专利名称：一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉及使用DNA 反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和(或)核苷类似物耐药相关突 变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原体。由HBV所引起的乙型肝炎是 一种危害严重的传染性疾病。目前，全世界慢性HBV感染者至少有3.5亿，而中国作为乙型 肝炎的高发流行区，约占总人口9%左右的人群(约1.2亿)为慢性HBV感染者。持续慢性 HBV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，包括无症状携带状态、急或慢性肝炎、肝 硬化等，严重的可能发展为原发性肝癌(HCC)。目前全世界每年有120万人死于HBV感染 引起的疾病。。
研究证明，持续高载量HBV是慢性乙肝病情进展和发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC) 的主要病因，因此慢性乙肝的治疗应着手于长期抑制或清除病毒。目前用于抗HBV治疗的药 物有干扰素和核苷类似物两大类，核苷类似物则是近年发展最快的抗病毒药物。截至目前， 美国FDA批准可用于治疗乙肝的核苷类似物药物主要有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替 比夫定和依曲西他平，克拉夫定仍处于试验阶段，临床一线药物以拉米夫定、阿德福韦和恩 替卡韦为主。
据研究，大部分乙型肝炎病毒中耐药突变主要集中在病毒DNA聚合酶序列，其中在不 同药物的选择压力下产生的耐药突变不尽相同，简述如下
拉米夫定(LAM)耐药突变主要集中在病毒DNA聚合酶的酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序，表现为编码甲硫氨酸的核苷酸发生碱基替代(ATG—ATT/GTG)， 从而使其编码的氨基酸发生相应的变化(M—I/V, rtM204I/V)。阿德福韦(ADV)耐药集中在 HBV多聚酶D区N236T和B区A181V等位点，rtV173L位点变异也对阿德福韦耐药产生一 定的协同作用；同时，据报道发现一例rtA181S变异与阿德福韦耐药相关，rtA181S+N236T 联合变异对拉米夫定与阿德福韦联合治疗敏感性较差。根据目前的资料证明，在YMDD突变 基础上，加上以下耐药突变位点T184G、 S202I、 M250V之一，即可发生恩替卡韦(ETV) 耐药。因此，ETV的耐药突变只发生在LAM耐药的患者中，提示ETV治LAM耐药的患者，有可能发生ETV耐药突变。替比夫定(LdT)在治疗过程中，亦可出现YMDD突变耐药， 治疗52周后，出现突变耐药率为2/44 (4.5%)，主要突变表型为M204I和L180M+M204V， 与LAM有交叉耐药。据报道依曲西他平(FTC)治疗48周后，YMDD突变耐药率达12.6%， 与LAM交叉耐药。
目前国内外的乙型肝炎病毒耐药基因突变检测试剂盒检测的变异位点一般为rtL180M、 rtA181V、 rtM204V和rtN236T等与拉米夫定及阿德福韦耐药相关位点，虽然也能覆盖部分乙 肝耐药患者群，但存在一定的漏检率，并且不能检测恩替卡韦耐药突变位点。本发明拟检测 rtV173L、 rtL180M、 rtA181V 、 rtA181S 、 rtT184G、 rtS2021、 rtM204V/1、 rtl233V、 rtN236T 和rtM250V等几乎涵盖目前已知所有能引起核苷类似物药物耐受性核苷酸变异位点，并且能 较准确的检测出野生型和耐药突变型混合感染，劣势型在混合群体中占10%即可检出；设计 出一种能在短时间内系统、全面的检测和分析乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试 剂盒。
目前耐药突变的检测方法主要有以下几种质谱分析，荧光偏振，PCR-肽核酸，限制性 片段长度多态方法RFLP，线性探针分析法，荧光定量PCR熔解曲线分析法和基因芯片技术。 然而，这些方法大多成本昂贵，操作繁琐，不利于广大基层医院开展。因此，本发明人在前 期的研究成果的基础上(CN200410052531.1)，结合半自动的结果判读系统，建立一种能够在 短时间内检测和分析乙型肝炎病毒多种核苷类似物药物耐受突变基因型的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉 及使用DNA反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和(或)核苷类似物耐 药相关突变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。
试剂盒的检测步骤如下(1)提供待检标本并从中提取DNA; (2)使用合成的特定寡核 苷酸引物，利用聚合酶链反应技术扩增包含目的基序的一段耙DNA序列；(3)使被标记的靶 DNA序列与特异性寡核苷酸探针杂交；(4)杂交膜条经显色后，扫描结果并用软件分析并判 断乙型肝炎病毒耐药突变的存在及其相对量。
为了达到上述检测步骤，本发明提供的乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂 盒的组分，包括(1)提取样本核酸的核酸抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂，阴、阳质控 品；(3)用于核酸杂交反应的核酸杂交试剂、杂交膜条，其中聚合酶链反应试剂由正向引物、 生物素标记的反向引物、脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、 耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)组成，其特征在于正向引物和生物素标记的反向引物的序列分别是
(1) 5'-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3， (SEQIDNO: 1)
(2) 5'-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3' (SEQIDNO: 2)
(3) 生物素-5，-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3， (SEQIDNO: 3)
(4) 5'-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA陽3， (SEQIDNO: 4)。 根据本发明的一个优选实施方案，所述引物为SEQIDNO: 1 4中15 28bp碱基范围内所
有可能的碱基长度和位置组合。
根据本发明的一个优选实施方案，杂交膜条中用于核酸杂交的5'端氨基标记的寡核苷酸 探针的序列分别是
(5 )丽2-5 ，-TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3 ，(SEQ ID NO: 5)
(6) NH2-5，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3，(SEQIDNO: 6)
(7) NH2-5，-CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3，(SEQIDNO: 7) (8 ) NH2-5 ，隱TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3 ， (SEQ ID NO: 8) (9 ) NH2-5 ， -GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3 ， (SEQ ID NO: 9)
(10)NH2-5，.-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO:10)
(11)NH2-5,-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY-3，(SEQ ID NO:11)
(12)NH2-5，.陽TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG陽3，(SEQ ID NO::12)
(13)NH2-5，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3' (SEQ ID NO:13)
(14)NH2-5，-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:14)
(15)NH2-5，-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT-3， (SEQ ID NO:15)
(16)NH2-5，隱GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY隱3， (SEQ ID NO:16)
(17)NH2-5，-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO:17)
(18)NH2-5，-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY-3' (SEQ ID NO:18)
(19)NH2-5'-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO::19)
(20)NH2-5'-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO:20)
(21)NH2-5，-CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:21)
(22)NH2-5，-CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3' (SEQ ID NO:22)
(23)NH2-5，-CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3' (SE(J ID NO:23)
(24)NH2-5，-GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3，(SEQ ID NO:24)
(25)NH2-5，-ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3， (SEQ ID NO:25)
以及5'端生物素标记和3'端氨基标记的用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是:
6(26)生物素-5'- GCCGTAACCGTCACAATCCGT -3'-NH2 (SEQ ID NO:26)。 根据本发明的一个优选实施方案，所述探针为SEQIDNO: 5-26中15 26bp碱基范围内
所有可能的碱基长度和位置组合。
根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待测样本指的是血清，血浆，腹水及肝
组织中乙型肝炎病毒的任何一种已知变异体或者野生型和变异型的组合，或者是多种变异型
的组合。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的提取样本核酸试剂是用3% 8%的聚乙二 醇和lmol/L的氯化钠配制而成的浓縮液和常规DNA提取液组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸杂交试剂由杂交液I (2X SSC-0.1%SDS)和II (0.5XSSC-0.1%SDS)、溶液I (250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲 和素溶液)、II (0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III (2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和IV (3%的 过氧化氢溶液)组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交膜条上所固定的探针能够检测乙型肝 炎病毒基因组逆转录酶基因野生型的位点包括rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl81A 、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233L、 rt236N和rt250M;突变型位点包括rtl73L、 rtl80M、 rtl81V 、 rtl81S 、 rtl84G、 rt2021、 rt204V/1、 rt233V、 rt236T和rt250V。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交膜条为尼龙膜或硝酸纤维素膜，杂交 是在恒温水浴装置中进行杂交反应，检测装置包括恒温水浴摇床或自动、半自动杂交仪。
由于本发明中增加了很多近期新发现的核苷类似物耐药相关突变位点，而且使这些位点 同时分布在一张检测膜条上，因此本发明的试剂盒不仅能用于检测单一乙型肝炎病毒感染， 更具有检测乙型肝炎病毒混合感染或多种联合突变的能力。另一方面，由于本发明的试剂盒 使用水浴摇床进行检测，其操作简单、通量大、价格低廉，半自动杂交装置方便快捷、效率 高、节省人力物力，两者均具有良好的应用前景和可推广性。特别是由于使用了设计严谨的 核酸探针，使得核苷类似物耐药的乙型肝炎病毒检测具有更好的灵敏度和特异性。
为了实现本发明，详细步骤分述如下 l.引物的设计和合成
为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的目的基因，我们从GeneBank中调A H型乙型肝 炎病毒全基因组DNA序列，针对乙型肝炎病毒逆转录酶基因在核苷酸类似物药物选择压力下易 于变异的位点，按照引物设计的一般性原则，采用primer premier5. 0和oligo6. 0软件分别设 计合成了巢式PCR所用的正向和反向引物，其中反向引物的5'端使用生物素标记。 (1) 5'-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3， (SEQIDNO: 1)(2) 5，-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3， (SEQIDNO: 2)
(3) 生物素-5,-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3， (SEQIDNO: 3)
(4) 5，-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3， (SEQIDNO: 4)。
2.探针的合成和标记
针对乙型肝炎病毒逆转录酶基因在核苷酸类似物药物选择压力下易于变异的位点，设计 并合成了21条探针和一条用于控制显色反应的显色探针(探针22， SEQID: 24)，以其作为对 照借以控制显色反应。为了保证各探针均能在同一温度下与特定的靶DNA成功地杂交，本发明 设计了多条简并探针并且使探针的Tm值和GC含量严格控制在特定范围内。合成的探针经20% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化后，用于后面的杂交反应。杂交反应中使用的寡核苷酸探针 分别是
(5) NH2-5,-TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3，(SEQIDNO: 5) (6 ) NH2-5 ，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT國3 ， (SEQ ID NO: 6)
(7 ) NH2-5 ，-CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO: 7) (8 ) NH2-5 ，-TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3' (SEQ ID NO: 8) (9 ) NH2-5，-GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3 ， (SEQ ID NO: 9)
(10)NH2-5，-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3， (SEQ ID NO:10)
(11)NH2-5，-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY-3，(SEQ ID NO:11)
(12)NH2-5，.-TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG-3，(SEQ ID NO::12)
(13)NH2-5，.-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3， (SEQ ID NO:13)
(14)NH2-5，.-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:14)
(15)NH2-5，.-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT-3, (SEQ ID NO:15)
(16)NH2-5，-GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY-3' (SEQ ID NO:16)
(17)NH2-5，.-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO:17)
(18)NH2-5，'-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY-3' (SEQ ID NO:18)
(19)NH2-5，-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO::19)
(20)NH2-5,-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA-3' (SEQ ID NO:20)
(21)NH2-5，-CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3' (SEQ ID NO:21)
(22)NH2-5，-CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3' (SEQ ID NO:22)
(23)NH2-5，-CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3' (SEQ ID NO:23)
(24)NH2-5，隱GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3,(SEQ ID NO:24)
(25)NH2-5，-ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3, (SEQ ID NO:25)以及5'端生物素标记和3'端氨基标记的用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针是
(26)生物素-5'- GCCGTAACCGTCACAATCCGT -3'-NH2 (SEQ ID NO:26)。
3. 杂交载体的制备
作为杂交载体的膜可以是由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等材料制成的膜，大小约为 3.2cmX2.5cm，并用打印机打成3行x8列的格式。膜条使用前用1(Fq的EDC (N-乙基-N， -[二甲 基氨丙基]-碳二亚胺)溶液充分浸泡活化处理。新合成的探针(100pmol/iU)经稀释后，按 每孔l. l在膜条的适当位置上以固定格式点样。点样后用NaOH溶液处理膜条并充分洗涤， 然后保存于-2(TC备用。
4. 核酸的提取
无菌采集待检乙型肝炎病人的静脉血约lml，分别于室温和4'C静置一段时间后，离心分 离并收集血清标本。然后从中取适量血清样品，向其中加入等量DNA提取液，充分混匀并在 沸水浴中放置10分钟，离心并收集上清液用于进一步PCR反应。
5. 核酸扩增体系的优化
为了进一步提高试剂盒的灵敏度、特异性和重复性，我们对聚合酶链反应所用引物进行 了反复设计和优选，对聚合酶链反应的体系进行了摸索与优化使之达到最佳的特异性与最高 的扩增效率。结果发现，该方法可以使低拷贝数的样品DNA得到有效的扩增，其检测下限达到 lxl03 5xl03IU/ml。同时，为了尽可能地减少污染，我们使用dUTP-UNG酶处理待检核酸。特 别是，我们调整了PCR扩增中使用的引物和其浓度，并调整和优化了Mg2+和模板等其他反应物 的浓度，也有利于防止和减少污染。
6. 核酸杂交体系的优化
核酸杂交的操作过程包括首先将如前制备的膜条放入编号好的15mlEP管中，然后对应 地加入PCR产物与杂交液I的混合物在一定温度下进行杂交。通过对杂交体系、杂交液的摸索， 使杂交反应达到最优化和最好的杂交效率。杂交完成后，经洗涤和显色步骤以显示杂交斑点 的存在，并根据所显色斑点所在位置探针的不同来判断样本的基因突变。实验证明本发明中 的检测试剂能检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药相关突变位点(rtl73、 rtl80和rt204)、阿德福 韦耐药相关突变位点(rtl81A、 rt233和rt236N)和恩替卡韦耐药相关突变位点(rtl84、 rt202 和rt250M)。同时，本发明也可检测出生物样本中是否存在乙型肝炎病毒。另外，在发明实施 过程中，通过摸索不同的杂交温度和探针浓度使检测的结果更准确可靠，并使之具有更好的 重复性。
综上所述，本发明的试剂盒主要用于检测和鉴别野生型和耐核苷类似物突变型乙型肝炎
病毒，借以判断乙型肝炎病毒对药物的耐受情况。整个检测过程包括提取血清样品中的HBVDNA、 PCR扩增包含HBVDNA聚合酶rtl73 rt250区域序列的耙DNA片断，以及PCR扩增产 物的杂交等主要步骤。为了完成这些步骤，本发明的试剂盒又可分为PCR反应试剂盒和反向 斑点杂交试剂盒两个部分。其中，前者包括核酸抽提试剂、聚合酶链反应试剂，阴、阳质控 品(野生型和耐核苷类似物突变型HBVDNA质粒)。后者包括核酸杂交试剂以及杂交膜。杂 交试剂主要为常规的20xSSC、十二烷基磺酸钠(SDS)、链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶结 合物(POD)、四甲基联苯胺(TMB)，试剂盒组成包括杂交液I (2xSSC-0.1%SDS)、杂交 液II (0.5xSSC-0.1% SDS)、溶液I (250u/mlPOD)、溶液II (O.lmol/L拧檬酸钠)、溶液III (2mg/mlTMB)、溶液IV (3%H202)，以及用作杂交反应载体的膜条。
图l显示所使用的探针在膜条上的排列图。rtl73V号探针具有SEQIDNO:5所示的序列， rtl80L号探针具有SEQIDNO: 6所示的序列，rtl81A号探针具有SEQ ID NO:7所示的序列， rtl84T号探针具有SEQ ID NO:8所示的序列，rt202S号探针具有SEQ ID NO:9所示的序列， rt204M号探针具有SEQ ID NO:10所示的序列，rt233I号探针具有SEQ ID NO:ll所示的序列， rtl73L号探针具有SEQ IDNO:12所示的序列，rtl80M号探针具有SEQ ID NO:13所示的序列， rtl81T号探针具有SEQ ID NO:14所示的序列，rtl84G号探针具有SEQ ID NO:15所示的序列， rt202I号探针具有SEQ ID NO:16所示的序列，rt204I号探针具有SEQ ID NO:17所示的序列， rt233V号探针具有SEQ ID NO:18所示的序列，rt236N号探针具有SEQ ID NO:19所示的序列， rt236T号探针具有SEQ ID NO:20所示的序列，rtl81S号探针具有SEQ ID NO:21所示的序列， rt250M号探针具有SEQIDNO:22所示的序列，rt250V号探针具有SEQ ID NO:23所示的序列， rt204V号探针具有SEQIDNO:24所示的序列，阳性控制探针(P.C)具有SEQ ID NO:25所示的 序列，显色对照探针(C.C)具有SEQ IDNO:26所示的序列。
图2显示靶DNA扩增片段经2。/。的琼脂糖凝胶电泳图。其中第l-6泳道为从乙型肝炎病毒 临床样本中扩增出的特异性靶DNA片段；第7为阴性对照。
图3显示六种不同的HBV基因型血清样品反向斑点杂交检测结果。其中A:野生型；B:
rt204 I突变；C: rt204V突变；D: rtl81T和rt236T突变；E: rt236T突变；F: rtl80M、 rt202 I 和rt204V突变。
图4为乙型肝炎病毒野生型和耐药突变型混合感染模拟实验及其灵敏度的确定。
具体实施例方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例l:血清DNA的提取
无菌采集待检乙型肝炎病人的静脉血约1 ml，分别于室温和4。C静置2小时和1小时后， 离心(8,000 rpm， 5分钟)分离并收集血清标本200 pl。然后从中取血清样品40 pl，向其中 加入等量DNA提取液，充分混匀并在沸水浴中放置10分钟。为了保证血清内所含的病毒颗 粒能够被充分裂解，进一步将此混合物于4'C下继续静置10小时。然后离心(10,000rpm， 5 分钟)并收集上清液2pl并将其用于进一步PCR反应。
实施例2:包含HBV DNA聚合酶rtl73 rt250区域序列的靶DNA片断的巢式PCR扩增。
取单管单人份PCR反应液若干管，每管直接加入2 pl模板(或阴阳性标准品)，充分混匀 后瞬时(3秒)离心。然后将各反应管放入PCR仪，5(TC预处理3分钟，按下列条件扩增93°C 5分钟，然后按93。C 30秒，68°C l分钟，共25个循环，然后按93。C 30秒，55。C30秒，72°C 45 秒，共30个循环，最后72'C延伸7分钟。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测(参见附图2)。 所使用的PCR扩增体系包括lx定性PCR缓冲液、0.2mMdNTPs、 6UTaq酶、0.1 pmol引物l、 引物4(SEQIDNO:1,4)禾口0.3 pmol引物2、引物3(SEQ ID NO:2，3)。
实施例3:采用水浴杂交法对三种基因型的样品进行反向斑点杂交检测
杂交前，将水浴摇床(或水浴锅)温度调到杂交温度，取杂交液I (2xSSC-0.1%SDS) 与杂交液II预热至40 5(TC备用。根据待检样品的数目取若干个15ml离心管，各管分别加入 8-10ml杂交液I并预加热至40 50。C。然后取1000 pl杂交液I +2 pl溶液I (1000: 2)混合溶 液作为结合液4"保存备用，并取溶液II:溶液III:溶液IV (1900: 200: 1)的混合物(1.9 ml 溶液II +0.2 ml溶液III+l pl溶液IV )作为显色液避光保存备用。
首先将预热的杂交液I加入管中直至没过膜条，按膜条对应编号加入PCR产物，盖紧后 放入水浴摇床上用中等转速杂交40 50min;接着用镊子取出膜条放入50ml洗涤管中，用预 热的杂交液II洗3次，每次3 5分钟，40 50。C在水浴摇床内进行洗脱；然后加入结合液在 常温(20 30°C)下使用生化摇摆仪进行结合操作；结合过后，用常温(20 30°C)杂交液 I生化摇摆仪上洗脱3次，每次1 3分钟；洗脱完成后控干残余液体加溶液II在生化摇摆仪 上预显色2min;最后加入显色液显色5 8分钟，显色完成后倒掉显色液并加一定量溶液II 终止5min，再用纯水30ml洗两次即完成了杂交全过程。杂交结果采用扫描仪扫描后以JPEG 格式保存。
实施例4:本发明试剂盒的结果判定
结果的判定原则是，用于监测杂交过程的显色对照探针(SEQIDNO:26)应在所有的检测
中都显色。如rt204M位点(SEQ ID NO:IO)、 rt204 I位点(SEQ ID NO:17)、 rt204V位点(SEQ
IDNO:24)出现单一显色，则分别表示样品中有YMDD野生型、YIDD突变型、YVDD单一突变型HBV DNA的存在；如果rt204M位点(SEQ ID NO:IO)和rt204 I位点(SEQ ID NO:17) 探针同时显色，则表明样品中存在YMDD野生型和YIDD突变型混合感染；如rt204M位点 (SEQ ID NO:IO)和rt204V位点(SEQ ID NO:24)探针同时显色，则表明样品中存在YMDD 野生型和YVDD突变型混合感染；如rt204 I位点(SEQ ID N0:17)和rt204V位点(SEQ ID NO:24)探针同时显色，则表明样品中存在YVDD和YIDD两种突变型HBV的混合感染； 如rt204M位点(SEQ ID NO:IO)、rt204 I位点(SEQ ID N0:17)和rt204V位点(SEQ ID NO:24) 三种探针同时显色，即表明样品中同时存在YMDD野生型、YIDD和YVDD突变型HBV的 混合感染。
本试剂盒的发明可为临床核苷类似物用药方案的制定提供科学的、个体化的分子生物学 实验数据，为乙肝病人的治疗提供可靠的分子病毒学证据。如果病人血清中出现某种耐药突 变型病毒，则要立即减少该种核苷类似物的用量甚至停药，改用其他药物治疗，避免浪费人 力物力，也避免延误病情和治疗而产生不必要的后果。本发明的结果判读部分情况如下
1、 阳性控制探针、显色对照探针(SEQIDNO:25、 26)和探针rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 19、 22)显色判定为HBV野生型感染；
2、 阳性控制探针、显色对照探针(SEQIDNO:25、 26)和探针rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt2041、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SE(^IDNO:5、 6、 7、 8、 9、 11、 17、 19、 22)显色判定为rt204 I突变，对拉米夫定耐药；
3、 阳性控制探针、显色对照探针(SEQIDNO:25、 26)和探针rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204V、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 7、 8、 9、 17、 19、 22、 24)显色判定为rt204V突变，对拉米夫定耐药；
4、 阳性控制探针、显色对照探针(SEQIDNO:25、 26)和探针rtl73V、 rtl80L、 rtl81T、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 8、 9、 10、 11、 20、 22)显色判定为rtl81T和rt236T突变，对阿德福韦耐药；
5、 阳性控制探针、显色对照探针(SEQIDNO:25、 26)和探针rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M (SEQIDNO:5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 20、 22)显色判定为rt236T突变，对阿德福韦耐药；
6、 阳性控制探针、显色对照探针(SEQIDNO:25、 26)和探针rtl73V、 rtl80M、 rtl81A、 rtl84T、 rt2021、 rt2041、 rt233 I、 rt236N、 rt250M (SEQIDNO:5、 7、 8、 11、 13、 16、 17、 19、 22)显色判定为rtl80M、 rt202 I和rt204V突变，对拉米夫定或恩替卡韦耐药；(参见表l 和附图3)表l HBV不同型别感染及对应的耐药情况
样品号探针组合病毒感染情况
1rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rt184T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236N、 rt250M 、阳性控制探针、显色对照探针YMDD感染 (野生型)
2rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt2041、 rt233 I、 rt236N、 rt250M 、阳性控制探针、显色对照探针YIDD感染 (LAM耐药)
3rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204V、 rt233 1、 rt236N、 rt250M、阳性控制探针、显色对照探针YVDD感染 (LAM耐药)
4rtl73V、 rtl80L、 rtl81T、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M、阳性控制探针、显色对照探针ADV耐药相关突变 (rtl81T+rt236T)
5rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233 I、 rt236T、 rt250M、阳性控制探针、显色对照探针ADV耐药相关突变 (rt236T)
6rtl73V、 rtl80M、 rtl81A、 rtl84T、 rt202 I、 rt204 I、 rt233 I、 rt236N、 rt250M、阳性控制探针、显色对照探针ETV耐药相关突变 (rtl80M+rt202 I+rt204 I)
实施例5:乙型肝炎病毒野生型和耐药突变型混合感染模拟实验及其灵敏度的确定。
乙型肝炎病毒的耐药性是在药物和人体免疫选择压力的持续作用下逐渐产生并逐步发展 变化的， 一般有从少到多，从劣势变为优势的逐步转化过程，因此，对乙型肝炎病毒基因组 的检测与监控就需要对病毒野生型和耐药突变型混合感染有较好的检测与分辨能力，才能动 态的反映病毒耐药的发生、发展以及病情归转过程，为临床进一步了解与研究病毒耐药产生、 发展和及时控制患者病情发展产生积极影响，同时对临床准确有效用药有重要指导意义。
选取YMDD、 YIDD和YVDD型别血清样本(已稀释至Ul()4copy/ml)各一管，YMDD与YIDD 为A组，YMDD与YVDD为B组，分别按照l: 9， 2: 8， 3: 7， 4: 6， 5: 5， 6: 4， 7: 3， 8:
2， 9: l的比例混合，然后抽提DNA、 PCR以及RDB。实验证明，本发明的野生型和突变型混 合感染检测下限均为10% (见附图4)。
实施例6:杂交探针序列的确定，本发明中探针的序列为15 26碱基左右，其长度与杂交信号 的强度相关，其Tm值和杂交温度相关。在所列21条探针中(SEQIDNO:5 26)的序列范围 内，所选取的不同长度探针序列的组合均能产生较好的杂交信号和区分鉴别能力。如在发明 实施过程中，三条探针(SEQIDNO: 10,17,24)的序列为如下序列时，杂交反应在55度时能 产生很好的信号和区分能力。
NH2-5，-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3， (SEQ ID NO: 10) NH2-5 ， -GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO: 17) 丽2-5，-GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3，(SEQ ID NO: 24)
13在5'端去掉5个碱基，在3'端去掉5个碱基或者在5'端去掉两个碱基，3'端去掉3个碱基；这三 种序列的探针在42度杂交时均能产生很好的信号和野生及突变的鉴别能力。序列表
<no>中山大学达安基因股份有限公司
<120> —种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒
<140> <141> <160> 26
<210> 1 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 1
tagactcgtggtggacttctctcarttt
<210>2 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 2
tggatgtrtctgcggcgttt
<210>3 <211> 18 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 3
gccttrtaagttggcgag
<210>4 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 4
cgacgtgcagaggtgaagcgaagtgca<210>5 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 5
twcctatgggagtgggcctcagyccg
<210>6 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 6
gyccgtttctcytggctcagtttact
<210>7 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 7
cgtttctchtggctcagtttactwgy
<210>8 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 8
tggctcagtttactwgygcmatttgt
<210>9 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 9
gyytggctttyagttatatkgatgay<210> 10 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 10
gctttyagytatatggatgatstggt
<210> 11 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 11
trtctbtgggyatmcatttraaymcy
<210> 12 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 12
twcctatgggattgggcctcagyccg
<210> 13 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 13
gyccgtttctcytggctcagtttact
<210> 14 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 14
cgtttctchtgactcagtttactwgy <210> 15<211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 15
tggctcagtttggtwgygcmatttgt
<210> ]6 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 16
gyytggctttyatttatatkgatgay
<210> 17 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 17
gctttyagytatathgatgatstggt
<210> 18 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 18
trtctbtgggygtgcatttraaymcy
<210> 19 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 19
tctbtgggyaaycatttraaycctma
<210> 20 <211>26<212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 20
tctbtgggyacmcatttraaycctma
<210>21 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 21
cgtttctchtgattcagtttactwgy
<210>22 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 22
cccttaayttyatggghtayrtnaty
<210> 23 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 23
cccttaayttygtggghtayrtnaty
<210> 24 <211>26 <22>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 24
gctttyagytatgtggatgatstggt
<210>25 <211>26 <212>DNA<213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 25
attgttcagtggttcgtagggctttc
<210>26 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。 <400> 26
gccgtaaccgtcacaatccgt
权利要求
1、一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，该试剂盒包括提取样本核酸的核酸抽提试剂，聚合酶链反应试剂，阴、阳质控品，用于核酸杂交反应的核酸杂交试剂、杂交膜条，其中聚合酶链反应试剂由正向引物、生物素标记的反向引物、含脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的脱氧核糖核苷三磷酸、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶组成，其特征在于正向引物和生物素标记的反向引物的序列分别是1)5’-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3’2)5’-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3’3)生物素-5’-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3’4)5’-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3’引物序列为15～28bp碱基范围内所有可能的碱基长度和位置组合。
2、根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于杂交膜条中用于核酸杂交的5'端氨基标记的 寡核苷酸探针的序列分别是5) NH2-5' -TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3'6) NH2-5' -GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3，7) NH2-5， -CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3，8) NH2-5，—-TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3'9) NH2-5，--GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3'10)NH2-5，-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT--3，11)NH2-5，-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY--3，12)NH2-5，-TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG--3，13)NH2-5'-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT--3，14)NH2-5，-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY--3，15)NH2-5，-TGGCTCAGTTTGGTWGYGCMATTTGT--3，16)NH2-5，-GYYTGGCTTTYATTTATATKGATGAY--3，17)NH2-5'-GCTTTYAGYTATATHGATGATSTGGT--3'18)NH厂5，-TRTCTBTGGGYGTGCATTTRAAYMCY--3'19)NH2-5，-TCTBTGGGYAAYCATTTRAAYCCTMA--3，20)NH2-5，-TCTBTGGGYACMCATTTRAAYCCTMA--3，21) NH2-5， -CGTTTCTCHTGATTCAGTTTACTWGY-3'22) NH2-5， -CCCTTAAYTTYATGGGHTAYRTNATY-3，23) NH厂5， -CCCTTAAYTTYGTGGGHTAYRTNATY-3，24) NH2-5， -GCTTTYAGYTATGTGGATGATSTGGT-3'25) NH2-5， -ATTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC-3，以及5'端生物素标记和3'端氨基标记的用于监测杂交过程的显色对照寡核苷酸探针的序 列是生物素_5'- GCCGTAACCGTCACAATCCGT -3'-NH2 ，探针为15 26bp碱基范围内所有可能 的碱基长度和位置组合。
3、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于核酸提取试剂是由用3% 8%的聚乙二醇和 lmol/L的氯化钠配制而成的浓縮液和常规DNA提取液组成。
4、 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于核酸杂交试剂中杂交液I为2XSSC-0. 1%SDS， 杂交液II为0. 5XSSC-0. 1%SDS、溶液I为250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液、 溶液II为0. lmol/L的柠檬酸钠溶液、溶液III为2mg/ml的四甲基联苯胺溶液、溶液IV为3% 的过氧化氢溶液。
5、 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交膜为尼龙膜或硝酸纤维素膜。
6、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于野生型乙型肝炎病毒检测位点包括rtl73V、 rtl80L、 rtl81A、 rtl84T、 rt202S、 rt204M、 rt233L、 rt236N和rt250M。
7、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于耐药突变型乙型肝炎病毒检测位点包括 rtV173L、 rtL180M、 rtA181V、 rtA181S、 rtT184G、 rtS2021、 rtM204V/1、 rtl233V、 rtN238T 和rtM250V单个氨基酸变异中的一种或几种。
全文摘要
本发明涉及一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉及使用DNA反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和(或)核苷类似物耐药相关突变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。
文档编号C12Q1/70GK101565756SQ20081002765
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者何蕴韶, 周新宇, 张太松, 明 李, 董瑞华, 娟 陈 申请人:中山大学达安基因股份有限公司