基于DNA纳米结构的17β-雌二醇可视化检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学领域，涉及一种DNA纳米结构用于17-雌二醇可视化检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]17 β-雌二醇(17 β-estrad1l，Ε2)是一类作用最强烈、最具潜在危害的内分泌干扰物，广泛存在于河流、土壤、水源、大气以及农产品中。它主要来源于杀虫剂、废气、食品添加剂、人畜排泄物及生活污水，即使在极低的浓度下也会对生物体产生明显的影响，其含量水平与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及男性生殖障碍具有显著相关性。传统的17 β -雌二醇检测方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等，这些方法需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，需要经验丰富的操作人员难以实现大批量样本的现场快速分析。另一种方法是以抗体来检测17 β-雌二醇，但是抗体的制备过程繁琐，保存麻烦，而且要涉及多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。
【发明内容】
[0003]为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于DNA纳米结构的17 β -雌二醇可视化检测方法及检测试剂盒。
[0004]本发明所采取的技术方案是:
[0005]一种基于DNA纳米结构的17 β -雌二醇可视化检测试剂盒，其包括如下组分:
[0006](I)DNAl:17β-雌二醇的核酸适体的5’或3’端延伸至少24碱基，形成DNA1，其从5’至3’依次包括5单元、2*单元、5单元、I*单元和17 β -雌二醇核酸适体单元；
[0007](2) DNA2:DNA2与DNAl的I*单元和部分17 β -雌二醇核酸适体单元互补；
[0008](3)莖环DNA探针A:从5’到3’依次包括4单元、I单元、5*单元、2单元、5*单元、5单元、3*单元、5单元、2*单元、5单元；
[0009](4)茎环DNA探针B:茎环DNA探针A从5’到3’依次包括4单元、2单元、5*单元、3单元、5*单元、5单元、I*单元、5单元、3*单元、5单元；
[0010](5)茎环DNA探针C:茎环DNA探针C从5’到3’依次包括4单元、3单元、5*单元、I单元、5*单元、5单元、2*单元、5单元、I*单元、5单元；
[0011]茎环DNA探针A-C中，首尾的4单元和5单元是切割成两部分的G四聚体核酸序列，二者处于分开状态，无法形成完整的G四聚体结构，无催化活性；
[0012]以上DNA分子中，1、2、3、5单元分别与1*、2*、3*、5*单元互补；
[0013](6)氯高铁血红素
[0014](7) H2O2
[0015]⑶TMB或ABTS或邻苯二胺。
[0016]作为优选的，所述DNA2与DNAl 17 β -雌二醇核酸适体单元的互补碱基数为9_24个；所述DNA分子中的I单元、I*单元、2单元、2*单元、3单元、3*单元、5单元、5*单元的碱基数均为6-9个。
[0017]作为优选的，所述茎环DNA探针A、茎环DNA探针B或茎环DNA探针C的4单元中含有3组GGG碱基，5单元中含有I组GGG碱基。
[0018]作为优选的，所述DNAl中，17 β -雌二醇核酸适体的序列如下所示:
[0019]5’-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0020]作为优选的，各DNA分子的序列如下所示:
[0021]DNAl:
[0022]5’-ATGGGTCTCACTATGGGTTCAACGGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0023]DNA2:5’-ATTCAATAAGCTGGAAGCCGTTGA-3’ (SEQ ID N0.2)；
[0024]茎环DNA探针A:
[0025]5’-TGGGTAGGGCGGGTCGTTGAACCCATAGTGAGACCCATATGGGTCAAGACATGGGTCTCACTATGGGT-3’ (SEQ ID N0.3)；
[0026]茎环DNA探针B:
[0027]5’-TGGGTAGGGCGGGTAGTGAGACCCATGTCTTGACCCATATGGGTTCAACGATGGGTCAAGACATGGGT-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0028]茎环DNA探针C:
[0029]5’-TGGGTAGGGCGGGTGTCTTGACCCATCGTTGAACCCATATGGGTCTCACTATGGGTTCAACGATGGGT-3’ (SEQ ID N0.5)。
[0030]所述试剂盒中还含有Tris-HCl缓冲液和显色缓冲液。
[0031]一种基于DNA纳米结构的17 β -雌二醇可视化检测方法，包括如下步骤:
[0032](I)将DNAl、DNA2和茎环DNA探针分别溶于缓冲液中；
[0033](2)将DNAl与DNA2溶液混合，室温反应；
[0034](3)将待检样品加入步骤⑵的反应液中，混匀，室温反应；
[0035](4)往步骤(3)的反应液中加入茎环DNA探针Α、茎环DNA探针B和茎环DNA探针C，混匀，室温反应；
[0036](5)往步骤(4)反应液中加入氯高铁血红素，混匀，室温反应；
[0037](6)取步骤(5)的反应液加入含有TMB和H2O2的显色缓冲液中，混匀，室温反应，观察颜色变化，如果反应液中产生蓝色的底物，则表明待检样品中含有17 β-雌二醇；
[0038]其中，DNA1、DNA2、茎环DNA探针Α、茎环DNA探针B和茎环DNA探针C的序列组成如上所述。
[0039]作为优选的，步骤⑴所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH为7.4，含有200mMNaCl以及 50mMKCl。
[0040]作为优选的，步骤(6)所述显色缓冲液含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mMKCl，10 μ L 0.5% 的 TMB, 20 μ L 30% 的 H2O2, pH = 5.0。
[0041]本发明的有益效果是:
[0042](I)本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对17 雌二醇的检测限为lOOfM，检测结果肉眼可见，适于现场快速分析；
[0043](2)本发明所述的17 β -雌二醇的检测方法具有很好的特异性，常见的其他干扰物对检测不产生影响；
[0044](3)以核酸适体为分子识别元件，通过形成DNA纳米结构，达到级联信号放大的目的。以G四聚体作为信号报告分子，检测结果直接肉眼可见，无需使用任何检测仪器，无需使用抗体，无需洗涤分离过程，操作简单，适于现场快速检测。
【附图说明】
[0045]图1为本发明所述的检测方法的原理图；
[0046]图2为对不同浓度的17 β -雌二醇检测的结果图；
[0047]图3为特异性实验结果图。
【具体实施方式】
[0048]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0049]实施例1
[0050]一种基于DNA纳米结构的17 β -雌二醇可视化检测试剂盒，其包括如下组分:
[0051](I)DNAl:
[0052]52*51*17 β-雌二醇核酸适体
[0053]5’ -ATGGGT-CTCACT—ATGGGT—TCAACG-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0054]17 β-雌二醇的核酸适体的5’或3’端延伸，形成DNA1，其包括5单元、2*单元、5单元、I*单元和17 β -雌二醇核酸适体区域。
[0055](2) DNA2:
[0056]5’-ATTCAATAAGCTGGAAGCCGTTGA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0057]DNA2与DNAl的I*区域和部分17 β -雌二醇核酸适体区域互补。
[0058](3)茎环 DNA 探针 A:
[0059]415*25*53*
[0060]5’ -TGGGTAGGGCGGGT—CGTTGA—ACCCAT—AGTGAG—ACCCAT—ATGGGT—CAAGAC—ATGGGT--CTCACT—ATGGGT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0061]52*5
[0062]莖环DNA探针A从5’到3’依次包括4单元、I单元、5*单元、2单元、5*单元、5单元、3*单元、5单元、2*单元和5单元，其中，5*-2-5*单元与5_2*_5单元互补形成莖环结构。
[0063](4)茎环 DNA 探针 B:
[0064]425*35*51*
[0065]5’ -TGGGTAGGGCGGGT—AGTGAG—ACCCAT—GTCTTG—ACCCAT—ATGGGT—TCAACG—ATGGGT--CAAGAC—ATGGGT-3’ (SEQ ID N0.4)
[0066]53*5
[0067]莖环DNA探针A从5’到3’依次包括4单元、2单元、5*单元、3单元、5*单元、5单元、I*单元、5单元、3*单元和5单元，其中，5*-3_5*区域与5-3*-5区域互补形成莖环结构。
[0068](5)茎环 DNA 探针 C:
[0069]435*15*52*
[0070]5’ -TGGGTAGGGCGGGT—GTCTTG—ACCCAT — CGTTGA — ACCCAT — ATGGGT — CTCACT—ATGGGT--TCAACG—ATGGGT-3’ (SEQ ID N0.5)
[0071]51*5
[0072]莖环DNA探针C从5’到3’依次包括4单元、3单元、5*单元、I单元、5*单元、5单元、2*单元、5单元、I*单元和5单元，其中，5*-1-5*区域与5-1*-5区域互补形成莖环结构。
[0073]茎环DNA探针A-C中，首尾的4单元和5单元是切割成两部分的G四聚体核酸序列，二者处于分开状态，无法形成完整的G四聚体结构，无催化活性。
[0074]以上DNA分子中，1、2、3、5单元分别与1*、2*、3*、5*单元互补。
[0075](6)氯高铁血红素；
[0076](7) H2O2;