一种识别溶酶体内硫化氢的荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种识别硫化氢（H2S)荧光探针及其应用，尤其涉及一种在溶酶体中 专一识别H2S的咔唑类化合物荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。
【背景技术】
[0002] 硫化氢（H2S)在各种生理过程中发挥重要作用，H2S水平异常与许多类型的疾病如 阿尔茨海默氏症、肝硬化、唐氏综合症和糖尿病相关联。近来，H2S已证实是学术界继一氧化 碳（C0)和一氧化氮（N0)第三类与人类重大疾病相关的活性小分子。基于此，对H2S的检 测也引起人们的高度重视。另外，溶酶体是细胞内酸性细胞器，pH范围4. 5-5. 5之间，溶酶 体也是与癌症等相关疾病相关的重要细胞器。
[0003] 目前，H2S的检测手段主要分为两类：直接法和间接法。直接法是一类直接利用H2S 自身物理、化学性质对其进行分析检测的方法，包括原子吸收、发射光谱法和离子选择性电 极法；间接法是一类利用H2S和指示剂（也可称为化学分子探针）之间的特异性化学反应 或超分子作用产生的信号变化对H2S进行分析检测的方法，包括传统的H2S指示剂和近年来 研究较热的H2S荧光分子探针。但是，综合分析目前的H2S荧光探针主要存在以下不足：第 一，对于酸性区域内H2S的检测依然很少，由于酸性细胞器造成H2S的动态变化，对酸性细胞 器尤其是溶酶体内H2S的检测概率大大降低；第二，H2S探针的选择性不高，尤其是在细胞内 受到环境的干扰较大，尤其是酸性环境的干扰；基于此，开发新型在溶酶体中专一识别硫化 氢（H2S)的荧光探针，并给出检测曲线判断H2S水平，有着重要的实际应用价值。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种识别溶酶体内H2S的荧光 探针及其应用。
[0005] 本发明所述识别溶酶体内硫化氢的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针命名为 2-(9-(2-乙氧基乙脂）-2-(吡啶-4-基）乙烯基）-9H-咔唑-3-基）乙烯）-1_乙基-3, 3-二 甲基-3氢-吲哚-1-碘，简称PCAI，其化学结构式如式⑴所示：
[0006]
:〇
[0007] 上述2-(9-(2_乙氧基乙脂）-2_(吡啶-4-基）乙烯基）-9H_咔唑-3-基）乙 稀）_1_乙基_3, 3_二甲基_3氛-H引噪-1-鹏（简称PCAI)制备方法是：
[0008] 将咔唑醛1与吲哚盐2以乙醇做溶剂，在氮气保护下回流反应。反应结束后，旋转 蒸发出部分乙醇，后倒入乙醚中得到红色固体，用乙醚洗涤3-4次。过滤得到红色粉末即为 PCAI〇
[0009] 上述PCAI的制备反应式如下：
[0010]
[0011] 本发明所述识别溶酶体内硫化氢的荧光探针在检测溶酶体中H2s的应用。
[0012] 上述的应用中：所述荧光探针是以荧光增强的方式实现对溶酶体中H2S的识别。
[0013] 本发明的荧光探针PCAI是在酸性条件下以荧光增强的方式来证明该探针在pH 4-5的范围内有响应，符合细胞内溶酶体的环境；进一步的，体外测试证明该探针在激发波 长为488nm下，在酸性环境pH 4-5有荧光增强的趋势，在405nm激发下，H2S存在条件下，该 探针荧光增强，显示本发明所述探针对H2S有选择性识别。
[0014] 相关实验证实：检测环境是水相时，本发明所述的荧光探针PCAI在溶酶体酸性范 围内荧光增强明显，而在中性范围内荧光淬灭，证明该探针可能是溶酶体探针（图1)。在 H2S选择性方面（图2)，离子量为探针的1倍，当用405nm光激发，只有H2S发生7倍的增 强；在H2S滴定实验中（图3)，在H2S加入量ncu= 0~20当量PCAI的条件下，荧光逐渐 增强，加入1当量的铜离子时，荧光增强到7倍并趋于稳定。推定，该探针为H2S荧光增强 性探针。在探针的稳定性实验中，一小时内，在405nm氙灯连续照射一小时，探针荧光强度 趋于平衡（图4)，没发生荧光淬灭，表明该探针具有优异的光学稳定性。在生物成像应用方 面，通过细胞成像也进一步证明了该探针可识别活细胞溶酶体中的H2S(图5)。
[0015] 基于上述实验结果，可以证明本发明所述的识别溶酶体内硫化氢的荧光探针是一 类新型的高选择性荧光探针分子，在488nm激发下，探针通过酸性质子与探针的吡啶作用 使探针本身荧光峰位发生红移，荧光随之增强；当405nm激发下，H2S与探针双键发生1，4加 成，从而达到识别H2S的目的。其识别反应产物如（II)所示：
[0016]
[0017] 本发明提供的识别溶酶体内的H2S的咔唑类化合物荧光探针与其功能相近的普通 H2S荧光探针相比具有显著优势，且本发明所述咔唑类化合物在细胞内活性小分子的定位 和合成手段也具有新颖性和简便性。本发明的荧光探针通过荧光增强不仅能识别溶酶体， 而且能识别溶酶体内H2S，该探针及其研究为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在活 细胞内的溶酶体中靶标分子的生物标记领域具有潜在的应用价值。
【附图说明】
[0018] 图1:探针的酸性变化。激发波长488nm〇
[0019] 图2 :探针对H2S的选择性。
[0020]其中：激发波长为405nm;探针母液的浓度：103M，选择性离子的浓度为4. 5x10 5M。序号1~13,分别是1?空白（PCAI) ;2.Cl;3.GSH ;4. H 202;5. Hey ;6. HS03;7.I; 8.Mg2+；9. N02；10. S 2032；11.S032 ；12.SO 42；13.Zn2+〇
[0021] 取10yL探针母液稀释5ml进行，后取2mL的上述稀释液，加入40当量的各种离 子进行光谱测试。
[0022] 图3 :H2S的滴定图
[0023] 横坐标：荧光强度，纵坐标：波长。
[0024]H2S的滴定实验；其中激发波长为405nm;探针母液的浓度：10 3M，取10yL探针母 液稀释5ml进行，后取2mL的上述稀释液，加入不同量的H2S滴定。
[0025] 图4:探针加入H2S后的动力学变化图
[0026] 横坐标：相对荧光强度，纵坐标：时间。
[0027] 其中激发波长为405nm ;探针的浓度：103M ;时间3600s。
[0028] 图5 :探针的生物成像照片。
[0029] 其中：(a)商品化溶酶体绿成像；(b)PCAI成像图；(c)图（a)与图（b)的复合图； ⑷共定位图像；(e)外加H2S的荧光图片。
[0030] 溶酶体检测：激发波段：488nm，发射波段：600-700nm;H2S成像：激发波段： 405nm,发射波段：425-475nm。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1
[0032] 2-(9-(2-乙氧基乙脂）-2-(吡啶-4-基）乙烯基）-9氢-咔唑-3-基）乙烯）-1_乙 基-3, 3-二甲基-3氢-吲哚-1-碘（PCAI)的合成：
[0033] 将0. 37g(lmmol)化合物9-(2_乙氧基乙脂）-6-(2-(吡啶-4-基）乙烯基）-9 氢-咔唑-3-醛（l)〇. 32g(l.lmmol)化合物1-乙基-2,3,3-三甲基-3氢-吲哚-1-碘盐 (2)，溶于20mL乙醇中。在氮气保护下回流反应。反应结束后，旋转蒸发出部分乙醇，后倒入 20mL乙醚中得到红色固体，用乙醚洗涤3-4次。过滤得到红色粉末即为PCAI。产率：90%。
[0034] :HNMR(40 0MHz,CDC13) 89.76(s,lH),9.40(s,lH),8.35(dd,J= 10. 1, 5. 4Hz, 3H) , 8. 11 (d,J= 15. 6Hz, 1H) , 7. 90 (d,J = 8. 3Hz, 1H) , 7. 78 - 7. 61 (m, 4H), 7. 60 - 7. 51 (m, 4H), 7. 49 (d,J= 7. 5Hz, 1H), 7. 43 (d, J= 8. 5Hz, 1H), 5. 13 (d,J =7. 1Hz, 2H), 4. 51 (t, J= 5. 3Hz, 2H), 3. 85 (t,J= 5. 4Hz, 2H), 3. 42 (q,J= 7. 0Hz, 2H), 1. 88 (s, 5H)，1. 70 (t,J= 7. 1Hz, 3H)，1. 08 (t,J= 7. 0Hz, 3H)。
[0035] 实施例2
[0036] PCAI的对酸的性环境的响应：
[0037] 预先准备1份10mL的10 3M本发明的探针N，N_二甲基甲酰胺溶液，然后分别取 10yL加入六个相同的5mL容量瓶中，用不同pH(pH4. 53~pH7. 93)的溶液稀释到5mL，然 后进行荧光检测（AEx= 488nm)，结果见图1。
[0038] 结论：表明该探针在溶酶体酸性范围内响应。
[0039] 实施例3
[0040] PCAI对H2S的选择性：
[0041] 其中：激发波长为405nm;探针母液的浓度：103M，选择性离子的浓度为 4. 5x10 5M。取10yL探针母液稀释5ml进行，后取2mL的上述稀释液，加入40当量的各种 离子进行光谱测试。
[0042] 序号 1 ~13,分别是 1?空白（PCAI) ;2.Cl;3.GSH;4.H202;5.Hey;6.HS03 ;7.I; 8.Mg2+;9.N02 ;10.S2032 ;11.S0 32 ;12.S0 42;13.Zn2+。（见图 2)。
[0043] 结论：测试结果表明，探针PCAI对H2S具有高选择性。加入H2S后，探针响应倍数 为7倍左右。
[0044] 实施例4
[0045] H2S的滴定：
[0046] 配制45mL浓度为1x105MH2S的水溶液及本发明的探针母液（浓度为10 3M)作为 备用。
[0047]将H2S浓度从0当量滴定到1当量并进行荧光检测（AEx= 405nm，入Eni= 530nm)， 计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与H2S浓度标准曲线（见图3)。
[0048] 结论：随着H2S的加入，探针的荧光强度趋于上升至平衡的趋势。
[0049] 实施例5
[0050] 动力学实验：
[0051] 本发明的探针母液的浓度：10 3M，探针稀释5ml进行测试，取2mL加入20当量的 H2S溶液，然后用405nm氙灯连续照射3600s，建立荧光强度与时间的曲线（见图4)。
[0052] 结论：探针本身具有很尚的稳定性。
[0053] 实施例6
[0054] 生物成像：
[0055] 活细胞染色实验：将本发明的探针PCAI配成ImMDMS0母液，染色时用lmL培养基 稀释。准备商品化的溶酶体绿（XEx= 457nm,XEm= 504nm)。
[0056] 将接种好的正值对数生长期的实验细胞加入常规浓度的探针PCAI分子溶液， 37°C孵育30min，用PBS洗3-5次，将贴壁生长的细胞常规制片；用激光扫描共聚焦显微镜 进行观察和荧光成像。溶酶体检测：激发波段：488nm，发射波段：600-700nm;H2S成像：激发 波段：405nm，发射波段：425-475nm。（结果见图5)。其中：(a)商品化溶酶体绿成像；(b) PCAI成像图；（c)图（a)与图（b)的共定位复合图；（d)共定位图；（e)外加H2S后成像图。
【主权项】
1. 一种识别溶酶体内H2S的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针命名为2-(9-(2-乙 氧基乙脂）-2-(吡啶-4-基）乙烯基）-9H-咔唑-3-基）乙烯）-1-乙基-3, 3-二甲基-3 氢-吲哚-1-碘，简称PCAI，其化学结构式如式（I)所示：2. 权利要求1所述识别溶酶体内H2S的荧光探针在检测溶酶体中H2S的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述荧光探针是以荧光增强的方式实现对 溶酶体中H2S的识别。
【专利摘要】本发明公开了一种识别溶酶体内硫化氢的荧光探针，其为2-(9-(2-乙氧基乙脂)-2-(吡啶-4-基)乙烯基)-9H-咔唑-3-基)乙烯)-1-乙基-3,3-二甲基-3氢-吲哚-1-碘，简称PCAI，其化学结构式如式(I)所示。本发明还公开了所述荧光探针在检测溶酶体中H2S的应用。实验证明：本发明的荧光探针通过荧光增强不仅能识别溶酶体，而且能识别溶酶体内H2S，该探针在活细胞的酸性区域的靶标分子的标记领域具有潜在的应用价值。
【IPC分类】C07D401/14, C09K11/06, G01N21/64
【公开号】CN105038763
【申请号】CN201510305957
【发明人】林伟英, 刘勇, 孟芳芳, 石起慢
【申请人】济南大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月4日