猪源附红细胞体荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物血液中支原体感染检测技术领域，具体涉及一种猪源附红细胞体 荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪源附红细胞体属于不能体外培养的嗜血支原体家族中的成员，一般寄生在猪红 细胞的表面、血浆和骨髓。猪源附红细胞体感染在全世界广泛分布，给养猪业带来严重的 经济损失。其急性感染可导致严重的菌血症、急性红细胞溶血，有时可导致年轻仔猪死亡、 怀孕母猪流产等。对于慢性感染的猪只，血液中细菌含量低，临床症状多变，比如可能出现 温和的黄疸、亚健康、生长速度缓慢、生产能力低下或对其他的感染性疾病易感。在强烈的 免疫作用和抗生素治疗之下，猪源附红细胞体依旧可以在宿主体内建立慢性和持续性的感 染。猪感染附红细胞体后，极有可能在症状消失后转化为慢性感染。目前发现感染猪的附 红细胞体（即猪源附红细胞体）有两种，包括猪附红细胞体（Mycoplasma suis)和小附红细 胞体（M. parvum)。由于依靠 16S rRNA基因及Rnase P RNA序列的分子鉴定方法才出现不 久，对小附红细胞体的研究尚不充分。
[0003] 目前应用于猪附红细胞体病的检测方法有多种，包括镜检、血清学检测、PCR等。而 临床上该病的诊断最初主要以镜检为主，包括鲜血压片和涂片染色镜检。由于附红细胞体 主要寄生在红细胞表面和血浆中，常导致红细胞变形。但红细胞的变形可以由多种因素引 起，如涂片技术、渗透压的改变等，因此许多人容易将变形红细胞错误判断为附红细胞体感 染，从而导致误诊，因此直接涂片和悬滴法不宜作为确诊方法，只能视为疑似病例。检测慢 性感染的最有效方法是接种脾切除的动物，观察其是否发病，但该方法费时、费力，也不适 合常规检测。
[0004] 血清学方法包括采用间接血凝试验（Indirect Hemagglutination Assay, IHA)、 补体结合试验（complement fixation test, CFT)或酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测抗体等，其中ELISA方法的敏感性很高，取得了不错进 展。但由于猪附红细胞体至今不能进行体外培养，抗原及抗体的获得难度较大，限制了血清 学诊断方法的发展和使用，至今该类方法尚未能真正在临床上得到应用（Hoelzle et al.， 2006)。
[0005] 近几年虽然用PCR方法诊断猪附红细胞体病的报道屡见不鲜，但常用于种型鉴定 的基于16S rRNA基因的PCR技术非特异性扩增十分严重，同时需要进行电泳分离及染色处 理，且不能准确定量，故使其应用受到限制。1995年，美国TPeTrkinElmer公司研制成功具 有革命性意义的荧光定量PCR技术，它在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累 积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定时分析，可以利用质粒标 准品作为模板直接计算样品DNA中的附红细胞体的拷贝数。荧光定量PCR具体包括2大类， 即探针类和染料类方法。相比SYBR Green I等染料类定量方法，探针类方法因为利用与靶 序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，具有更高的特异性。其主要代表是TaqMan探 针法。目前基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR (TaqMan real-time PCR)检测猪源附红 细胞体的方法报道的还很少，2008年闻若潜、吴志明等人根据GenBank中猪附红细胞体推 测的功能性基因 ORF2序列设计引物和TaqMan探针，建立了猪附红细胞体的TaqMan荧光定 量PCR检测方法。但由于该基因很难进行后续PCR扩增、种型鉴定及蛋白表达，所以没有得 到广泛应用。2013年，曹薇等人建立了基于猪附红细胞体gl基因的TaqMan实时荧光定量 PCR，用于800多份田间样品的检测，并与普通PCR结果相比较，证明其具有良好的特异性、 敏感性及重复性。但是，其特异性和敏感性可能还有待进一步提高。
[0006] 猪附红细胞体DnaK样蛋白热休克蛋白Al (heat shock proteins Al, HspAl)定 位在猪附红细胞体胞浆及胞膜上，具有表面可接触性、ATP酶（ATPase)活性及抗原性，可能 参与对宿主红细胞的黏附，该HspAl蛋白的编码基因被命名为猪附红细胞体al基因。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于al基因的猪源附红细胞体荧光定量 PCR检测试剂盒，由于al基因具有比gl基因更稳定、更保守的遗传特性，本发明基于al基 因的猪源附红细胞体检测试剂盒比之前基于gl基因的检测试剂盒特异性更强、灵敏性更 高，可快速、准确地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0009] 在本发明的一个方面，提供了一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，该 试剂盒包括：
[0010] 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所 述猪附红细胞体al基因序列第45~191位、第360~532位、第534~631位、第684~ 811位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462位的 核苷酸序列特异性结合；
[0011] 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的引物对，该引物对用于 扩增所述猪附红细胞体al基因序列第45~191位、第360~532位、第534~631位、第 684~811位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462 位的核苷酸序列。
[0012] 优选的，所述探针与SEQ ID NO: 1序列第360~532位的核苷酸序列特异性结合； 所述引物对用于扩增SEQ ID NO: 1序列第360~532位的核苷酸序列。
[0013] 更优选的，所述探针与SEQ ID NO: 1序列第360~484位的核苷酸序列特异性结 合；所述引物对用于扩增SEQ ID NO: 1序列第360~484位的核苷酸序列。
[0014] 在本发明的一个优选实施例中，所述探针的序列如SEQ ID N0:6所示；所述引物对 的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
[0015] 所述试剂盒还包括：含有猪附红细胞体al基因的阳性重组质粒标准品。优选的， 该阳性重组质粒是将长度为1657bp的猪附红细胞体al基因插入pMDIS-T载体而制得。
[0016] 所述试剂盒还包括：突光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。
[0017] 所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有淬灭基团。
[0018] 在本发明的另一方面，还提供了上述猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒在 制备诊断猪的附红细胞体病的产品中的应用。
[0019] 本发明基于al基因的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、 灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞 体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方 面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。
【附图说明】
[0020] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0021] 图1是本发明实施例1的猪附红细胞体al基因的PCR扩增电泳图；
[0022] 图2是本发明实施例1的重组质粒pMD18-T_al的双酶切鉴定电泳图；
[0023] 图3是本发明实施例1的不同分离株猪附红细胞体al基因核苷酸序列的比对分 析图；
[0024] 图4是本发明实施例2猪附红细胞体al基因重组质粒pMD18-T_al梯度稀释扩增 曲线（图4A)及建立的标准曲线（图4B)图；
[0025] 图5是本发明实施例4猪附红细胞体al基因的实时荧光定量PCR特异性实验扩 增曲线图；
[0026] 图6是本发明实施例5重组质粒pMD18-T_al的TaqMan实时荧光定量PCR重复性 实验扩增曲线图；
[0027] 图7是本发明实施例6猪附红细胞体al基因 TaqMan实时荧光定量PCR扩增产物 电泳图；
[0028] 图8是本发明实施例6小附红细胞体阳性样品的TaqMan实时荧光定量PCR扩增 曲线图。【具体实施方式】
[0029] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验 指南》（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南， 第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0030] 本发明在前期实验中对41条猪附红细胞体al基因进行序列分析和比对，发现al 基因具有比gl基因更稳定、更保守的遗传特性，可能更加适合用于猪源附红细胞体的分子 检测。基于此，本发明研制了基于猪附红细胞体al基因的检测猪源附红细胞体的TaqMan实 时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒能更加特异、敏感及可重复地检测猪源附红细胞体， 对于现场猪附红细胞体病的诊断和防控具有重要意义。
[0031] 本发明的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，包括：
[0032] 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所 述猪附红细胞体al基因序列第45