脱氢酶变体和编码它们的多核苷酸的制作方法

脱氢酶变体和编码它们的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及3-羟基丙酸脱氢酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。
【专利说明】脱氢酶变体和编码它们的多核苷酸[0001 ] 对序列表的引用
[0002]本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003]背景
[0004]3-羟基丙酸(3-HP)是一种由美国能源部鉴定为可以通过发酵制造的排名前12的高潜力结构单元化学品之一的三碳羧酸。作为乳酸(2-羟基丙酸)的异构体的3-HP的替代名称包括乙烯乳酸和3-羟基丙酸化物。3-HP是一种有吸引力的可再生平台化学品，来自葡萄糖的理论产量为100%，具有允许它参与不同种化学反应的多种官能团，以及低的毒性。可以将3-HP用作底物来形成若干日用化学品，例如1，3-丙二醇、丙二酸、丙烯酰胺、以及丙烯酸。丙烯酸是一种用来生产丙烯酸酯和超强吸收能力聚合物的大量化学品(>70亿磅/年)，并且目前来源于丙烯的催化氧化。3-HP的发酵性生产将为作为这些商业上有意义的化学品的原料的石油化学产品提供可持续的替代物，从而减少能量消耗、对外国石油供应的依赖以及温室气体的产生。
[0005]3-羟基丙酸脱氢酶(3-HPDH)是一种将丙二酸半醛转化为3_HP的酶(图1)。某些3-HPDH酶利用辅因子NADP (H) (ECl.1.1.298)。然而，3-HPDH的一些工程化代谢途径利用辅因子NAD(H)而非NADP(H)是令人希望的(例如，用来改善氧化还原平衡)。因此，在本领域中存在对研发与NADP(H)相比，对辅因子NAD(H)具有增加的特异性的脱氢酶变体的需求。在此描述了满足这一需求的脱氢酶变体。
[0006]概述
[0007]在此描述了 3-羟基丙酸脱氢酶变体，这些变体在对应于SEQ ID N0:2的位置9、31、32、33、34、35以及36·中的一个或多个(例如，两个，若干个)位置处包括取代，其中这些变体具有3-羟基丙酸脱氢酶活性。在一些方面中，这些变体在对应于SEQ ID N0:2的位置10的位置处包括缺失。在一些方面中，与NADP(H)相比，这些变体对辅因子NAD (H)具有增加的特异性。
[0008]还描述了编码这些变体的分离的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；使用这些包括多核苷酸的宿主细胞生产3-羟基丙酸(3-HP)的方法；以及生产这些变体的方法。
[0009]附图简要说明
[0010]图1示出了一种用于产生3-HP的途径。
[0011]图2示出了大肠杆菌ydfG、东方伊萨酵母(1.0rientalis)YMR226c、以及酿酒酵母YMR226C的天然脱氢酶序列(分别是SEQ ID NO:2、4和6)的比对。在辅因子结合中涉及的残基被加下划线。在催化作用中涉及的残基是粗体的。
[0012]图3示出了与天然大肠杆菌脱氢酶(SEQ ID NO: 2)相比的变体脱氢酶mutl_mut25(分别是 SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、以及33)的N末端区的部分序列比对；以及与天然东方伊萨酵母脱氢酶(SEQ IDN0:4)相比的变体脱氢酶mut26和mut27 (分别是SEQ ID NO:80和81)的N末端区的部分序列比对。[0013]图4示出了 pTrc99A的质粒图。
[0014]图5示出了 pMcTsl08的质粒图。
[0015]图6示出了 pMcTsll6的质粒图。
[0016]图7示出了 pl045168的质粒图。
[0017]图8示出了 pMcTs77的质粒图。
[0018]图9示出了 pllAAT5WP的质粒图。
[0019]图10示出了 pMcTs78的质粒图。
[0020]图11示出了 pMcTsll5的质粒图。
[0021]图12示出了 pllAA2GJP的质粒图。
[0022]图13示出了 pMcTsl02的质粒图。
[0023]定义
[0024]3-羟基丙酸脱氢酶:术语“3-羟基丙酸脱氢酶”(3-HPDH)意指一种在NAD(H)或NADP(H)辅因子的存在下，催化丙二酸半醛互变至3-羟基丙酸化物(3-HP)的的酶。具有3-HP脱氢酶活性的酶类被分类为ECl.1.1.59 (如果它们利用NAD⑶`辅因子)，和ECl.1.1.298 (如果它们利用NADP(H)辅因子)。被分类为ECl.1.1.298的酶类可替代地被称为丙二酸半醛还原酶。本领域普通技术人员将意识到3-羟基丙酸脱氢酶可能对多于一种底物具有特异性。例如，具有SEQ ID N0:2的大肠杆菌3-羟基丙酸脱氢酶可以催化丝氨酸互变至2-氨基丙二酸半醛(即一种“丝氨酸脱氢酶”)和3-HP互变至丙二酸半醛(即，一种3-HTOH)两者。
[0025]可以根据在实例中描述的丙二酸半醛还原酶测定来确定3-羟基丙酸脱氢酶活性。在一个方面中，本发明的这些变体具有至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的SEQ ID NO: 2、4或6的3-羟基丙酸脱氢酶。
[0026]主动3-HP途径:如在此使用，具有“主动3-HP途径(active3_HP pathway)”的宿主细胞产生催化在从可发酵糖至3-HP的代谢途径中的每个反应所必需的活性酶，并且因此当在至少一种可发酵糖的存在下在发酵条件下培养时，能够以可测量的产量产生3-HP。具有主动3-HP途径的宿主细胞包括一个或多个3-HP途径基因。如在此使用，“3-HP途径基因”是指一种编码在主动3-HP途径中涉及的酶的基因。主动3-HP途径以及在该主动3-HP途径中涉及的对应的酶的一个实例示于图1中。
[0027]催化主动3-HP途径中的每个反应所必需的活性酶可以来自内源基因表达的活性、异源基因表达的活性、或来自内源基因和异源基因表达的活性的组合。
[0028]等位变体:术语“等位变体”是指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可变形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无改变)，或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0029]编码序列:术语“编码序列”意指明确一种多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。[0030]控制序列:术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。可以为这些控制序列提供为了引入以特定限制性位点的接头，以促进这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接。
[0031]表达:术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。可以对表达进行测量一例如，来检测增加的表达一通过本领域已知的技术,例如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。
[0032]表达载体:术语“表达载体”意指一种线性或环形的DNA分子，该分子包括编码一种多肽的多核苷酸并且被可操作地连接至控制序列，其中这些控制序列提供编码该多肽的多核苷酸的表达。最低限度上，该表达载体包括启动子序列，以及转录和翻译终止信号序列。
[0033]可发酵的培养基:术语“可发酵的培养基”是指包括一种或多种(例如，两种，若干种)糖的培养基，例如葡萄糖、果糖、鹿糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性低聚糖，其中这种培养基能够部分地被具有主动3-HP途径的宿主细胞转化(发酵)为3-HP。在一些情况下，这种发酵培养基来源于天然来源，例如甘蔗、淀粉、或纤维素；并且可以来自这种来源的酶水解(糖化作用)的预处理。
[0034]片段:术语“片段”意指一种具有一个或多个(例如，两个，若干个)氨基酸从参照多肽序列的氨基和/或羧基末端缺失的多肽。在一个方面中，该片段具有3-HPDH活性。在另一个方面中，在该片段中的氨基酸残基的数目是在此的任何3-HPDH的至少75%，例如至少80%、85%、90%、或95%，例如，是SEQ ID NO: 2、4、或6中的氨基酸残基的数目的至少75%，例如至少 80%、85%、90%、或 95%。
[0035]异源多核苷酸:在`此将术语“异源多核苷酸”定义为以下多核苷酸:对该宿主细胞而言不是天然的多核苷酸；已经对编码区做出一种或多种(例如，两种，若干种)结构修饰的天然多核苷酸；由于通过重组DNA技术对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸，例如，将一种不同的(外源的)启动子连接至该多核苷酸；或通过向该宿主细胞中引入该多核苷酸的一个或多个另外的拷贝而定量改变其表达的天然多核苷酸。
[0036]宿主细胞:术语“宿主细胞”意指对包括在此描述的多核苷酸(例如，编码3-HPDH的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的该亲本细胞的任何后代。
[0037]增加的特异性:术语“与NADP (H)相比，针对NAD (H)的增加的特异性”意指在其他方面相同的条件下，与NADP (H)相比，在NAD (H)的存在下，参照多肽具有较大的3-HPDH活性。在一些方面中，与NADP(H)相比，参照变体具有大于2倍，例如大于5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、或1000倍的针对NAD(H)的特异性。
[0038]分离的:术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(I)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从在自然界与之相关联的一种或多种或者所有天然存在的成分去除的任何物质，包括但不限于，任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的该物质，通过人工修饰的任何物质；或(4)通过使该物质的量相对于与之自然地相关联的其他组分有所增加(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因自然地相关联的启动子更强的启动子)而修饰的任何物质。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0039]突变体:术语“突变体”意指编码一种变体的一种多核苷酸。
[0040]核酸构建体:术语“核酸构建体”意指一种包括一个或多个(例如，两个、若干个)控制序列的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的或双链的，并且可以分离自天然存在的基因、可以被修饰来以另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段，或可以是合成的。
[0041]可操作地连接:术语“可操作地连接”意指如下构造，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，这样使得控制序列指导编码序列的表达。
[0042]亲本或亲本3-HPDH:术语“亲本”或“亲本3-HPDH”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种3-HPDH。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
[0043]序列一致性:用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性。
[0044]出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，J.Mol.Biol.(《分子生物学 杂志》)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite (欧洲分子生物学开放软件套件),Rice (赖斯)等人,2000, Trends Genet.(《遗传学趋势》)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序所实施的。所使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
[0045]出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(上文的尼德曼和翁施，1970)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMB0SS:欧洲分子生物学开放软件套件，上文的赖斯等人，2000)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。
[0046]严谨度条件:在此使用严谨度条件来提供在比较两个DNA序列的时候的杂交条件。
[0047]术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0048]术语“低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0049]术语“中严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在55°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0050]术语“中-高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0051]术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA 印迹(Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3%SDS、200 毫克 /ml 剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC,0.2%SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0052]术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0053]子序列:术语“子序列”意指一种具有一个或多个(例如，两个，若干个)核苷酸从参照核苷酸序列的5’端和/或3’端缺失的多核苷酸。在一个方面中，该子序列编码一种具有3-HPDH活性的片段。在另一个方面中，在该子序列中的核苷酸残基的数目是编码在此描述的3-HPDH的任何序列中的核苷酸残基的数目的至少75%，例如至少80%、85%、90%、或95%，例如，是SEQ ID勵:1、3、或5中的核苷酸残基的数目的至少75%，例如至少80%、85%、90%、或95%。
[0054]变体:术语“变体”意指相对于亲本3-HPDH，在一个或多个(例如，两个、若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的3-HPDH。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失意指占据一个位置的氨基酸的移除；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
[0055]野生型:术语“野生型” 3-HPDH或“天然” 3-HPDH意指由天然存在的微生物(例如在自然界中发现的细菌、酵母、或丝状真菌)表达的一种3-HPDH。
[0056]用于变体表示的常规`
[0057]用于在此描述的目的，使用SEQ ID NO:2来确定在其他3-HPDH酶类中的氨基酸编号。将另一种3-HPDH的氨基酸序列与SEQ ID NO:2进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970,分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ IDNO:2中所披露的多肽的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序所实施的。所使用的这些参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
[0058]可以使用若干计算机程序通过多种多肽序列的比对来确定在另一种3-HPDH中的对应氨基酸残基的鉴定,这些计算机程序包括,但不限于:MUSCLE (multiple sequencecomparison by log - expectation (基于日志-期望值的多序列比较);版本3.5或更新版本；Edgar (埃德加)，2004，Nucleic Acids Research (《核酸研究》)32:1792-1797)，MAFFT(版本 6.857 或更新版本；Katoh (卡托赫)和 Kuma (库玛)，2002, Nucleic Acids Research(《核酸研究》)30:3059-3066 ；Katoh (卡托赫)等人,2005, Nucleic Acids Research (《核酸研究》)33:511-518 ;Katoh (卡托赫)和 Toh (都)，2007，Bioinformatics (《生物信息学》)23:372-374 ；Katoh (卡托赫)等人，2009, Methods in Molecular Biology (《分子生物学方法》)537:_39-64 ;Katoh (卡托赫)和 Toh (都)，2010，Bioinformatics (《生物信息学》)26:_1899-1900)，以及利用 ClustalW 的 EMBOSS EMMA ( L 83 或更新版本；Thompson (汤普森)等人，1994, Nucleic Acids Research (《核酸研究》)22:4673-4680),使用它们各自的
缺省参数。
[0059]当从SEQ ID NO: 2中分叉分出其他酶序列，这样使得传统的基于序列的比较不能检测它们的关系(Lindahl (林达尔)和Elofsson松(埃洛弗)，2000，分子生物学杂志295:613-615)时，则可以使用其他配对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PS1-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个谱并且能够检测远距离同源物(Atschul (阿特休尔)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序(例如 GenTHREADER) (Jones (琼斯)，1999，分子生物学杂志 287:797-815 ;McGuffi (η 麦谷芬)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自多种来源(PS1-BLAST，二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化潜力)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough (高夫)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
[0060]对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法(例如距离比对矩阵(Holm (赫尔姆)和Sander (桑德尔)，1998, Proteins (《蛋白杂志》)33:88-96)或者组合扩展(Shindyalov (辛迪亚洛夫)和Bourne (伯恩)，1998,蛋白工程11:739-747))可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以另外地利用这些算法的实施来使用所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，赫尔姆和Park(帕克)，2000，生物信息学 16:56·6-567)。
[0061]在描述在此说明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
[0062]取代。对于氨基酸取代，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代被表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。在同一位置处的替代性取代由斜线分开。例如，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸或缬氨酸的取代被表示为“Thr226Ala/Val”或“T226A/V”，来表示T226A或T226V取代。多个突变由加号(“ + ”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe/Tyr”或“G205R+S411F/Y”表示分别在位置205和位置411处的甘氨酸(G)被精氨酸(R)并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)取代。
[0063]缺失。对于一个氨基酸缺失，使用了以下命名法。原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示为“Glyl95*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“ + ”)分开，例如 “61丫195*+561411*”或者“6195*+5411*，，。
[0064]插入。对于氨基酸插入，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Glyl95GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla” 或者 “G195GKA”。
[0065]在这类情况下，通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是:
[0066]
【权利要求】
1.一种3-HPDH变体，在对应于SEQ ID NO: 2的位置9、31、32、33、34、35以及36处的一个或多个(若干个)位置处包括取代； 其中该变体与SEQ ID N0:2、4、或6具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；并且其中该变体具有3-HPDH活性。
2.如权利要求1所述的变体，在对应于SEQID NO:2的位置9的位置处包括取代。
3.如权利要求1或2所述的变体，在对应于SEQID NO: 2的位置9的位置处包括Gly。
4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，在对应于SEQID NO: 2的位置31的位置处包括取代。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，在对应于SEQID NO: 2的位置31的位置处包括 Asp 或 Glu。
6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，在对应于SEQID NO: 2的位置32的位置处包括取代。
7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，在对应于SEQID NO: 2的位置32的位置处包括 Leu ο
8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，其中该变体包括SEQID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、80、或 81 或由其组成。
9.如权利要求1-8中任·一项所述的变体，其中与NADP(H)相比，该变体对NAD(H)具有增加的特异性(例如，与NADP⑶相比，针对NAD⑶的大于2倍、5倍、IO倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、或1000倍的特异性)。
10.一种具有3-HPDH活性的多肽，其中该多肽与SEQ ID NO:2、4、或6具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性；并且其中与NADP(H)相比，该多肽对NAD (H)具有增加的特异性。
11.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-10中任一项所述的变体或多肽。
12.一种包括主动3-HP途径以及异源多核苷酸的宿主细胞，该异源多核苷酸编码具有3-HPDH活性的3-HPDH变体， 其中该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置9、31、32、33、34、35以及36的一个或多个(若干个)位置处包括取代；并且 其中该变体与SEQ ID NO:2、4、或6具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其中该变体在对应于SEQID NO:2的位置9的位置处包括取代。
14.如权利要求12或13所述的宿主细胞，其中该变体在对应于SEQID NO:2的位置9的位置处包括Gly。
15.如权利要求12-14中任一项所述的宿主细胞，其中该变体在对应于SEQID NO: 2的位置31的位置处包括取代。
16.如权利要求12-15中任一项所述的宿主细胞，其中该变体在对应于SEQID NO: 2的位置31的位置处包括Asp或Glu。
17.如权利要求12-16中任一项所述的宿主细胞，其中该变体在对应于SEQID N0:2的位置32的位置处包括取代。
18.如权利要求12-17中任一项所述的宿主细胞，其中该变体在对应于SEQID N0:2的位置32的位置处包括Leu。
19.如权利要求12-18中任一项所述的宿主细胞，其中该变体包括SEQID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、80、或 81 或由其组成。
20.如权利要求12-19中任一项所述的宿主细胞，其中与NADP(H)相比，该变体对NAD (H)具有增加的特异性(例如，与NADP (H)，针对NAD (H)的大于2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、或1000倍的特异性)。
21.如权利要求12-20中任一项所述的宿主细胞，其中该细胞是一种酵母细胞(例如，东方伊萨酵母酵母细胞)。
22.如权利要求12-21中任一项所述的宿主细胞，其中该细胞包括: PEP羧化酶活性或丙酮酸羧化酶活性； 天冬氨酸转氨酶活性；` 天冬氨酸脱羧酶活性；以及 β -丙氨酸/ α -酮戊二酸转氨酶(BAAT)活性。
23.如权利要求12-22中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包括一个或多个选自以下的异源多核苷酸: 一种编码PEP羧化酶的异源多核苷酸， 一种编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸， 一种编码天冬氨酸转氨酶的异源多核苷酸， 一种编码天冬氨酸脱羧酶的异源多核苷酸，以及 一种编码BAAT的异源多核苷酸。
24.一种生产3-ΗΡ的方法，包括: a.在有益于生产3-HP的条件下培养如权利要求12-23中任一项所述的宿主细胞；并且 b.回收该3-HP。
【文档编号】C12N9/00GK103857791SQ201280047868
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年9月25日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】M.塔索恩, L.德马里亚 申请人:诺维信股份有限公司, 诺维信公司