检测pkd1基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学体外诊断技术，具体涉及常染色体显性多囊肾病致病基因 PKDl 突变检测的扩增引物组、试剂盒以及使用该引物组和试剂盒检测检测PKDl基因突变的方 法。
【背景技术】
[0002] 成人多囊肾病（polycystic kidney disease, PKD)是最常见的遗传性肾病，人群 发病率约在1/400~1/1000,多为常染色体显性遗传，少部分为常染色体隐性遗传。常染 色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)主要表 现为双肾多发性进行性囊泡，引起肾脏结构和功能损害，是终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD)最常见的遗传病因，约占全部ESRD的10%，还可累及全身多个器官，如肝囊 月中、高血压、颅内动脉瘤等。遗传学研宄表明ADPKD主要由PKDl和PKD2基因突变引起，大 约80%~85%患者的致病基因为PKD1，导致I型多囊肾病，10%~15%患者的致病基因为 PKD2,导致II型多囊肾病。遗传性多囊肾病是以双肾形成多个进行性增大囊肿为主要特征 的单基因遗传病，PKDl基因突变是造成成人多囊肾病的主要病因，且其患者较PKD2患者发 病早、临床症状更严重。目前对ADPKD尚无特异的治疗措施，只有一些对症治疗和延缓多囊 肾病向ESRD进展的干预措施。对患者进行基因检测有助于明确诊断、直系亲属预后判断， 并为再次生育产前检测提供依据。PKDl位于人16ql3. 3,基因长52kb，含46个外显子，编码 区长度12906bp，在16号染色体上存在6个同源的假基因，与PKDl外显子1至外显子33序 列相比同源性高达97. 7%。PKDl基因结构复杂，突变种类多，可能涉及整个基因，没有突变 热点，且80%以上的致病突变都发生在基因的多拷贝区（外显子1~33)，因此特异性检测 PKDl基因突变较为困难。直到2001年，Rossetti等才联合LR-PCR、巢式PCR及单链构象多 态性（single strand conformation polymorphism, SSCP)分析，第一次全面报道了高加索 人PKDl基因突变的情况。随后有研宄者建立了基于变性高效液相色谱技术的突变筛查方 法，可以提高突变的检出率，但两种方法存在的影响因素较多，结果不够稳定，准确性较低。 目前，对巢式PCR产物进行直接Sanger测序是常用的PKD基因诊断方法，虽然该方法更为 准确，但测序工作量巨大、效率低，且存在PCR脱靶现象，限制了该方法的大规模临床应用。
[0003] 在现有技术中为了解决检测PKDl基因突变效率低下的问题，研宄者们作了大量 的尝试。萧畔等（中国ADPKD患者PKDl基因突变位点检测，《山东医药》，2007年，第47卷 第21期，1-2页）仅对PKDl基因的12、14、21外显子片段进行了扩增，该方法并不具备完全 检测PKDl基因突变的效果。TW201339309A公开了一种检测PKDl基因突变的引物组和试剂 盒，但其在扩增PKDl基因过程中所需要使用的引物组多达几十组，虽然较为准确，但方法 过于繁琐，反应体系需要后续纯化，必须结合DHPLC进行后续处理，检测成本过高、效率低。 张树忠等（应用变性高效液相色谱技术检测汉族人I型多囊肾致病基因突变，《中华医学遗 传学杂志》，2006年，第23卷第03期，283-288页）采用的方法与TW201339309A类似，也有 类似的缺陷。
[0004] US7553644B2也公开了一种检测PKDl基因突变的方法，但该方法中扩增PKDl基因 过程中所需要使用的引物组也过多，方法过于繁琐，检测效率低。CN104531883A公开了一种 检测PKDl基因突变的试剂盒和检测方法，涉及一种含有5对引物的引物组，该检测方法中 测序采用的是第二代测序（next-generation sequencing, NGS)技术，该技术具有高通量、 快速、准确和成本低的优点，可实现多样本、多个基因、多外显子的同时检测，但该方法采用 的NGS技术具有GC含量偏好性，尤其是不能得到PKDl外显子1的有效数据。并且NGS技 术具有读序短的特点，扩增的LR-PCR产物必须片段化得到短序列后方可进行建库，为提高 通量每个样本需要独立建库，大大提升了检测成本。由于PKDl基因长度大以及方法自身的 限制，最后该方法只检测到外显子1之外的PKDl基因的外显子和部分的内含子内含子，该 范围并不能完全覆盖已报道的致病位点；因此CN104531883A的检测方法和引物序列组并 不能全面地反映出所检测样品中的所有PKDl基因突变，该方法所得到的假阳性检测结果 和漏检的可能较大。因此本领域仍然需要一种能高效、简便、准确地检测PKDl基因突变、并 且所需引物组较少的方法。
[0005] 第三代测序技术基于纳米孔采用单分子读取技术，有着更快的数据读取速度和巨 大的应用潜能；在建库阶段不需要对DNA进行片段化处理，也不需要PCR扩增步骤，进一步 降低了测序成本。第三代测序技术以太平洋生物技术公司（Pacific Biosciences)PacBio RS II单分子实时（Single Molecular Real Time, SMRT)测序技术为代表，该单分子测序技 术是一种完全新型的测序技术，具有读长超长、准确度高、GC偏向性小等特点，这一技术简 称PacBio SMRT测序技术，可以在一天之内完成从样品制备到测序和读取序列的全过程，非 常适合临床快速诊断的要求。PacBio SMRT测序解决了第二代测序几大困扰：变异检测假阳 性高，稀有突变被淹没，建库阶段无需扩增可直接对单个分子进行测序，有效避免了建库扩 增偏好性和GC偏好性，可轻松跨越GC含量异常（过高或过低）及高度序列重复的区域，实 现序列覆盖的完整性和均一性，长读长（平均读长达IOKbp-HKbp)特性可以直接对长片段 进行测序，无需打断成小片段再进行测序。因此，PacBio SMRT测序技术可以对LR-PCR产 物进行直接测序，而不需要片段化处理和再次PCR扩增，而且采用引物标签技术，不需要对 每个样本单独建库，可以显著提高检测通量，降低单个样品的检测成本。目前还未有将将长 链PCR(Long-range PCR，LR-PCR)技术和PacBio SMRT测序技术结合，并将其应用于单基因 遗传病基因诊断的研宄，更没有将PacBioSMRT应用于常染色体显性多囊肾病基因诊断领 域的研宄。
【发明内容】
[0006] 本发明涉及一种检测PKDl基因突变方法，所述方法利用PKDl基因的序列信息设 计9对PCR标签引物，应用长链PCR技术靶向扩增PKDl基因，同时在扩增产物加上标签， PCR产物纯化、混合后直接建单一 SMRTBell文库，应用PacBio RS II测序仪进行测序，通过 生物信息学分析获得PKDl基因突变信息。
[0007] 本发明提供了一种用于PCR特异性扩增检测PKDl基因突变的引物组，该组PCR引 物共9对，所述一对PCR标签引物由标签和扩增待测目的序列的PCR引物组合而成，即在 每一对PCR标签引物的5'端分别具有正向标签和反向标签。9对引物分别如下：用于扩增 PKDl基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反向引物如SEQ ID NO: 2所示；用于扩增PKDl基因内含子1到外显子8的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 3 所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；用于扩增PKDl基因外显子7到外显子13的引物，其 正向引物如SEQ ID NO: 5所示，反向引物如SEQ ID NO: 6所示；用于扩增PKDl基因内含子 12到外显子15的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示； 用于扩增PKDl基因外显子15到内含子21的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向 引物如SEQ ID NO: 10所示；用于扩增PKDl基因内含子21到内含子26的引物，其正向引物 如SEQ ID NO: 11所示，反向引物如SEQ ID NO: 12所示；用于扩增PKDl基因内含子26到内 含子34的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 13所示，反向引物如SEQ ID NO: 14所示；用于扩 增PKDl基因内含子34到内含子41的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 15所示，反向引物如 SEQ ID NO: 16所示；用于扩增PKDl基因内含子39到外显子46的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 17所示，反向引物如SEQ ID NO: 18所示。优选的PCR引物如表1所示，扩增片段1 大小为2281bp，扩增片段2大小为4037bp，扩增片段3大小为3904bp，扩增片段4大小为 4398bp，扩增片段5大小为4358bp，扩增片段6大小为3202bp，扩增片段7大小为3910bp， 扩增片段8大小为2641bp，扩增片段9大