脂肪酶变体及其编码多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有改进的酰胺-键反应中的活性的脂肪酶变体、编码所述变体的多核苷酸、产生所述变体的方法，以及使用所述变体的方法。
【专利说明】脂肪酶变体及其编码多核苷酸
[000? ] 涉及序列表
[0002]本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
[0003]发明背景
【技术领域】
[0004]本发明涉及具有改进的酰胺-键反应中的活性的脂肪酶变体、编码所述变体的多核苷酸、产生所述变体的方法，以及使用所述变体的方法。更具体地，本发明涉及与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B (CALB)具有至少60%同源性的修饰酶，其与相应的未修饰酶相比具有改进的酰胺-键反应中的活性。
[0005]相关技术的描述
[0006]脂肪酶(三酰基甘油水解酶，EC3.1.1.3)是催化脂肪酸酯(甘油三酯)水解的丝氨酸水解酶。它们具有宽的底物特异性，可接受结构差异巨大的多种酯、醇、和羧酸作为底物。脂肪酶不催化或者难以催 化酰胺的水解，这部分可以用酰胺的反应性比酯更低来解释(Bruice, P.Y.(1998) Organic Chemistry, 678)。然而，已经有少数关于脂肪酶水解酰胺的报道公开:Duarte DE., Castillo E., Barzana E., &Lopez-Munguia A.(2000)BiotechnolLett.，22，1811-1814公开了来自南极假丝酵母的脂肪酶B对辣椒素，一种天然水不溶性酰胺的水解。Henke E.&Bornscheuer U.T.(2003)Anal Chem.，75，255-260 描述了一种用于高通量测定酰胺水解的荧光测定法，其被用来评估22种未修饰的脂肪酶和酯酶，以及筛选15000种通过易错PCR和其他随机诱变方法生成的突变体。该定向进化实验未揭示阳性结果，即新的酰胺酶活性。
[0007]在另一项定向进化实验中，FujiiR., Nakagawa Y., Hiratake J., SogabeA.，&Sakata K.(2005) Protein Eng Des Sel.，18，93-101 针对通过易错 PCR 随机产生的20000个铜绿假单胞菌脂肪酶突变体筛选改进的酰胺水解，发现了 3个突变，即F207S, A213D 和 F265L,可影响酸胺酶 / 酯酶活性比。Nakagawa Y., Hasegawa A., HiratakeJ.&Sakata K.(2007) Protein Eng Des Sel.，20，339-346 描述了这项工作的后续进展，其中他们突变了铜绿假单胞菌脂肪酶以寻求更高的酰胺酶活性，并显示三重突变体F207S+A213D+M252F，而非残基M16或H83的取代，产生酰胺酶活性的增加。该项研究还试图进一步揭示为什么不水解酰胺，尽管其与能够水解酰胺的丝氨酸蛋白酶有某些相似性。二者都含有催化一个三联体，其由Ser-His-Asp/Glu以及一个氧阴离子孔构成。但是二者也有相当大的差异，表现在丝氨酸蛋白酶与铜绿假单胞菌脂肪酶之间少于30%的序列同一性。铜绿假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B享有的序列同一性小于30%。南极假丝酵母脂肪酶B已经是有机化学中一种确立的工具，尤其是用于酯-键反应，即酯的水解和合成以及酯交换反应。
[0008]因此，理想的是产生也能够用于催化酰胺的切割(水解)和形成的脂肪酶。本发明提供在酰胺-键反应中与亲本脂肪酶相比具有改进的活性的脂肪酶变体。
【发明内容】
[0009]本发明涉及亲本脂肪酶的变体，所述变体是:(a)与SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽；(b).由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii) (i)的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的多肽；(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列具有至少60%同一性的多核苷酸所编码的多肽；或(d) SEQ ID N0:2的成熟多肽的片段，其中所述变体相比于所述亲本脂肪酶具有改进的酰胺-键反应中的活性。
[0010]本发明涉及在对应于SEQ ID N0:2的成熟多肽的S31R/K;G39;A225;T103V/S/A;L278G/K/R/H;W104Y/K/R;T42G/S/Q/H/I/L/M;D223G/N/A/V/H;I189;Q19I;D134V/T/I/F/A/S/K/R;E188;V221A/R/K/H;7P38H/N/A/G;G41P/S;A132;N79;Q106;和 / 或 L140R/K/H中的一个或多个位置上包含取代的变体。
[0011]本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。
[0012]本发明还涉及使用这些脂肪酶变体催化酰胺-键反应的方法。
[0013]附图简要说明
[0014]图1显示脂肪酶氨基酸序列的比对。
[0015]定义
[0016]酰胺-键反应中的活性:术语“酰胺-键反应中的活性”意指酰胺键的形成或裂解(永久性的或暂时性的)，包括但不限于酰胺合成、酰胺水解、醇解、氨解、酰胺交换、酸解、转酰基(transacylation)、酰基转移(acyl transfer)、以及这些反应的逆反应。为本发明的目的，酰胺-键反应中的活性是根`据实施例中描述的程序测定的。在一个方面，本发明的变体与亲本脂肪酶，例如SEQ ID N0:2的成熟多肽相比，具有改进的酰胺-键反应中的活性。
[0017]酰胺酶:术语“酰胺酶”意指催化酰胺水解的酶。
[0018]酯酶:术语“酯酶”意指在水的存在下催化酯水解成酸和醇的酶。
[0019]脂肪酶:术语“脂肪酶”意指催化脂质的水解或形成的酶。为本发明的目的，术语“脂肪酶”还包括任何与SEQ ID NO: 2的氨基酸残基1-317有至少60%同源性的酶，无论其酶分类为何。
[0020]活性位点残基:术语“活性位点残基”指任何与底物、转化状态或产物直接接触的残基(或骨架部分)。
[0021]等位变体(allelic variant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0022]cDNA:术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列的步骤加工包括剪接,然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
[0023]编码序列:术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的DNA，或它们的组合。
[0024]调控序列(control sequence):术语“调控序列”意指包括对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的所有成分。每个调控序列对于编码所述变体的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每个调控序列对于彼此可以是天然(即来自相同基因)的或外源的(即来自不同基因)。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以具备用于引入可促进调控序列与编码变体的核苷酸序列编码区的连接的特异性限制位点的接头。
[0025]表达:术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0026]表达载体:术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与帮助其表达的控制序列可操作地连接。
[0027]片段:术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有改进的酰胺-键反应中的活性。
[0028]高严格条件:术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在65°C将载体材料最终洗涤三次 ，每次15分钟。
[0029]宿主细胞:术语“宿主细胞”意指任何适合于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的由于在复制过程中发生的突变而不与亲本细胞完全相同的后代。
[0030]改进的性质:术语“改进的性质”意指变体的相比于亲本有所改进的相关性质。这样的改进的性质涉及增加的酰胺-键反应中的活性，且包括但不限于:催化效率、催化速率(catalytic rate)、转换数(turnover number)、比活性、底物结合、底物裂解(substratecleavage)、底物特异性、和产物释放。
[0031]分离的:术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(I)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或所有与其天然伴随的天然存在的成分分开的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何这样的物质:相对于在自然界存在的该物质，其经过人工修饰；或(4)任何这样的物质:该物质经过增加该物质相对于与其自然伴随的其他成分的量的修饰(例如，宿主细胞中编码该物质的基因的多重拷贝；和与编码该物质的基因自然结合的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0032]低严格条件:术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在50°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0033]成熟多肽:术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，成熟多肽为SEQ ID N0:2的氨基酸1-317。本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
[0034]成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有改进的酰胺-键反应中的活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸 76 至 1026。
[0035]中等严格条件:术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在55°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0036]中等-高严格条件:术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在60°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0037]突变体:术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
[0038]核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或所述核酸分子是合成的，包含一个或多个调控序列。
[0039]可操作地连接:术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中调控序列被置于相对于多核苷酸序 列的编码序列的适当位置，使得该调控序列指导该编码序列的表达。
[0040]亲本或亲本脂肪酶:术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指被施加取代以产生本发明的脂肪酶变体的脂肪酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
[0041]序列同一性:参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
[0042]就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice etal., 2000, Trends Genet.16:276-277)(优选 5.0.0 版或更新版本)的 Needle 程序中所执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman and ffunsch, 1970, J.M ol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分(gap open penalt y) 10,缺口延伸罚分(gapextension penalty) 0.5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩阵。使用 Needle 标记为“最长同一'I"生(longest identity) ”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性,并计算如下:
[0043](同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
[0044]就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBO SS软件包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所执行的Needle man-ffunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EM BOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下:[0045](同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
[0046]亚序列:术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有改进的酰胺-键反应中的活性的片段。
[0047]变体:术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含取代的、具有改进的酰胺-键反应中的活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代。本发明的变体与亲本脂肪酶相比具有改进的酰胺-键反应中的活性。
[0048]非常高严格条件:术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在70°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0049]非常低严格条件:术语“非常低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45 °C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
[0050]野生型:术语“野生型”意指由天然存在的生物体，例如自然界中出现的细菌、古细菌、酵母、真菌、植物或动物所表达的多肽。
[0051]变体指称规则
[0052]为本发明 的目的，使用SEQ ID NO:2中公开的成熟多肽来确定另一脂肪酶中的相应氨基酸残基。将另一脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID N0:2中公开的成熟多肽对齐，并基于该比对，使用如 EMBOSS 程序包(EMB0SS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.16:276-277),优选 5.0.0 或更新的版本中的 Needle 程序所实现的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中公开的成熟多肽中的任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。所用的参数为缺口开启罚分10、缺口延伸罚分0.5、以及EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版本)取代矩阵。
[0053]对另一脂肪酶中的对应氨基酸残基的指认可以通过使用几种计算机程序，以其各自的缺省参数进行多个多肽序列的比对来确定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE (基于log-期望的多重序列比较；3.5或更新版本；Edgar, 2004，Nucleic Acids Research32:1792-1797), MAFFT (6.857 或更新版本；Katoh and Kuma, 2002, Nucleic AcidsResearch30:3059-3066;Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research33:511-518;Katohand Toh,2007, Bioinformatics 23:372-374;Katoh et al., 2009, Methods in MolecularBiology537:39-64;Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics26:1899-1900),和使用Clustalff 的 EMBOSS EMMA (1.83 或更新版本；Thompson et al., 1994, Nucleic AcidsResearch 22:4673-4680)。
[0054]当所述另一种酶与SEQ ID NO: 2的成熟多肽已经分歧到如此程度，以至于传统的基于序列的比较无法检测出它们的关系时(Lindahl and Elofsson, 2000, J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其他逐对的序列比较算法(pairwise sequencecomparison)。当其它酶与SEQ ID N 0:27的成熟多肽差异较大从而传统的基于序列的比较不能检测它们之间的关系时(Lindahl 和 Elofsson, 2000，J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其它逐对序列比较算法。使用利用多肽家族(谱)的概率代表搜索数据库的搜索程序，可在基于序列的搜索中获得更高的灵敏度。例如，PS1-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程产生谱，并且能检测关系较远的同源物(Atschul等，1997，NucleicAcids Res.25:3389-3402)。如果多肽家族或超家族在蛋白质结构数据库中有一个或多个代表，则可以实现甚至更高的灵敏度。程序如GenTHREADER(Jones，1999，J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin and Jones, 2003, Bioinformaticsl9:874-881)利用来自多种来源的信息(PS1-BLAST，二级结构预测，结构比对谱，和溶解势)作为神经网络的输入，所述网络可预测所查询序列的结构折叠。类似地，可以使用Gough et al., 2000, J.Mol.Biol.313:903-919的方法比对未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型。然后可以使用这些比对结果产生多肽的同源性模型，并且可以使用专门开发的多种工具评价这类模型的精确度。
[0055]对于已知结构的蛋白质，有几种工具和资源可用于获取和产生结构比对。例如，已经比对了蛋白质的SCOP超家族的结构，并且这些比对结果是可以访问和下载的。可以使用多种算法，如距离比对矩阵(Holm和Sander, 1998, Proteins 33:88-96)或组合延伸(Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Eng.11:739-747)比对两个或更多个蛋白质的结构，并且执行这些算法还能用于查询具有目的结构的结构数据库以发现可能的结构同源物(例如，Holm 和 Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567)。
[0056]在描述本发明的变体时，为便于提述，采用下述命名法。在所有情况下，应用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
[0057]ML-对于氨基酸取代，使用下述命名法:原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代苏氨酸表示为“Thr226Ala”或“ T 226 A ”。
[0058]多个取代.多个 突变用加号(“ +，，)分隔，例如，“Argl70Tyr+Glyl95Glu”或“R170Y+G195E”，代表在位置170和195的突变，分别用酪氨酸取代精氨酸，和用谷氨酸取代
甘氨酸。
[0059]不同的取代.当在一个位置可以引入不同的改变时，不同的改变用逗号分隔，例如，“Argl70Tyr，Glu",或者用斜线分隔，例如“R170Y/E”，代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyrl67Gly，Ala+Argl70Gly, Ala” 或 “Y167G/A+R170G/A” 分别表示下述变体:
[0060]“Tyrl67Gly+Argl70Gly”， “Tyrl67Gly+Argl70Ala”， “Tyrl67Ala+Argl70Gly”，和“Tyrl67Ala+Argl70Ala” 或“Y167G+R170G”， “Y167G+R170A”， “Y167A+R170G” 和“Y167A+R170A”。
[0061]发明详述
[0062]改进的酰胺-键反应中的活性
[0063]与亲本酶相比，本发明涉及变体对至少一种底物中的至少一个选定的酰胺键的活性的改进。因此，具备改进的酰胺-键反应中的活性的酶可以用于许多目的，例如在胺和酰胺是关键中间体和产物的生物催化、有机合成和分析中，例如在药物和杀虫剂合成、分析和降解中，水解(例如保护基团的除去、残余物的降解)，醇解，氨解，酸解，酰胺形成，酰胺交换反应，酰胺、胺、羧酸、酯和醇的外消旋拆分，对不希望的酰胺的降解，例如对土壤、表面、食品和饲料的净化；从中间产品去除天然产生的酰胺，对含有酰胺的产品的改性。对于任何使用此类生物催化剂的工业用途，增加酰胺-键反应中的活性都可能是理想的。
[0064]底物和产物
[0065]底物或产物可以是任何包含酰胺-键的化合物。实例包括但不限于N-异丙基 _ 丁酸胺(N-propyl-butyramide), 2_ 氯-N-乙基-乙酸胺(2-chloro-N-ethyl-acetamide)、2_ 漠-N-癸基-乙酸胺(2_bromo-N-decyl-acetamide)、N_[3_( 二甲基氛基)_ 丙基]_ 月桂酸胺(N-[3-(dimethylamino)-propyl]-1auramide))、对-硝基苯基-酰胺(p-nitropheny 1-amides),例如对-硝基苯基-乙酰胺(=对-硝基乙酰苯胺)，对-硝基苯基-丁酰胺、N-(2-萘基)-酰胺(N-(2-naphthyl) -amides),例如N-(2-萘基)油酰胺(N-(2-naphthyl)-oleamide)、4_硝基-N-丙基-苯甲酰胺(4-nitro-N-propyl-benzamide)。进一步的例子是结构如下的化合物:
[0066]
【权利要求】
1.亲本脂肪酶的变体，所述变体是: a.与SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽； b.由在低严格条件下与(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)编码SEQ IDNO:2的成熟多肽的序列、或(iii) (i)或(ii)的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的多肽； c.由与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列、或编码SEQ ID NO: 2的成熟多肽的序列具有至少60%同一性的多核苷酸所编码的多肽；或 d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段， 其中所述变体相比于所述亲本脂肪酶具有改进的酰胺-键反应中的活性。
2.权利要求1的变体，其在对应于SEQID NO:2的成熟多肽的位置S31R/K;G39;A225;T103V/S/A;L278G/K/R/H;W104Y/K/R;T42G/S/Q/H/I/L/M;D223G/N/A/V/H;I189;Q191;D134V/T/I/F/A/S/K/R;E188;V221A/R/K/H;7P38H/N/A/G;G41P/S;A132;N79;Q106;和/或L140R/K/H中的一个或多个位置上包含取代。
3.权利要求2 的变体，其中所述取代为:G39A;A225I/V/L/M/K/R/S/T/G/H;I189Y/H/Q/N/R/K/A/E/S/T/G;Q191N/A/R/K/H;E188Q/R/D/N/K/H/A;A132S/N/G/H/K/R;N79V/Q/E;和 /或 Q106N/Y。
4.权利要求2或3的变体，其还包含选自下列的取代:T103G；L278A/V ；W104F/Q ；T42N/V/A;D134L;和 G41A。
5.权利要求1-4中任一项的变体，其与所述亲本脂肪酶的氨基酸序列具有至少60%，例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%同一性，至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%,但小于100%序列同一性。
6.权利要求1-5中任一项的变体，其与SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%,但小于100%序列同一性。
7.权利要求1-6中任一项的变体，其中取代的个数为1-20，1-10，1-5，I,2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或 20。
8.权利要求1-7中任一项的变体，其包含或含有:
a.A225K;
b.A225I;
c.A225V;
d.A225L;
e.A225M;
f.A225S;
g.G39A;
h.D223G;
i.D223N;
J.T42G;
k.T42S;
l.Q191R;
9.权利要求1-8中任一项的变体，其相对于所述亲本脂肪酶具有改进的酰胺-键反应中的活性，其中所述反应选自下组:催化效率、催化速率、转换数、比活性、底物结合、底物裂解、底物特异性、底物稳定性、和产物释放。
10.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-9中任一项的变体。
11.一种核酸构建体，其包含权利要求10的多核苷酸。
12.—种表达载体,其包含权利要求10的多核苷酸。
13.—种宿主细胞，其包含权利要求10的多核苷酸。
14.一种产生脂肪酶变体的方法，其包括: a)在适于该变体表达的条件下培养权利要求13的宿主细胞；和 b)回收该变体。
15.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其经过权利要求10的多核苷酸的转化。
16.—种产生权利要求1-9中任一项的变体的方法,包括: a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和 b)回收所述变体。
17.用于从亲本脂肪酶获得变体的方法，所述变体与所述亲本脂肪酶相比具有改进的酰胺-键反应中的活性，所述方法包括:a.选择位于任何催化三联体残基10A以内的至少一个这样的氨基酸残基，其(i)改变含有该催化三联体的口袋的几何条件；和/或(ii)通过静电场影响该催化三联体； b.对该至少一个氨基酸残基进行取代； c.制备由步骤(a)和(b)得到的变体； d.测试该变体在酰胺-键反应中的活性；和 e.选择相比于所述亲本脂肪酶具有改进的酰胺-键反应中的活性的变体。
18.权利要求17的方法，其中所述至少一个氨基酸残基处的取代选自:对应于SEQID NO:2 的成熟多肽中的位置的 S31R/K;G39 ；A225 ；T103V/S/A ；L278G/K/R/H ；W104Y/K/R ；T42G/S/Q/H/I/L/M ；D223G/N/A/V/H ；I189 ；Q191 ；D134V/T/I/F/A/S/K/R；E188 ；V221A/R/K/H ；P38H/N/A/G ；G41P/S ；A132 ；N79 ；Q106 ;和 / 或 L140R/K/H。
19.权利要求1-9中任一项的变体用于催化酰胺-键反应的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述酰胺-键反应选自下组:催化效率、催化速率、转换数、比活性、底 物结合、底物裂解、底物特异性、底物稳定性、和产物释放。
【文档编号】C12N9/20GK103827298SQ201280045174
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月3日 优先权日:2011年7月15日
【发明者】W.贝森马特, A.斯文德森, J.B.兰内斯, C.杰克尔 申请人:诺维信公司