一种检测znf644基因突变的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测ZNF644基因突变的试剂盒及检测方 法。
【背景技术】
[0002] 高度近视（Hi曲Myopia,HM)又称病理性近视（PathologicalMyopia,PM)或恶性 近视（Mali即antmyopia),是指屈光度为-6. 0DW上，很多已达-8. 0DW上，伴有高度眼轴 延长的一种屈光不正。送种眼轴的进行性延长除造成视功能的严重损害外，还常伴有其他 眼底的退行性改变如近视弧形斑、豹纹状眼底，视网膜脉络膜萎缩，黄斑部改变，周边部视 网膜格子样变性等。还伴发其他严重的眼部并发症，比如视网膜脱离、黄斑变性、青光眼等， 是致盲的重要原因之一。
[0003] 高度近视病因、发病机制非常复杂，有家族性并有明显的遗传倾向，患病率高，有 种族差异。高度近视最常见的遗传方式是常染色体隐性遗传，表现为儿童学龄（前）期出 现近视，近视度数进行性增加，眼底视网膜脉络膜病变逐年加重。在中国，研究人员对中国 四川一个常染色体显性遗传的高度近视患病家系进行研究，在锋指蛋白644狂incFinger Protein644,ZNF644)基因的上鉴定了八个突变；c. 725C〉T、c. 821A〉T、2091A〉G、2156A〉G、 2180C〉G、2238G〉A、4138C〉G、4718G〉A。
[0004] 鉴于目前，对高度近视的治疗方法很有限且效果不显著，该基因突变位点的发现 对于遗传性高度近视患者的早期诊断，及早干预，延缓病程，减少视力丧失具有非常重要的 意义。
[0005]目前，针对W上ZNF644的常见突变的检测方法主要为基因测序法，基因测序法虽 然准确，但需要昂贵的仪器设备、操作繁琐、耗时长、成本高等，不适合临床推广。因此，需要 开发出快速、准确、简单、低成本的突变检测方法及试剂盒，W满足临床上对ZNF644基因突 变检测的需求。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种检测ZNF644基因4种突变（C. 725C>T、2091A〉G、2238G> A、4718G〉A)的方法及试剂盒，针对每一种突变，通过采用一组特异性PCR引物对待测样本 进行扩增，检测是否产生扩增产物条带，W及条带的大小判断该突变的基因型，使得ZNF644 基因突变的检测更快速、准确、简便、经济。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[000引所述检测ZNF644基因突变的试剂盒包括如下引物：
[0009] 突变位点C. 725C>T野生型特异性上游引物：
[0010]沈QIDNO. 1 ;5' -TGTACCTGAGGAAATTCCCG-3'，3' 端第二个碱基C和第Η个碱基C 为硫化修饰碱基；
[0011] 突变位点C. 725C>Τ突变型特异性上游引物：
[0012]沈QIDNO. 2 ;5'-TGTACCTGAGGAAATTCCCA-3'，3'端第二个碱基C和第Η个碱基C 为硫化修饰碱基；
[0013] 突变位点C.725C>T通用下游引物：
[0014]SEQIDNO. 3 :5, -ATCTGAAAACGCCTTAAGTGGA-3';
[0015] 突变位点2091A〉G野生型特异性上游引物：
[0016]沈QIDNO. 4 ;5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACA-3'，3' 端第二个碱基C和第Η个碱 基A为硫化修饰碱基；
[0017] 突变位点2091A〉G突变型特异性上游引物：：
[0018]沈QIDNO. 5 ;5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACG-3'，3' 端第二个碱基C和第Η个碱 基A为硫化修饰碱基；
[0019] 突变位点2091A〉G通用下游引物：
[0020]SEQIDNO.6:5,-GTTGATCCAAATGTTCGCTTC-3';
[0021] 突变位点2238G>A野生型特异性上游引物：
[0022]沈QIDNO. 7 ;5'-AGGAGAGCTGTTTTGATTGC-3'，3'端第二个碱基G和第Η个碱基T 为硫化修饰碱基；
[0023] 突变位点2238G>A突变型特异性上游引物：
[0024]沈QIDNO.8;5'-AGGAGAGCTGTTTTGATTGT-3'，3'端第二个碱基G和第Η个碱基T 为硫化修饰碱基；
[00巧]突变位点2238G>A通用下游引物：
[0026]SEQIDNO. 9 :5,-AATTGCCCTAAAACATTTGTGC-3,；
[0027] 突变位点4718G〉A野生型特异性上游引物：
[0028]沈QIDNO. 10 ;5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTC-3'，3' 端第二个碱基T和第Η个 碱基C为硫化修饰碱基；
[0029] 突变位点4718G〉A突变型特异性上游引物：
[0030]沈QIDNO. 11 ;5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTT-3'，3' 端第二个碱基T和第Η个 碱基C为硫化修饰碱基；
[0031] 突变位点4718G〉A通用下游引物：
[0032]SEQIDNO. 12 ;5, -CAGCCATTAATAAACTGTTGC-3，。
[0033] 上述试剂盒中还包括本领域常规PCR组件；高保真DM聚合酶P化酶，含有硫酸镇 的Pfu缓冲液，dNTPs。
[0034] 上述试剂盒中还包括4个检测位点的阳性对照突变质粒和野生型阴性对照质粒。 所述4个检测位点的阳性对照突变质粒均未本领域常规方法针对已知野生型或突变型序 列构建，分别为pGEM-T质粒载体插入包含ZNF644基因C.725C>T、2091A〉G、2238G>A、 4718G〉A的突变序列。
[0035] 本发明还提供了基于上述试剂盒检测检测ZNF644基因突变的方法，所述方法是 W待测基因组DNA为模板，采用试剂盒引物对待测基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR扩增 的结果判断待测基因组DNA的ZNF644基因中是否含有C.725C>T、2091A〉G、2238G>A、 4718G〉A四种突变：
[0036] 针对C. 725C>T位点的判定；分别用野生型特异性上游引物和通用下游引物，突 变型特异性上游引物和通用下游引物分两管进行PCR反应，如果只有野生型特异性上游引 物和通用下游引物的反应出现扩增产物499bp，则表明待测基因的ZNF644基因为C. 725C >T野生型，如果只有突变型特异性上游引物和通用下游引物的反应出现扩增产物499bp， 则表明待测基因的ZNF644基因为C.725C>T突变纯合子，如果两个反应均出现扩增产物 499bp，则表明待测基因的ZNF644基因为C. 725C>T杂合子；
[0037] 针对2091A〉G位点的判定；分别用野生型特异性上游引物和通用下游引物，突变 型特异性上游引物和通用下游引物分两管进行PCR反应，如果只有野生型特异性上游引物 和通用下游引物的反应出现扩增产物26化P，则表明待测基因的ZNF644基因为2091A〉G野 生型，如果只有突变型特异性上游引物和通用下游引物的反应出现扩增产物26化P，则表明 待测基因的ZNF644基因为2091A〉G突变纯合子，如果两个反应均出现扩增产物26化P，则表 明待测基因的ZNF644基因为2091A〉G杂合子；
[0038] 针对2238G>A位点的判定；分别用野生型特异性上游引物和通用下游引物，突变 型特异性上游引物和通用下游引物分两管进行PCR反应，如果只有野生型特异性上游引物 和通用下游引物的反应出现扩增产物6(K)bp，则表明待测基因的ZNF644基因为2238G>A 野生型，如果只有突变型特异性上游引物和通用下游引物的反应出现扩增产物6(K)bp，则表 明待测基因的ZNF644基因为2238G>A突变纯合子，如果两个反应均出现扩增产物6(K)bp， 则表明待测基因的ZNF644基因为2238G>A杂合子；
[0039] 针对4718G〉A位点的判定；分别用野生型特异性上游引物和通用下游引物，突变 型特异性上游引物和通用下游引物分两管进行PCR反应，如果只有野生型特异性上游引物 和通用下游引物的反应出现扩增产物353bp，则表明待测基因的ZNF644基因为4718G〉A野 生型，如果只有突变型特异性上游引物和通用下游引物的反应出现扩增产物353bp，则表明 待测基因的ZNF644基因为4718G〉A突变纯合子，如果两个反应均出现扩增产物353bp，则表 明待测基因的ZNF644基因为4718G〉A杂合子。
[0040] 优选地，所述PCR扩增条件为；95°C预变性5分钟，95°C变性20砂，退火温度分别 为；2091A〉G和 4718G〉A为 56°C、C. 725C>T为 60°C、2238G>A为 62°C，退火 20 砂，72°C 延伸30砂，共35个循环，最后72Γ延伸10分钟。PCR扩增结束后采用常规技术进行纯化 和电泳鉴定。
[0041] 下面结合原理对本发明作进一步说明：
[004引本发明所述的检测ZNF644基因突变的试剂盒中包括常规PCR组件，4组特异性引 物；所述特异性引物每一组对应一个突变类型，包括两条序列特异性引物（分别对应野生 型和突变型）和一条通用引物。其中突变位点C.725C>T的两条序列特异性上游引物的 序列分别具有SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所示核巧酸序列，所述通用引物具有SEQIDNo. 3 所示核巧酸序列；突变位点2091A〉G的两条序列特异性上游引物的序列分别具有SEQID No.