一种液态烷烃的灭菌方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工领域，具体地涉及一种用于生物转化底物的液态烷烃的灭菌 方法。
【背景技术】
[0002] 烷烃，即饱和烃（Saturated group)是只有碳碳单键和碳氢键的链烃，是最简单的 一类有机化合物。烷烃性质相对稳定，不易发生反应，在工业上一般直接作为燃料使用。液 态烷烃指含有5?16个碳原子的烷烃，在室温条件下通常呈现液态。随着生物技术的发展， 液态烷烃作为碳源被广泛应用于发酵领域，如以十二碳正构烷烃生产十二碳二元酸的发酵 工艺。
[0003] 在发酵生产过程中，培养基成分需要经过灭菌操作，从而保证发酵体系的菌种单 一、稳定。液态烷烃通常作为碳源及发酵底物使用，相对用量较大，通常采用批次补加的形 式加入发酵体系中，因此液态烷烃的灭菌一般需要进行批量灭菌。例如在长链二元酸生产 中，专门准备了液态烷烃储罐，将整个发酵周期所需要的烷烃预先存储，并进行灭菌处理。
[0004] 液态烷烃的灭菌主要采用蒸汽加热的方式将温度升至121°c，并恒温保压30min。 在灭菌操作中，通常采用夹套加热的方式进行升温操作，但是夹套升温速度较慢，因此一 般会在升温过程中，以通蒸汽的方式进行升温加热。这样的操作会在灭菌的前中期形成 较大的蒸发量，从而在蒸汽中夹带大量的烷烃，统计表明这种烷烃损失约占烷烃使用量的 10%?20%。同时，底部通蒸汽的方式使蒸汽与烷烃直接接触，因此会形成大量的冷凝水参 杂在烷烃中，形成乳化层，为杂菌的侵入提供了水环境，提高了染菌风险。现有条件下，无论 对这种灭菌方式进行怎样的优化，都会造成烷烃损失以及形成水相乳化层，从而对发酵造 成一定影响。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种液态烷烃的灭菌方法。该方法通过改进液 态烷烃的灭菌工艺，减少了烷烃的蒸发损失及乳化层的形成，降低了灭菌温度，缩短了灭菌 时间，提高了灭菌效率。
[0006] 本发明的液态烷烃的灭菌方法，包括以下内容：用于生物转化的液体烷烃，经微波 破乳处理，烷烃与水分层，加入抑菌剂，进行微波灭菌处理，得到灭菌的液态烷烃。
[0007] 本发明方法中，所述的液体烷烃为能够用于生物发酵的含有5?16个碳原子的烷 烃，如用于长链二元酸发酵的十二碳正构烷烃、十四碳正构烷烃等。
[0008] 本发明方法中，微波破乳处理的条件为：微波频率为300?3000MHz，微波功率密 度为100W/L?10kW/L，处理温度为5(T90°C，处理时间为1(Γ30分钟。
[0009] 本发明方法中，微波破乳处理优选采用间歇加热的方式，具体为：首先升温至 70?90°C，然后停止微波，自然冷却至50?60°C，以此方式进行2?4次破乳操作。
[0010] 本发明方法中，所述的抑菌剂选自为单糖、双糖以及有机酸盐、无机盐中的一种或 几种，其中单糖为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖等，优选葡萄糖；双糖为蔗糖、乳糖、麦芽糖等， 优选蔗糖；有机酸盐为柠檬酸盐、醋酸盐、氨基酸盐等，优选醋酸钠；无机盐为氯化钠、氯化 钾等，优选氯化钠；抑菌剂的加入量与液态烷烃中水的质量比为1 :〇. 5~1 :10,优选1 :2~1 : 5〇
[0011] 本发明方法中，微波灭菌处理的条件为：微波频率为300?3000MHz，微波功率密 度为20?100W/L，处理时间为5?10分钟。
[0012] 与现有技术相比，本发明方法具有如下优点： (1)纯品不容易出现染菌情况，但是实际的液态烷烃中经常会夹带一定的水分，从而为 细菌滋生带来了一定的可能性，因此烷烃的灭菌一般是针对这部分夹带水，本发明方法引 入了微波及抑菌剂两种控制手段，灭菌有针对性，同时微波与抑菌剂之间相互配合，灭菌效 果突出，解决了常规蒸汽灭菌中存在的烷烃损失及染菌风险高的问题。
[0013] (2)烷烃密度比水小，因此在烷烃体系中，出现烷烃在上水在下的分层状态，水具 有极性，有良好的吸波效应，通过微波加热的方式，可以瞬时提高夹带水的温度，在微波的 作用下，能够对水产生热灭菌的效果，同时，由于烷烃的非极性特征，不具吸波效应，有利于 烷烃中的结合水的剥离。
[0014] (3)微波的杀菌作用主要通过使蛋白质变性、改变细胞膜通透性等方式，影响菌体 正常代谢，从而起到杀菌作用。但细菌作为生命体，自身具有自主调控功能，能够应对外来 刺激，形成应激反应。这种调控作用的基础在于水环境。本方法通过加入单糖、双糖、有机 酸盐以及无机盐等添加剂，在烷烃体系中形成局部的高渗环境，从而会使菌体细胞内的水 分大量流失，使菌体的应激机制受到抑制，从而大大提升了微波的杀菌效果。同时，这些高 浓度的营养物质会随着烷烃流加进入到发酵体系中，从而对促进发酵菌株代谢，提高发酵 水平，具有一定的增益效果。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明方法的具体过程及效果进行说明，但不局限于以下实施 例。
[0016] 本实施例中选用热带假丝酵母（Candida tropicalis)突变株PF-UV-56作为发酵 菌株进行长链烷烃发酵生产长链二元酸实验，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 0356。采用卡尔费休水分测量仪对烷烃体系中 的含水量进行测量，从而确定灭菌各参数控制。
[0017] 实施例1 (1)将IOL十二碳正构烷烃，含水量2% (V:V)，加入15L补料储罐中，微波破乳处理， 微波频率2450MHz，微波功率为5KW，微波加热升温至90°C，然后自然降温至50°C，重复升 温-降温过程两次。
[0018] (2)向步骤（1)中的烷烃中加入葡萄糖200g，进行微波灭菌，微波频率896MHz，微 波功率为200W，处理10分钟，灭菌后的烷烃记为Al，降温备用。
[0019] 实施例2 (1)将IOL十二碳正构烷烃，含水量3.3% (V:V)，加入15L补料储罐中，微波破乳处 理，微波频率896MHz，微波功率为1KW，微波加热升温至80°C，然后自然降温至60°C，重复升 温-降温过程4次。
[0020] (2)向步骤（1)中的烷烃中加入蔗糖80g，进行微波灭菌，微波频率500MHz，微波功 率为400W，处理10分钟，灭菌后的烷烃记为A2,降温备用。
[0021] 实施例3 (1)将IOL十二碳正构烷烃，含水量5. 2% (V:V)，加入15L补料储罐中，微波破乳处理， 微波频率500MHz，微波功率为1KW，微波加热升温至90°C，然后自然降温至50°C。
[0022] (2)向步骤（1)中的烷烃中加入醋酸钠66g，进行微波灭菌，微波频率400MHz，微波 功率为400W，处理10分钟，灭菌后的烷烃记为A3,降温备用。
[0023] 对比例1 将IOL十二碳正构烷烃，含水量2%(V:V)，加入15L补料储罐中。夹套加热至90°C，随 后罐底通入0. 4MPa蒸汽，升温至121°C，维持温度30分钟后，自然冷却至37°C。灭菌后的 烧经记为A4。
[0024] 对比例2 将IOL十二碳正构烷烃，含水量3.3% (V:V)，加入15L补料储罐中，夹套加热至90°C， 随后罐底通入〇.4MPa蒸汽，升温至121°C，维持温度30分钟后，自然冷却至37°C。加入蔗 糖80g，搅拌均匀。将此烷烃标记为A5。
[0025] 对比例3 将IOL十二碳正构烷烃，含水量5. 2%(V:V)，加入15L补料储罐中，微波破乳处理，微波 频率500MHz，微波功率为1KW，微波加热升温至90°C，然后自然降温至50°C，重复升温-降 温过程两次，灭菌后的烷烃标记为A6。
[0026] 实施例4 以热带假丝酵母为发酵菌株，分别以灭菌后的十二碳正构烷烃A1~A6为底物，采用批 次补加、梯度调节PH的方式进行好氧发酵，直至144h时反应结束。最终发酵结果见表1。
[0027] 表1十二碳二元酸发酵试验的结果。
【主权项】
1. 一种液态烷烃的灭菌方法，其特征在于包括以下内容：用于生物转化的液体烷烃， 经微波破乳处理，烷烃与水分层，加入抑菌剂，进行微波灭菌处理，得到灭菌的液态烷烃。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的液体烷烃为能够用于生物发酵的 含有5?16个碳原子的烷烃。
3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微波破乳处理的条件为：微波频率为 300?3000MHz，微波功率密度为100W/L?10kW/L，处理温度为5(T90°C，处理时间为1(Γ30 分钟。
4. 按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：微波破乳处理采用间歇加热的方式， 具体为：首先升温至70?90°C，然后停止微波，自然冷却至50?60°C，以此方式进行2? 4次破乳操作。
5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的抑菌剂选自为单糖、双糖以及有机 酸盐、无机盐中的一种或几种。
6. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的单糖为葡萄糖、果糖、半乳糖或核 糖中的一种或几种；双糖为蔗糖、乳糖或麦芽糖中的一种或几种；有机酸盐为柠檬酸盐、醋 酸盐或氨基酸盐中的一种或几种；无机盐为氯化钠或氯化钾。
7. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：抑菌剂的加入量与液态烷烃中水的质量 比为 1 :0· 5?1 :10。
8. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：抑菌剂的加入量与液态烷烃中水的质量 比为1 :2?1 :5。
9. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微波灭菌处理的条件为：微波频率为 300?3000MHz，微波功率密度为20?100W/L，处理时间为5?10分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种液态烷烃的灭菌方法，包括以下内容：用于生物转化的液体烷烃，经微波破乳处理，烷烃与水分层，加入抑菌剂，进行微波灭菌处理，得到灭菌的液态烷烃。微波破乳处理的条件为：微波频率为300～3000MHz，微波功率密度为100W/L～10kW/L，处理温度为50~90℃，处理时间为10~30分钟。微波灭菌处理的条件为：微波频率为300～3000MHz，微波功率密度为20～100W/L，处理时间为5～10分钟。本发明方法解决了常规蒸汽灭菌中存在的烷烃损失及染菌风险高的问题，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61L2-12, C12P7-64, C12R1-74
【公开号】CN104561147
【申请号】CN201310496025
【发明人】张霖, 廖莎, 姚新武, 师文静, 李晓姝, 王领民
【申请人】中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月22日