一种双酶敏感型荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及化学分析，生物分析，临床医学检测领域，属于有机小分子巧光探针技 术领域。
【背景技术】
[0002] 基质金属蛋白酶是一类细胞外基质组分的蛋白酶，在疾病的病理损害中扮演重要 作用。基质金属蛋白酶的表达和活性受到诸如细胞因子、激素等的严格调控，并且受到其天 然抑制剂的抑制，基质金属蛋白酶的过度表达会引起诸如肿瘤入侵和转移等疾病，因此，对 于基质金属蛋白酶的检测及其活性鉴别有利于对早期肿瘤等疾病的诊断和检测。
[0003] 调亡酶是一种半脱氨酸水解酶，在启动和执行细胞调亡信号过程中扮演重要角 色。调亡酶在细胞内W非活性的形式存在，当遇到调亡刺激信号W后，通过细胞内的蛋白水 解作用实现其向具有生理活性的结构转变，从而调控细胞程序死亡。与此同时，大部分的肿 瘤治疗药物都具有调亡相关的机制，因此，调亡酶的检测有利于早期肿瘤治疗效果的评价、 推进和优化肿瘤治疗方案。
[0004] 能量共振转移是激发态的给体巧光基团通过偶极作用，W非福射过程将能量传递 给邻近的受体巧光基团，转化为其他能量，当不W巧光发射的方式释放能量时，巧光泽灭。 但当巧光基团之间的距离超过能量共振转移的范围（10 A~lOoA)时，能量共振转移现象消 失，从而恢复激发态给体回到基态时发射的巧光。正由于该种能量共振转移距离敏感的特 性，被广泛应用于生物大分子、动态过程等的监测。
[0005] 多肤是一类生物相容性良好的具有特定生物活性的物质，通过一定氨基酸按照一 定的序列组成的结构可W被相关的酶特异性的识别和切断，被广泛运用到生物分子的检 巧。、疾病的诊断W及药物的运输。采用多肤固相合成技术，可W实现对目标分子的有效合成 及分离，并且，多样化的氨基保护可W实现对多肤的多功能化修饰，从而满足不同的检测和 分析等需求。
[0006] 目前，针对调亡酶或者基质金属蛋白酶的巧光探针被广泛设计和利用。但常用的 巧光探针都只针对某一种酶而设计，由于生物体系复杂性对特异性酶检测的干扰，酶对特 异性多肤序列的识别能力有限，W及现阶段对肿瘤诊断及治疗效果评价为一体的多功能巧 光探针的需求，针对双酶敏感而设计的巧光探针具有重大的应用价值，并且，双能量共振转 移巧光泽灭过程可W实现对巧光分子巧光的有效泽灭，从而提高探针的信噪比，能极大地 增大巧光探针的特异性检测能力和应用范围。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测基质金属蛋白酶和调亡酶的 巧光探针及其合成方法和应用。
[000引本发明提供的检测基质金属蛋白酶和调亡酶的巧光探针，即双酶敏感型巧光探 针，包含调亡酶特异性识别多肤序列、基质金属蛋白酶特异性识别多肤序列和两对能量共 振转移的分子巧光对。
[0009] 所述的两对能量共振转移分子巧光对的给体为同一给体。
[0010] 所述的分子巧光对是W巧光素为同一给体和W不同二甲氨基偶氮苯为受体的巧 光泽灭分子巧光对。
[0011] 所述的调亡酶特异性识别多肤序列为包含氨基酸-氨基酸-氨基酸-天冬氨酸的 多肤序列；所述的基质金属蛋白酶特异性识别多肤序列为脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-鄉氨 酸-精氨酸、脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、脯氨酸-亮氨酸-甘氨 酸-半脱氨酸-丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-鄉氨酸-鄉氨酸-甘 氨酸-谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酷胺中的一种。
[0012] 所述的包含氨基酸-氨基酸-氨基酸-天冬氨酸的多肤序列为天冬氨酸-谷氨 酸-鄉氨酸-天冬氨酸或色氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸。
[0013] 进一步地，所述的双酶敏感型巧光探针优选为，化学名为二甲氨基偶氮苯-甘氨 酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-鄉氨酸-精氨酸-甘氨酸-赖氨酸（巧光素）-丝氨酸-天 冬氨酸-谷氨酸-鄉氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-二甲氨基偶氮苯，化学结构如式 (I)所示：
[0014]
【主权项】
1. 一种双酶敏感型荧光探针，其特征在于：包含凋亡酶特异性识别多肽序列、基质金 属蛋白酶特异性识别多肽序列和两对能量共振转移的分子荧光对。
2. 根据权利要求1所述的双酶敏感型荧光探针，其特征在于：所述的两对能量共振转 移分子荧光对的给体为同一给体。
3. 根据权利要求2所述的双酶敏感型荧光探针，其特征在于：所述的分子荧光对是以 荧光素为同一给体和以不同二甲氨基偶氮苯为受体的荧光淬灭分子荧光对。
4. 根据权利要求1或3所述的双酶敏感型荧光探针，其特征在于：所述的凋亡酶特异 性识别多肽序列为包含氨基酸-氨基酸-氨基酸-天冬氨酸的多肽序列；所述的基质金属 蛋白酶特异性识别多肽序列为脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸、脯氨酸-亮氨 酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘 氨酸、甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸-甘 氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺中的一种。
5. 根据权利要求4所述的双酶敏感型荧光探针，其特征在于：所述的包含氨基酸-氨 基酸-氨基酸-天冬氨酸的多肽序列为天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸或色氨酸-谷 氨酸-组氨酸-天冬氨酸。
6. 根据权利要求5所述的双酶敏感型荧光探针，其特征在于：化学名为二甲氨基偶氮 苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-赖氨酸（荧光素）-丝 氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸-二甲氨基偶氮苯，化学 结构如式（I )所示：
7. -种权利要求6所述的双酶敏感型荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步 骤： (A)合成二甲氨基偶氮苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘 氨酸、荧光素-赖氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨 酸-二甲氨基偶氮苯； (B)将二甲氨基偶氮苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨 酸与荧光素-赖氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨 酸-二甲氨基偶氮苯进行缩合，即得到式（I )所示的检测基质金属蛋白酶和凋亡酶的荧 光探针。
8. 根据权利要求7所述的双酶敏感型荧光探针的制备方法，其特征在于： 所述的步骤（A)中，二甲氨基偶氮苯-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精 氨酸-甘氨酸和荧光素-赖氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨 酸-赖氨酸-二甲氨基偶氮苯的合成采用多肽固相合成方法； 所述的步骤（B)采用固相片段缩合的方法。
9. 根据权利要求8所述的双酶敏感型荧光探针的制备方法，其特征在于：多肽固相合 成中采用的树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂、Rink Amide树脂、MBHA树脂中的一种。
10. 权利要求1-6任一项所述的双酶敏感型荧光探针在化学体系、生物体系中基质金 属蛋白酶和凋亡酶活性检测及凋亡酶抑制剂和基质金属蛋白酶抑制剂的筛选中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种双酶敏感型荧光探针，即能同时检测基质金属蛋白酶和凋亡酶的荧光探针，该双酶敏感型检测荧光探针包含凋亡酶特异性识别多肽序列和基质金属蛋白酶特异性识别多肽序列以及两对能量共振转移的分子荧光对。该荧光探针可以在基质金属蛋白酶和凋亡酶同时存在的条件下，选择性地与其中一种酶作用，即特异性识别相应的多肽序列并将其切断，使淬灭的荧光得到恢复，从而实现对两种酶的检测；可实现对基质金属蛋白酶和凋亡酶共存的复杂微环境体系的快速非侵入性检测，选择性好，灵敏度高，对于肿瘤的早期检测和治疗效果的评价具有重要意义和广阔的应用前景。
【IPC分类】C12Q1-37, C09K11-06, C12Q1-34, C07K7-02
【公开号】CN104672300
【申请号】CN201510117147
【发明人】张先正, 李仕颖, 刘理涵, 曾旋
【申请人】武汉大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月17日