一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的试剂盒及检测方法

专利名称：一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，涉及乙型肝炎病毒基因的突变耐药检测，特别涉及一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
全世界约有三分之一的人口感染过乙肝病毒(HBV)。近些年，随着乙型肝炎疫苗计划的实施，世界范围内的乙肝表面抗原这一血清学慢性感染标志物检出率已经明显降低。 但是，目前仍约有3. 5亿人为慢性HBV感染者，这些患者有患慢性肝病、肝硬化和肝癌的风险。抗病毒治疗是控制和预防慢性乙肝病毒感染进展的唯一选择。目前，我国有多种药物获批用于治疗慢性乙型肝炎。从广义上讲，这些药物可分为两类细胞因子和核苷酸类似物。干扰素是一种自然发生的细胞因子，具有抗病毒和免疫调节的作用，也是第一种批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物。干扰素对大约三分之一的患者有效，且需通过皮下注射进行，由于有很多的不良反应，需在治疗期间进行观察。核苷类似物针对乙肝病毒逆转录酶和乙肝病毒复制，是有效的抑制剂。他们的优势在于口服药和相对较少的不良反应。然而，他们必须长期服用才具疗效，耐药性的发生是限制其长期应用的一个主要方面。关于耐药性产生的机制和及时有效诊断的研究，对于合理的药物设计和耐药病人的管理显得尤为重要。譬如，拉米夫定作为治疗乙肝的一线药物，具有非常好的抗病毒治疗效果。但随着治疗时间的延长，在抗病毒治疗药物的选择性压力下，对药物敏感的野生株被抑制，而耐药株因对药物不敏感而成为优势病毒株。例如服用拉米夫定治疗期间，在选择性压力下出现DNA聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基因序列变异，使其编码的 204位蛋氨酸(M)突变为缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)，即常说的YVDD和YIDD变异。这两种变异均导致拉米夫定与HBV DNA聚合酶的亲合力下降或消失，HBV对其敏感性降低上千倍。 若不及时诊断并进行合理治疗，将导致治疗的失败。然而目前只有YMDD耐药突变的实时荧光定量PCR检测技术应用于临床进行定性检测，此方法对耐药检测由于设计复杂且通量较小，并且依赖昂贵的一起，目前只能在良好的实验室条件下完成，没有快速、准确、大通量的对乙型肝炎病毒基因突变耐药检测的合适方法，对乙型肝炎的早期治疗造成了一定程度上的延误。

发明内容
本发明解决的问题在于提供一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测试剂盒及检测方法，以基因芯片为基础进行通量检测，实现了高特异性且快速的对乙型肝炎病毒的突变检测。本发明是通过以下技术方案来实现一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的试剂盒，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的P区引物对、表面固定有耐药检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；所述的P区引物对的5、端增加生物素标记；所述的耐药检测探针包括针对一个或多个乙型肝炎病毒耐药突变的耐药检测探针，其长度为15 25nt，其中针对检测突变位点设置在耐药检测探针5、端5nt之后，并在耐药检测探针5、端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；所述的显色试剂包括含亲和素-碱性磷酸酶的亲和反应液和含NBT/BCIP的显色反应液。所述的P区引物对所扩增的片段长度不超过IOOObp ；在检测探针上还加入PNA、 LNA或硫基提高检测特异性的修饰。所述的耐药检测探针包括以下一种或几种检测探针针对拉米夫定耐药突变检测位点rtL180M的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 1所示；针对拉米夫定耐药突变检测位点rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 2所示；针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 3所示；针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtN236T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 4所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtI169T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如 SEQ ID NO 5 所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtS202I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如 SEQ ID NO 6 所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO 7所示。所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5、端还被生物素标记。所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在耐药检测探针5、端进行polyT、 polyC、polyT+polyC 或 spacer 6 15C 序列的延长修饰；所述的固相检测阵列的载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，耐药检测探针5、 端的辅助固定修饰为在耐药检测探针5、最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。所述的亲和反应液组成为ImL ddH20和2 μ 1亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为ImL显色缓冲液、6. 5 μ INBT和3. 5 μ 1 BCIP0一种基于上述试剂盒的乙型肝炎病毒耐药突变检测方法，包括以下步骤1)以包含待测乙型肝炎病毒基因组的DNA为模板，以引物对为扩增引物，进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)将PCR扩增产物进行变性处理后，置于固相载体上核酸扩增反应体系中，然后再加入固相检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为A 在不低于探针Tm值5°C 的温度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循环数至少大于1 ；最后72°C延伸至少3min ；3)固相核酸扩增完成后，取出固相检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用亲和反应液覆盖固相检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH20冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色反应液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH20终止反应；6)显色斑点所对应的检测结果即为所检测的乙型肝炎病毒基因野生型检测位点并未发生突变，根据显色斑点与突变检测探针所针对的基因突变位点，判定乙型肝炎病毒突变情况。所述的固相检测阵列在使用前还在体积浓度为2% 5%的BSA中37°C封闭至少 15min。所述的变性处理为热变性处理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置 3min ；或者，所述的变性处理为碱变性处理将质量浓度10%的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1 10 20的体积比混合，放置至少;3min。所述的固相核酸扩增反应完成后，取出固相检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少Imin ；然后将固相检测阵列覆盖亲和反应液后37°C孵育至少 IOmin后，再依次放入洗脱液A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少Imin ；取出固相检测阵列用ddH20冲洗，最后覆盖显色反应液进行显色，至看到显色斑点后终止反应；所述的洗脱液A 的组成为 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；洗脱液 B 的组成为 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl0与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明提供的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测，是基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测，将检测探针固定在固相检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交， 当扩增的片段被检测探针识别后，能够进行序列的延长(固相核酸扩增)，使得被生物素标记的扩增片段固定在膜阵列上而不被洗脱，而不能被探针识别的序列，就不能进行序列的延长，不能通过检测探针被固定，进而被洗脱掉；这样通过设计多个检测探针呈矩阵式的分布，通过一次就可以检测出待检测基因位点的突变性质。本发明通过以基因芯片为基础、PCR反应技术为原理的高通量、高特异性、快速、并且易于推广的检测方法，通过在以硝酸纤维素膜为代表的固相介质上进行特异性探针引发的核酸扩增反应，结合反向斑点杂交技术，将携带生物素标记的靶序列与膜阵列上探针结合后，通过生物素-亲和素-碱性磷酸酶-BCIP/NBT反应，可以观察到明显蓝紫色斑点，从而进行肉眼判读。由于乙肝病毒的耐药突变种类较多，将其一一将对应的突变结合探针设计并进行染色判定比较困难，而且操作繁琐，很容易出错；因此，以野生型作为显色对照，如果待测样本在所检测的位点未发生突变，则相应的进行显色；那么，对其以多个野生型作为显色对照进行检测，就可以检测到其是否发生了耐药突变。本发明提供了 7种耐药检测探针，在进行检测时，阵列当中只有一种探针针显色， 进行结果指示，膜阵列中其他探针并无显色；这表明这几种耐药突变检测探针能够特异性的识别出待测乙肝基因组的突变类型，而且其结果准确可靠，彼此之间无杂交染色。
2、本发明提供的乙型肝炎病毒耐药突变的检测，检测准确性高包括通过特异性的探针设计、利用已经成熟PCR技术的退火温度以阻止非特异的结合、以及利用Taq酶
外切酶活性阻止错配之后的延伸，完全可以达到对核酸序列单碱基差异的良好分辨力，保障了检测的准确性；并且对实验室及仪器设备的要求不高在普通实验室PCR仪上即可完成整体实验，无需特殊和昂贵设备；操作简单；主要操作以PCR技术为核心，常规操作，成本低廉，易于推广。3、本发明提供的乙型肝炎病毒耐药突变的检测，针对乙型肝炎病毒基因P区进行，因为根据以往报道，该区的突变主要引起乙型肝炎病毒耐药性的产生。该方法检测结果可靠、精确；而且解决了现有方法的检测速度慢、分辨率不高、配套仪器昂贵、检测过程复杂等技术问题，可以显著的改善现有很少考虑乙型肝炎患者治疗前对耐药基因的检测，进而忽略了基因耐药而导致延误治疗的现况。4、本发明提供的乙型肝炎病毒耐药突变的检测，所提供的耐药突变检测探针能够灵活组合，以适应不同的检测人群和检测目的，有利于临床检验的灵活应用。


图1为扩增片段与固定在固相载体上的耐药检测探针结合、延伸、显色的程序示意图；其中①为硝酸纤维素膜，②为5、端延长修饰的ClO链，③为耐药检测探针，④为扩增片段靶序列互补区，⑤为Taq酶，⑥为生物素标记，⑦为亲和素-碱性磷酸酶，⑧为BCIP/NBT 显色；图2为乙型肝炎病毒耐药突变的检测特异性鉴定芯片阵列分布示意图；图3为乙型肝炎病毒耐药突变探针的特异性鉴定显色结果图；图3a 图3g分别为检出的 rtL180M，rtM204V/I，rtA181V/T，rtN236T、rtI169、rtS202I、rtM250V/I 的显色结^ ο
具体实施例方式下面结合具体的乙型肝炎病毒耐药突变的检测中检测片段的扩增和检测探针的设计，检测探针与固相载体的固定，检测探针与扩增片段在固相载体上杂交、扩增，对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。参见图1，基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，所提供的一种用于乙型肝炎病毒耐药突变的检测试剂盒，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因P区的引物对、表面固定有耐药检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂。根据文献报道的乙型肝炎耐药突变序列将P区基因区作为检测耐药突变区段，其扩增采用通常的PCR体外扩增，要求循环数25 40，扩增片段的长度建议不超过lOOObp， 而扩增引物对上亲和素的标记既可以在正向引物也可以在反向引物上，具体由待测的突变位点在扩增片段的位置关系来决定；检测探针的长度设计为15 25nt，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在5、端5nt之后。所述的耐药突变检测探针包括针对一个或多个乙型肝炎病毒耐药突变检测探针，其长度为15 25nt，在以下序列当中有下划线标注的位点为检测的野生型的特异性序列位点；针对拉米夫定耐药突变检测位点rtL180M的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 1所示；针对拉米夫定耐药突变检测位点rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 2所示；针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 3所示；针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtN236T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 4所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtI169T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如 SEQ ID NO 5 所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtS202I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如 SEQ ID NO 6 所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO 7所示。并且在其5、端添加pOlyT(10)+pOlyC(10)的修饰。在所提供的耐药突变检测探针中，每个突变点检测探针可以单独使用，也可以将几种探针混合后固定在同一个分布位点上。对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，阴性对照探针和阳性对照探针的序列设计可以相同或不相同，原则是其序列不能与扩增片段有交叉互补性。阳性对照探针的
端被生物素标记，能够被显色，用以监测显色系统是否正常；阴性对照探针用以监测杂交和固相核酸扩增的特异性。具体的对照探针的序列可以设计为P曰t生胃,吧·歹[J Biotin-acagcactaa ggcaagctat tctg ；阴性对照序列 acagcactaa ggcaagctat tctg。耐药检测探针5、端的修饰包括减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；其中减少空间位阻的序列延长修饰是出于减少核酸扩增错配和扩增后的序列与固相载体的附着、显色的考虑，包括polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6 15C等多种序列的延长修饰。端的辅助固定修饰一般与固相载体结合考虑，固相载体可以为硝酸纤维素膜、 尼龙膜或者载玻片，通过在检测探针的5、端添加氨基、巯基、羟基或醛基的辅助固定修饰与其固定，为了检测探针更好的固定和将来的显色效果，固相载体可以进行多种表面修饰。比如，以硝酸纤维素膜为固相载体，通过在SSC溶液中浸泡再烘干之后，可以使得显色斑点不扩散；通过检测探针5、端的羟基，经紫外光照后与硝酸纤维素膜固定。固相核酸扩增即检测探针与目的基因片段在固相载体上杂交、扩增，是探针特异性识别的核心，其中，扩增体系采用常规的PCR反应液，其独特之处就在于以包含检测位点的耐药检测探针作为引物，能够与目的基因互补杂交并进行核酸扩增，且通过检测探针被固定在固相载体上不被洗脱；同时，为了保证杂交的特异性，退火温度一般设置在不低于探针Tm值的5°C范围内。洗脱过程是为了将未与固相载体结合的扩增片段洗脱掉，洗脱液可以为一般常用的缓冲液，结合离心洗脱效果比较好。显色通过亲和素-碱性磷酸酶液+NBT/BCIP的显示方式，其优势在于底色不明显， 反应精确，结果容易判定，效果比较好；而且实现方便，亲和素-碱性磷酸酶液和NBT/BCIP 显色液均可采用现有的试剂盒。下面结合乙肝病毒的基因耐药检测过程，对试剂盒及其检测方法进行具体的说明1)检测用扩增产物的制备设计扩增引物对，并对反向扩增引物的5、端增加生物素(Biotin)标记，所设计的引物对P具体为正向弓丨物tgttcctgcg gtaaagta18;反向弓丨物:Biotin-tgtattccca tcccatca 18 ；人工合成7个检测位点的野生型序列用于耐药检测的靶序列，全长332bp，以这7 种野生型序列的DNA为模板，以引物对P为引物进行30个循环的PCR扩增，能够获得7种检测位点分别突变的长度为332bp的扩增片段。2)检测探针的设计与合成设计并人工合成了乙肝病毒HBV的7个耐药检测位点的检测探针，探针Tm值设计为45士 1°C，探针长度为13 15nt,同时在探针序列5、端进行加上polyT (Tltl) ,polyC (C10) 的序列延长修饰，进行减少空间位阻的延长修饰是为了利于靶序列与固定在基膜上的探针进行结合，具体的检测探针序列为SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 7所示；探针上检测多态性的位点设置均在探针5、端5nt之后。3)检测探针在检测阵列上的固定将硝酸纤维素膜在2 X SSC溶液(柠檬酸三钠15mM，氯化钠150mM，pH7. 0)中浸泡 30min后取出，在37°C孵箱内烘干2小时，再将耐药检测探针和对照探针用点膜仪喷涂至膜上(1滴500nl，间隔1mm，呈矩阵分布)，裁减至4mmX 6mm大小，将点完探针的硝酸纤维素膜放入80°C烘箱烘干30分钟，2Mnm波长紫外光照6分钟，通过紫外光照将探针与硝酸纤维素膜固定连接，得到固定有检测探针和对照探针的固相检测阵列。在干燥条件下，固相检测阵列可长期储备待用，使用前将该膜浸入2% BSA液37°C封闭15min。 检测阵列设计如图2分布图加其中①为阳性对照探针②为阴性对照探针，③ ⑥为rtL180M，rtM204V/I, rtA181V/T, rtN236T0图2b其中①为阳性对照探针②为阴性对照探针，③ ⑤为rt1169、rtS2021、 rtM250V/L·4)固相核酸扩增反应首先对第一步获得的基因扩增产物进行序号标记，然后对扩增产物进行热变性处理95°C水浴5min，然后冰上放置^iin ；再将变性后的扩增产物10 μ 1、PCR反应液(欣百诺公司，TagMixMaster) 20 μ UddH2O 10 μ 1放入干净的PCR反应管中混勻，将制备好的检测阵列放入，固相检测阵列的膜背面靠管壁，进行固相核酸扩增反应；设计反应程序:A :45°C退火30s ；B :72°C延伸30s ；A-B循环数为10 ；最后72°C延伸3min。其中检测对象是扩增的7种位点未突变的P区基因序列。5)洗脱与显色固相PCR反应完成后，取出检测阵列进行洗脱，将未与检测阵列固定的片段洗脱掉，全部洗脱过程均在37°C条件下完成，具体为将检测阵列取出，放入洗脱液A(100mmol/LpH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和4mmol/L Mg2Cl)中离心洗脱(转速为30rpm，洗脱lmin)，取出检测阵列后，用碱性磷酸酯酶标记的亲和反应液(ImL ddH20和2 μ 1亲和素-碱性磷酸酶液，购自碧云天公司，碱性磷酸酯酶标记为Sti^ptavidin)覆盖后，37°C条件下孵育IOmin ；孵育完成后将检测阵列放入干净的洗脱液A进行洗脱(转速30rpm，洗脱lmin)，取出后再放入洗脱液B(100mmOl/L pH =9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 禾口 4mmol/L Mg2Cl)中，再离心洗脱(转速 30rpm，洗脱 lmin)；取出检测阵列，用清水对膜块表面冲洗，并利用吸水纸去除膜块上的液体，将膜块覆盖显色反应液(ImL显色缓冲液、6. 5μ INBT和3. 5μ 1 BCIP，购自碧云天公司，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒)，30秒后肉眼可看到斑点后，即用清水中止反应。6)突变检测分析乙型肝炎病毒耐药突变检测显色结果图如图3所示，其中①为阳性对照，②为阴性对照，可以看到被生物素标记的阳性对照均正常显色，说明显色系统工作正常；阴性对照不显色，说明固相扩增的特异性好，没有非特异性杂交和核酸扩增。图3a 图3d中均只有 ③、④、⑤、⑥当中的一个位点、图!Be 图3g中均只有③、④、⑤当中的一个位点，所固定的检测探针中分别与相应的HBV基因未突变靶序列特异结合并显色，阵列当中只有一种探针针对待测的某种未发生耐药突变乙肝病毒显色，进行结果指示，膜阵列中其他探针并无显色；这表明这七种耐药突变检测探针能够特异性的识别出待测乙肝基因组的未突变类型， 相应的一旦突变即不产生斑点，而且其结果准确可靠，彼此之间无杂交染色。结合以上阵列的检测结果，本发明所提供的HBV耐药突变检测探针被固定形成阵列分布的检测阵列后，每种检测探针均能针对待测的某种耐药突变乙肝病毒显色，进行结果指示，其显色明显、结果准确可靠。准确性和重复性考证对四种HBV 耐药突变类型 rtL180M，rtM204V/I, rtA181V/T, rtN236T 各 25 例中国乙型肝炎病毒耐药患者的血清中HBV扩增产物进行测序，再同上述方法检测结果进行比对，该方法检测准确率为99%。其中2例误检因在设计探针的位点旁边碱基产生突变引起。
权利要求
1.一种用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的P区引物对、表面固定有耐药检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；所述的P区引物对的5、端增加生物素标记；所述的耐药检测探针包括针对一个或多个乙型肝炎病毒耐药突变的耐药检测探针，其长度为15 25nt，其中针对检测突变位点设置在耐药检测探针5、端5nt之后，并在耐药检测探针5、端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；所述的显色试剂包括含亲和素-碱性磷酸酶的亲和反应液和含NBT/BCIP的显色反应液。
2.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的P 区引物对所扩增的片段长度不超过IOOObp ；在检测探针上还加入PNA、LNA或硫基提高检测特异性的修饰。
3.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耐药检测探针包括以下一种或几种检测探针针对拉米夫定耐药突变检测位点rtL180M的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如 SEQ ID NO 1 所示；针对拉米夫定耐药突变检测位点rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如 SEQ ID NO 2 所示；针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO 3所示；针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtN236T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如 SEQ ID NO 4 所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtI169T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO 5 所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtS202I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO 6 所示；针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如 SEQ ID NO 7 所示。
4.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5、端还被生物素标记。
5.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在耐药检测探针5、端进行p0lyT、p0lyC、 polyT+polyC或spacer 6 15C序列的延长修饰；所述的固相检测阵列的载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，耐药检测探针5、端的辅助固定修饰为在耐药检测探针5、最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。
6.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的亲和反应液组成为ImL ddH20和2 μ 1亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为ImL显色缓冲液、6. 5 μ INBT 禾口 3. 5 μ 1 BCIP0
7.一种基于权利要求1所述的检测试剂盒的乙型肝炎病毒耐药突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)以包含待测乙型肝炎病毒基因组的DNA为模板，以引物对为扩增引物，进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)将PCR扩增产物进行变性处理后，置于固相载体上核酸扩增反应体系中，然后再加入固相检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为A:在不低于探针Tm值5°C的温度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循环数至少大于1 ；最后72°C延伸至少^iin ；3)固相核酸扩增完成后，取出固相检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用亲和反应液覆盖固相检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH20冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色反应液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH20终止反应；4)显色斑点所对应的检测结果即为所检测的乙型肝炎病毒基因野生型检测位点并未发生突变，根据显色斑点与突变检测探针所针对的基因突变位点，判定乙型肝炎病毒突变情况。
8.如权利要求7所述的乙型肝炎病毒耐药突变检测方法，其特征在于，所述的固相检测阵列在使用前还在体积浓度为20Z0 5%的BSA中37°C封闭至少15min。
9.如权利要求7所述的乙型肝炎病毒耐药突变检测方法，其特征在于，所述的变性处理为热变性处理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置^iin ；或者，所述的变性处理为碱变性处理将质量浓度10%的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1 10 20的体积比混合，放置至少;3min。
10.如权利要求7所述的乙型肝炎病毒耐药突变检测方法，其特征在于，所述的固相核酸扩增反应完成后，取出固相检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少 Imin ；然后将固相检测阵列覆盖亲和反应液后37°C孵育至少IOmin后，再依次放入洗脱液 A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少Imin ；取出固相检测阵列用ddH20冲洗，最后覆盖显色反应液进行显色，至看到显色斑点后终止反应；所述的洗脱液 A 的组成为 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/ L Mg2Cl ；洗脱液 B 的组成为 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl。
全文摘要
本发明公开了一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因P区的引物对、表面固定有耐药检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂。本发明通过以基因芯片为基础，PCR反应技术为原理的高通量、高特异性、快速、且易于推广的检测方法，将检测探针固定在检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，当目的片段被固相载体上的探针识别后，能够进行核酸序列的合成延长，使得被生物素标记的扩增片段固定在检测阵列上而不被洗脱，进而显色显示，就可以检测出待检测乙肝病毒的耐药突变产生情况。
文档编号C12Q1/68GK102230025SQ20111015283
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者刘永兰, 包晗, 梁平, 汪钦, 王伟, 王伟华, 郭晏海, 颜真 申请人:中国人民解放军第四军医大学