60°C，2238G>A为 62°C)，退火 30 砂，72°C延伸 40 砂， 共35个循环，最后72 °C延伸10分钟。
[0112] 4)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图9-12所示：
[0113] 针对C.7250T位点，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒模 板的反应出现扩增产物499bp，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增突变型阳性质 粒模板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒 模板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游扩增突变型阳性质粒模 板的反应出现扩增产物499bp;
[0114] 针对2091A〉G位点，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒模板 的反应出现扩增产物26化P，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增突变型阳性质粒 模板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒模 板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游引物扩增突变型阳性质粒 模板的反应出现扩增产物26化P;
[0115] 针对2238G>A位点，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒模 板的反应出现扩增产物6(K)bp，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增突变型阳性质 粒模板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒 模板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游引物扩增突变型阳性质 粒模板的反应出现扩增产物60化P;
[0116] 针对4718G〉A位点，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒模板 的反应出现扩增产物353bp，野生型特异性上游引物与通用下游引物扩增突变型阳性质粒 模板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游引物扩增野生型质粒模 板的反应没有出现扩增产物，突变型特异性上游引物与通用下游引物扩增突变型阳性质粒 模板的反应出现扩增产物353bp。
[0117] 通过上述实验结果可W看出该方法具有快速、准确、特异性高的优点。
【主权项】
1. 一种检测ZNF644基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物： 突变位点c. 725C>T野生型特异性上游引物： 5' -TGTACCTGAGGAAATTCCCG-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基C为硫化修饰碱基； 突变位点c. 725C>T突变型特异性上游引物： 5' -TGTACCTGAGGAAATTCCCA-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基C为硫化修饰碱基； 突变位点c. 725C>T通用下游引物： 5, -ATCTGAAAACGCCTTAAGTGGA-3,； 突变位点2091A>G野生型特异性上游引物： 5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACA-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基A为硫化修饰碱 基； 突变位点2091A>G突变型特异性上游引物：： 5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACG-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基A为硫化修饰碱 基； 突变位点2091A>G通用下游引物： 5' -GTTGATCCAAATGTTCGCTTC-3' ； 突变位点2238G>A野生型特异性上游引物： 5' -AGGAGAGCTGTTTTGATTGC-3'，3'端第二个碱基G和第三个碱基T为硫化修饰碱基； 突变位点2238G>A突变型特异性上游引物： 5' -AGGAGAGCTGTTTTGATTGT-3'，3'端第二个碱基G和第三个碱基T为硫化修饰碱基； 突变位点2238G>A通用下游引物： 5' -AATTGCCCTAAAACATTTGTGC-3' ； 突变位点4718G>A野生型特异性上游引物： 5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTC-3'，3'端第二个碱基T和第三个碱基C为硫化修饰 喊基； 突变位点4718G>A突变型特异性上游引物： 5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTT-3'，3'端第二个碱基T和第三个碱基C为硫化修饰 喊基； 突变位点4718G>A通用下游引物： 5' -CAGCCATTAATAAACTGTTGC-3'。2. 基于权利要求1所述试剂盒检测检测ZNF644基因突变的方法，其特征在于，所述方 法是以待测基因组DNA为模板，采用试剂盒引物对待测基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR 扩增的结果判断待测基因组DNA的ZNF644基因中是否含有c. 725C>T、2091A>G、2238G> A、4718G>A四种突变： 针对c. 725C>T位点的判定：如果只有通用引物的反应出现扩增产物499bp，则表明 待测基因的ZNF644基因为c. 725C>T野生型，如果只有特异性引物的反应出现扩增产物 499bp，则表明待测基因的ZNF644基因为c. 725C>T突变纯合子，如果通用引物的反应和 特异性引物反应均出现扩增产物499bp，则表明待测基因的ZNF644基因为c. 725C>T杂合 子； 针对2091A>G位点的判定：如果只有通用引物的反应出现扩增产物267bp，则表明待测 基因的ZNF644基因为2091A>G野生型，如果只有特异性引物的反应出现扩增产物267bp，则 表明待测基因的ZNF644基因为2091A>G突变纯合子，如果通用引物的反应和特异性引物反 应均出现扩增产物267bp，则表明待测基因的ZNF644基因为2091A>G杂合子； 针对2238G>A位点的判定：如果只有通用引物的反应出现扩增产物600bp，则表明 待测基因的ZNF644基因为2238G>A野生型，如果只有特异性引物的反应出现扩增产物 600bp，则表明待测基因的ZNF644基因为2238G>A突变纯合子，如果通用引物的反应和特 异性引物反应均出现扩增产物600bp，则表明待测基因的ZNF644基因为2238G>A杂合子； 针对4718G>A位点的判定：如果只有通用引物的反应出现扩增产物353bp，则表明待测 基因的ZNF644基因为4718G>A野生型，如果只有特异性引物的反应出现扩增产物353bp，则 表明待测基因的ZNF644基因为4718G>A突变纯合子，如果通用引物的反应和特异性引物反 应均出现扩增产物353bp，则表明待测基因的ZNF644基因为4718G>A杂合子。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：95°C预变性5分钟， 95°C变性 20 秒，退火温度分别为：2091A>G和 4718G>A为 56°C、c. 725C>T为 60°C、2238G >A为62°C，退火20秒，72°C延伸30秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。4. 如权利要求1所述引物在制备检测ZNF644基因突变试剂中的应用；所述引物如下： 突变位点c. 725C>T野生型特异性上游引物： 5' -TGTACCTGAGGAAATTCCCG-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基C为硫化修饰碱基； 突变位点c. 725C>T突变型特异性上游引物： 5' -TGTACCTGAGGAAATTCCCA-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基C为硫化修饰碱基； 突变位点c. 725C>T通用下游引物：5. -ATCTGAAAACGCCTTAAGTGGA-3,； 突变位点2091A>G野生型特异性上游引物： 5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACA-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基A为硫化修饰碱 基； 突变位点2091A>G突变型特异性上游引物：： 5' -ATCCAAAAAATCAGCTACCTACG-3'，3'端第二个碱基C和第三个碱基A为硫化修饰碱 基； 突变位点2091A>G通用下游引物： 5' -GTTGATCCAAATGTTCGCTTC-3' ； 突变位点2238G>A野生型特异性上游引物： 5' -AGGAGAGCTGTTTTGATTGC-3'，3'端第二个碱基G和第三个碱基T为硫化修饰碱基； 突变位点2238G>A突变型特异性上游引物： 5' -AGGAGAGCTGTTTTGATTGT-3'，3'端第二个碱基G和第三个碱基T为硫化修饰碱基； 突变位点2238G>A通用下游引物： 5' -AATTGCCCTAAAACATTTGTGC-3' ； 突变位点4718G>A野生型特异性上游引物： 5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTC-3'，3'端第二个碱基T和第三个碱基C为硫化修饰 喊基； 突变位点4718G>A突变型特异性上游引物： 5' -ATACTTGTTTAAACAAATCTCCCTT-3'，3'端第二个碱基T和第三个碱基C为硫化修饰 喊基； 突变位点4718G>A通用下游引物： 5' -CAGCCATTAATAAACTGTTGC-3'。
【专利摘要】本发明公开了一种检测ZNF644基因突变的试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括SEQ？ID？NO.1至12所示的引物。采用本发明所述检测ZNF644基因突变的试剂盒和检测方法检测ZNF644基因突变时，具备快速的优点，在2小时内可检测出4种ZNF644基因突变位点，与临床检测金标准序列测定至少所需5小时相比，检测时间大大缩短。本发明所述检测方法简便、成本低，有利用临床使用和推广。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105331678
【申请号】CN201410394457
【发明人】罗迪贤, 武正清, 罗伟濠, 段丽丽, 谭华霞, 蒋文丽
【申请人】郴州市第一人民医院
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年8月12日