐缓冲液。 阳017] W上所述BMMY培养基的组成为1%酵母粉，2%蛋白腺，外加十分之一体积的 13. 4%YNB，4*10 5%生物素W及1/10体积的抑6. 0的憐酸盐缓冲液。
[0018] 说明书氨基酸和核巧酸序列表 沈QIDNO. 1: CKirii/is的多不饱和脂肪酸delta9延伸酶的基因序列
【主权项】
1. 一种从微藻中克隆得到脂肪酸延伸酶基因的方法，其特征在于，首先分离得到微藻 的mRNA并反转录为CDNA，随后以之为模板，根据延伸酶基因保守序列设计简并引物从而扩 增得到保守区基因；接下来分别对其5'末端和3'末端进行末端扩增获得全基因序列后，通 过普通PCR的方法获得表达基因。2. -种来自于绿色巴夫藻的delta9延伸酶基因的开放阅读框序列，其特征在于，其序 列如SEQID.No. 1所示。
【专利摘要】多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，是人体必需的重要营养物质。针对于能够自然合成大量多不饱和脂肪酸的一种微藻-绿色巴夫藻(<i>Pavlova？viridis</i>)，本申请使用了保守区序列扩增和RACE相结合的方法克隆获得了一种新的delta9延伸酶的基因。该基因的获得为进一步认识和利用极有现实意义的EPA和DHA的生物合成过程提供了依据。
【IPC分类】C12N15/10, C12N15/54
【公开号】CN105255913
【申请号】CN201510797614
【发明人】徐毅
【申请人】徐毅
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月18日