一种基于脂肪酶与p450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程与能源技术领域中脂肪烯烃的生物制备方法，具体说是一种基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法。
【背景技术】
[0002]随着石油等传统化石能源的不断消耗，能源安全战略及环境保护等问题的日益突出，世界各国都在积极尝试以可再生生物资源为原料生产生物燃料和化学品。以短链醇、月旨肪酸甲酯(乙酯)、脂肪烃(包括烯烃和烷烃)等为代表的传统和新型先进生物液体燃料，正吸引着越来越多的关注。在生物燃料方面，燃料乙醇和以脂肪酸甲酯(乙酯)为代表的第一代生物柴油的开发相对成熟，但均存在各自的不足。燃料乙醇作为汽油的替代品，存在水溶性高，挥发性强，能量密度低等缺点。与短链醇燃料(如乙醇)和第一代生物柴油脂肪酸甲醋(乙醋)相比，作为先进生物燃料(Advanced b1fuels)的脂肪径结构和性质更接近于石化柴油，具有能量密度高，吸湿性低，燃烧效率高等优越特性，可以作为汽油、柴油及航空燃料的替代品或添加剂。因此，脂肪烃催化合成途径研宄成为先进生物燃料研宄领域一大热点。
[0003]目前脂肪烃的制备主要依赖于高温(250-450°C)高压(20_70bar)条件下铂钯等贵金属催化剂介导的氢化化学工艺。与传统的化工工艺相比，生物催化与合成具有高效，能耗低，环保等优点。截至目前，已陆续报导一些脂肪烃生物合成途径:
[0004](I) 2010年，美国LS9生物能源公司的Schirmer等鉴定了蓝细菌Synechococcuselongates PCC 7942的脂酰-ACP还原酶和脂肪醛脱羰基酶将脂酰-ACP转化为脂肪烷烃或脂肪烯烃的生物合成途径。
[0005](2)2010 年，Bel Ier 等鉴定了细菌 Micrococcus luteus ATCC 4698 中基于 OleA酶催化脱羧缩合反应的长链烯烃生物合成途径，能将脂酰-Cok通过脱羧缩合，酮基加氢还原，羟基脱水等一系列生化反应生成含有内部双键的脂肪烯烃。
[0006](3) 2011 年，Pfleger 等鉴定了基于蓝细菌 Synechococcus sp.PCC 700201s 聚酬合成酶产生带末端双键的脂肪烯烃生物合成途径。长链脂肪酸酰基载体蛋白ACPl通过酮基合成酶、酰基转移酶、酮基还原酶、磺基转移酶及硫酯酶催化的一系列生化反应生成具有末端双键的脂肪烯烃。
[0007](4) 2011 年，LS9 公司 Rude 等报导了基于细菌 Jeotagalicoccus sp.ATCC 8456 中细胞色素P450脱羧酶(01eI\E)催化脂肪酸脱羧生成烯烃的反应。该P450 (01eI\E)在辅因子过氧化氢(H2O2)存在的条件下将脂肪酸通过脱羧反应生成具有末端双键的脂肪烯烃。
[0008](5) 2013年，Akhtar等构建了由硫酯酶、羧酸还原酶及脂肪醛脱羰基酶组成的脂肪烃生物合成途径，将脂酰-ACP转化为脂肪烃。
[0009]生物燃料的开发虽然解决了原料可再生和环保等问题，但成本居高不下是制约其工业规模化生产的最主要瓶颈之一。这些成本包括原料成本、催化剂成本和生产过程成本，其中原料成本尤为关键。上述已报导的脂肪烃生物合成途径大多是基于脂肪酸代谢途径，以游离的脂肪酸(Free fatty acid)或者是脂酰化的脂肪酸形式(脂酰-ACP或脂酰-CoA)为直接原料。脂肪酸从头合成(De novo b1synthesis)涉及多步酶促反应组成的代谢网络，起始底物(糖等)转化脂肪酸的利用率较低。过表达脂肪酸合成途径中的关键酶基因和敲除脂肪酸氧化途径中的关键酶基因等代谢工程(Metabolic engineering)手段虽然在一定程度上可提高脂肪酸的积累量，但由于脂肪酸代谢调控网络的精密性与复杂性，通过过表达脂肪酸代谢途径中较多的关键酶会增加宿主细胞的代谢负担，同时通过遗传改造来强化脂肪酸合成会增加脂肪酸代谢网络的不可控因素。全面系统地认识、利用并改造脂肪酸代谢网络难度较大，使脂肪酸积累量进一步提升的空间有限。因此基于脂肪酸代谢途径，以脂肪酸为直接原料生产脂肪烯烃的成本过高，制约了其产业化应用。
[0010]脂肪酶(Lipase)作为典型的羧酸水解酶，能够催化天然底物甘油脂水解，生成游离的脂肪酸和甘油。甘油酯广泛存在于自然界中的动植物油脂和微生物油脂中，资源丰富，价格相对于游离脂肪酸更加低廉。经检索，以甘油酯为原料，基于酶催化的脂肪烃催化合成方法尚未见任何报导。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法
[0012]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0013]一种基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法，以甘油酯作为原料，通过脂肪酶水解和P450脱羧的偶联催化，即脂肪酶水解甘油酯生成游离脂肪酸，生成的脂肪酸再经过P450脱羧产生脂肪烯烃。
[0014]进一步的说是，以外源添加的油脂为底物，以外源供给的过氧化氢为辅因子，在催化剂的作用下于20-50°C条件下反应0.5-48h，偶联催化制备脂肪烯烃；
[0015]所述催化剂为重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的生长态细胞培养液、重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的静息态全细胞或重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的无细胞粗提液或重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的纯酶。
[0016]更进一步的说，以浓度为0.2-100mM油脂作为底物、浓度为0.2_300mM的过氧化氢(0.3%, v/v)作为辅因子，在催化剂的作用下偶联催化反应在pH为4-12的缓冲液体系下反应，反应后加入与反应物等体积含有内标的乙酸乙酯或正己烷萃取分析，油脂转化为脂肪烯烃的转化率为10-85% ；
[0017]所述催化剂中脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶摩尔比为1:100-100:1。
[0018]所述油酯为动植物来源的油脂、微生物来源的油脂或含高酸价的废弃油脂；
[0019]所述脂肪酶为对油酯具有水解作用的脂肪酶；
[0020]所述P450脂肪酸脱羧酶为对脂肪酸具有脱羧活性的酶。
[0021]所述油酯为大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、微藻油、酵母源油脂、鱼油，或地沟油；
[0022]所述脂肪酶为疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces Ianuginosus)脂肪酶Tl 1、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶、白地霉(Geotrichum candidum)脂肪酶、皱裙假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)脂肪酶、米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolylica)脂肪酶、米赫毛霉(Mucor miehe)脂肪酶、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)脂肪酶、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)脂肪酶或芽孢杆菌属(Bacillussp.)脂肪酶；
[0023]所述P450脂肪酸脱羧酶为源于Jeotgalicoccus sp.)的OleTjl5或来源于Bacillus subtilis 的 P450BS”
[0024]所述催化剂按如下方式获得:
[0025]I)通过构建含有目的脂肪酶基因的重组质粒，转化重组质粒至大肠杆菌感受态细胞，获得表达脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶的重组大肠杆菌基因工程菌株；获得的大肠杆菌基因工程菌株作为出发菌株通过两阶段发酵；
[0026]2)上述发酵液即为生长态细胞培养液作为催化剂；
[0027]上述发酵液通过离心分离收集过表达脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶的重组大肠杆菌细胞，即为静息态全细胞作为催化剂；
[0028]上述发酵液经超声破碎细胞，获得脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶的无细胞粗提液作为催化剂；
[0029]或，上述发酵液利用重组酶His-tag与N1-NTA的亲和层析所得纯酶作为催化剂。
[0030]上述采用诱导型质粒分别与脂肪酶或P450脂肪酸脱羧酶通过酶切与酶连的方式分别构建的重组质粒，然后将分别获得的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，分别获得构建的高效表达脂肪酶或P450脂肪酸脱羧酶的基因工程菌；
[0031]将上述获得的基因工程菌通过诱导前的菌体生物量积累，直至菌体密度达到0D_=0.6-0.8，而后经IPTG诱导的酶表达的两阶段发酵，并保持菌体的进一步生长。
[0032]所述的诱导型质粒为受T7启动子控制的pET质粒系列；如pRSFDuetl或pET28b或