一种基因定点多位点突变的方法
【专利说明】一种基因定点多位点突变的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基因定点多位点突变的方法。 【【背景技术】】
[0002] 基因突变是指个别dNMP(脱氧单磷酸核苷）残基以至片段DNA在结构、复制或表 型功能的异常变化，也称为DNA损伤。体外定点突变技术是当前生物，医学各领域中的一个 重要实验手段，多运用于改造，优化目的基因，探索启动子的调节位点的有效手段，也是研 究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。并且基因突变是生物变异的根本来源， 为生物的进化提供了原材料。基因重组可以产生多种多样的基因组合的子代，其中一些子 代会含有适应某种环境变化的基因组合，所以说基因重组是生物变异的来源之一，是形成 生物多样性的重要原因。因此，我们对基因突变的研究具有重大意义。
[0003] 同源重组是目前进行基因突变的重要手段。同源重组是指发生在同一染色体等染 色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。近年来PCR同源重组克隆法 被愈来愈受重视，该方法不受载体和目的片段的酶切位点限制，通过重组酶直接运用同源 重组的方法完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定 向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短和传统方法相比，具有快速，效率高的特点。
[0004] 目前的基因重组一般需要重组酶的作用。但是重组酶纯化的过程比较复杂，不耐 高温，在运送和保存方法要求也比较高。我们的方法将用非特异性结合蛋白HU在基因重组 过程中取代重组酶。HU是与DNA非特异结合的类似组蛋白的耐热的小分子蛋白质。HU是 由两个同源亚基HupA和HupB组成，是最保守的核酸结合蛋白，可非特异性结合双链DNA。 HU蛋白不但能像结合单链DNA的SSB蛋白一样与单链DNA结合，同时还能结合双链的DNA。 而来源于大肠杆菌菌株U93的组蛋白样蛋白（HU)，作为一种与DNA非特异性结合的蛋白， 在细菌染色体的压缩和排列过程中扮演了重要角色。它除了维持DNA的超螺旋和压缩状态 外，还能对DNA的结构起到一些特殊作用，如DNA的弯曲、基因转录调控、起始于复制原点的 复制、核蛋白复合物在装配时所需的位点特异性重组反应，以及通过蛋白质-RNA相互作用 控制的翻译起始等。 【
【发明内容】
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[0005] 本发明要解决的技术问题，在于提供一种基因定点多位点突变的方法，其利用和 非特异性DNA结合的蛋白HU取代重组酶从而将几个片段无缝拼接，以实现定点多位点的突 变。
[0006] 本发明是这样实现的：
[0007] -种基因定点多位点突变的方法，所述方法步骤如下：
[0008] 根据基因定点突变的碱基位置设计包含突变位点的引物，即通过引物设计在重叠 区域引入突变位点；然后利用PCR扩增，制备包含突变位点的PCR片段；最后利用和非特异 性DNA结合的蛋白HU连接DNA片段和克隆载体。
[0009] 本发明具有如下优点：
[0010] 本发明在大肠杆菌中连接DNA片段和克隆载体时，利用含有和DNA非特异性结合 的蛋白HU取代重组酶，从而将几个片段无缝拼接，以实现多位点的突变，该方法成本低，操 作过程较为简单。 【【附图说明】】
[0011] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0012] 图1为本发明实施例的HU蛋白SDS-PAGE电泳检测图。
[0013] 图2-1为本发明实施例环状的双链DNA作为底物的HU蛋白活性电泳检测图。
[0014] 图2-2为本发明实施例双链线性DNA作为底物的HU蛋白活性电泳检测图。
[0015] 图2-3为本发明实施例单链线性DNA作为底物的HU蛋白活性电泳检测图。
[0016] 图3为本发明实施例的分段PCR电泳检测结果图。
[0017] 图4为本发明实施例的整段PCR电泳检测结果图。
[0018] 图5为本发明实施例的克隆转化结果图。
[0019] 图6-1为本发明实施例的cpl-3基因序列比对结果图。
[0020] 图6-2为本发明实施例的cpl-9基因序列比对结果图。
[0021] 图6-3为本发明实施例的cpl-10基因序列比对结果图。 【【具体实施方式】】
[0022] 请参阅图1~6所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
[0023] 本发明所涉及的一种基因定点多位点突变的方法，所述方法步骤如下：根据基因 定点突变的碱基位置设计包含突变位点的引物，即通过引物设计在重叠区域引入突变位 点；然后利用PCR扩增，制备包含突变位点的PCR片段，即通过PCR的方法对该位点进行修 正；最后利用和非特异性DNA结合的蛋白HU连接DNA片段和克隆载体，即利用和非特异性 DNA结合的蛋白HU取代重组酶，进行基因重组，将片段连接起来，从而实现片段内基因的定 点多位点突变。
[0024] 以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0025] 实施例一：
[0026] UHU蛋白的制备
[0027] I. 1)将来源于大肠杆菌的HU-α或HU-β亚基或者是HU-α和HU-β的二聚体分 别插入ΡΕΤ22表达载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重 组表达载体pET22-Hu_a或者 ΡΕΤ22-Ηιι_β或者是Hu-α和Hu-β的二聚体；
[0028] 1.2)使用大肠杆菌感受态细胞BL21对构建好的重组载体pET22-HU_a或者 ρΕΤ22-Ηυ-β或者是HU-a和HU-β的二聚体进行转化，取含重组质粒的阳性菌株加入LB 液体培养基中培养过夜，之后菌液按1 %比例接种到50ml的LB培养液中，放入37°C摇床培 养至其OD值为0. 6~0. 8 ;加入IPTG，将菌液放入37°C摇床中诱导表达3. 5h ;
[0029] 1. 3)取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS-PAGE电 泳检测蛋白表达情况，结果如图1(图1中：M是蛋白分子量Marker ;M左侧为待检测蛋白的 电泳条带）所示的蛋白为水溶性的、且大小正确即10. 5kDa，从而筛选到所释放的蛋白为水 溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株；
[0030] 1.4)对该蛋白进行纯化。利用上述操作（1.2)与（1.3)的操作培养获得大量 所需阳性菌株，菌液经3000Xg离心15min，收集大肠杆菌菌体，于-70°C冷冻放置过夜， 备用；将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液（组分为：〇. 05M Tris、0. 2M氯化钠、 0.0 lM EDTAUO% V/v甘油、pH 7. 5)，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000 Xg离心15min， 于上清液中加入10%终浓度0. 35%的PEI和终浓度0. 75M的NaCl，4°C放置至核酸沉淀， 之后17000Xg离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50%，在4°C放置 lh，接着17000Xg离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000Xg离 心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液（组分：0. 02M Tris、0.0 OlM EDTA、0.1 M NaCl、10% V/v甘油、pH 7. 5)，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲 液NaCl梯度洗脱，收集0. 2M和0. 25M的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱及NaCl梯度洗 脱该洗脱峰，以〇. 25M NaCl洗脱得到HU蛋白原液，将原液进行85°C加热20min后以转速 14000Xg，4°C下离心20min取上清液即得非特异性DNA结合蛋白HU蛋白。加入甘油至其 体积分数为50 %，-70 °C保存待用。
[0031] 其中，强阳离子交换柱采用SP琼脂糖凝胶柱，弱阳离子交换柱采用ICM-琼脂糖 柱。
[0032] 将制备所得的HU蛋白原液进行SDS-PAGE分析，结果与图1 一致，大小为10. 5kDa， 纯度为95%左右，即HU蛋白原液浓度为：130ng/yl。
[0033] 2、HU的活性检测
[0034] 2. I) HU的活性检测（环状的双链DNA作为底物）
[0035] 按照下表1配置10 μ 1的反应体系：
[0036] 表 1
[0038] (注明：所用的稀释蛋白是将HU蛋白原液稀释5倍，即1 μ I HU蛋白原液加入4 μ 1 bufferA混合均勾。）
[0039] 在反应液中，加入不同浓度的上述步骤1得到的HU蛋白，室温下静置lOmin，之后 分别取5 μ 1反应液进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图2-1。可见在加入HU蛋白后，HU与 双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化出的蛋白HU有活性并且 与环状的双链DNA相互作用。
[0040] 图2-1中各泳道表示如下：M :DNA分子量Marker ;1 :质粒⑵与shift buffer (SB)混合液；2 :Z与SB混合液体系内加入稀释5倍的0. 2 μ I HU ;3 :Z与SB混合液 体系内加入稀释5倍的2 μ I HU ;4 :Z与SB混合液体系内加入1 μ I HU ;5 :Z与SB混合液 体系内加入1. 8 μ I HU ;6 :Z与SB混合液体系内加入2 μ I HU ;7 :Z与SB混合液体系内加 入2. 5 μ I HU ;8 :Z与SB混合液体系内加入3 μ I HU ;9 :Z与SB混合液体系内加入3. 5 μ 1 HU ; 10 :Ζ与SB混合液体系内加入4 μ I HU ; 11 :Ζ与SB混合液体系内加入4. 5 μ I HU ; 12 : Z与SB混合液体系内加入5 μ I HU。
[0041] 2. 2) HU的活性检测（线性状的双链DNA作为底物）
[0042] 按照下表2配置10 μ 1的反应体系：
[0043] 表 2