检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及检测kras基因突变的试剂盒，该涉及利用该 试剂盒在非疾病诊断中检测kras基因突变的方法。
【背景技术】
[0002] Kras基因为Ras基因家族中的一员，编码的Ras蛋白P21具有GTP水解酶活性，是 人类表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)依赖的下游信号转导 通路Ras-Raf-MPK途径中的重要成员。Kras基因突变导致P21蛋白与GTP牢固结合，持 续激活传导通路的级联反应，刺激细胞生长、增殖、分化引起癌变。据报道，Kras基因的突 变率约占结直肠癌总体患者的30% -60%。在这些突变中，80 % -90 %的突变热点主要位 于KRAS基因的2号外显子的密码子12位和13位上，包括7中突变类型：G13D、G12D、G12A、 G12V、G12S、G12R、G12C〇
[0003] 作为信号转导通路Ras-Raf-MAPK途径中的上游信号分子，EGFR在60-80 %的结直 肠癌中过度表达。以EGFR为靶点的药物，可阻断EGFR信号传导，从而抑制肿瘤新生血管形 成、肿瘤的生长、侵袭和转移。但该类药物只能对Kras基因野生型的结直肠癌患者有效，使 病人的预后得到改善。由于突变型的P21蛋白无需接收EGFR信号，能够自动活化该通路并 启动下游信号的转导。因此，Kras基因野生型的患者能从抗EGFR的药物中获益，突变型患 者则不行。Kras基因突变状态与预测肿瘤患者应用靶向药物的有效性以及更好的进行个体 化治疗中起着重要作用。美国国家癌症综合治疗联盟（National Comprehensive Cancer Network，NCCN)《结直肠癌临床实践指南》明确指出：（1)所有转移性结直肠癌患者都应检 测Kras基因状态；（2)只有Kras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂（如爱必妥和帕尼单 抗）治疗。
[0004] 因此，检测组织或血浆中Kras基因突变对于指导肠癌等癌症患者临床用药，具有 重要的参考价值。
[0005] 目前检测基因突变的方法主要有以下几种：
[0006] (1)直接测序法，其原理是：首先针对突变位点设计探针（每个基因设计一对探 针，探针所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置），然后通过简单PCR扩增获得目 的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对 一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接 克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于 测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20%的基因突变进行检测。因此， 此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。
[0007] ⑵变性高效液相色谱法（denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合 双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形 成"Y"形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来， 通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失 的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5%左右，但检测过 程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确 认。
[0008] (3)高分辨率溶解曲线（high resolution melting，HRM)。高分辨率溶解曲线是 基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析 基因突变。检测敏感性在5%左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过 测序加以确认。
[0009] (4)探针扩增阻滞突变法（amplification refractory mutation system，ARMS)。 利用PCR探针的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变 位点的特异性PCR扩增探针，在严格的条件下，只有在探针3'碱基与模板配对时PCR扩增 反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5'端探针，一个与正常DNA互补，一个 与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种探针及3'端探针进行两个平行的PCR，结 合有与突变DNA完全互补的探针才可以延伸并得到PCR扩增产物。
[0010] (5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应（competitive allele-specific TaqMan polymerase chain reaction，CAST-PCR)。CAST-PCR 法米用优化 TaqMan 探针，通 过一段特异设计的MGB探针来阻止探针与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA， 该检测方法的灵敏度在1 %左右。
[0011] 因此，急需一种提高检测kras基因的灵敏度的方法和相应的检测试剂盒，为肠癌 个体化用药提供指导。
【发明内容】
[0012] 有鉴于此，本发明的目的在于提供检测kras基因突变的试剂盒，该试剂盒特异性 强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测kras基因突变方法，该方法检测周期短。
[0013] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0014] 检测kras基因突变的试剂盒，所述试剂盒含有针对kras基因突变位点的LNA锁 核酸修饰的特异探针。
[0015] 优选的，所述锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为 GG+AGCT+G+GTG+GCGTAGGC_P04，其中" + "后的A或G为锁核酸修饰碱基。
[0016] 优选的，所述试剂盒中还包含检测Kras基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 与 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 2 与 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 4 与 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 5 与 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 6 与 SEQ ID NO. 8 或 SEQ ID NO. 7 与 SEQ ID NO. 8 所示。
[0017] 优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。
[0018] 优选的，所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1XPCR buffer、2. 5mM MgCl2、dNTP 250 μ M、引物 250nM、探针 500nM、I X EVE GREEN、DNA 聚合酶 IU 和 DNA 模板 2-20ng。
[0019] 2、所述检测kras基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测kras基因突变的方法， 包括如下步骤：
[0020] a.设计检测kras基因突变的引物和针对kras基因突变位点的LNA锁核酸修饰的 特异探针；
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