炭疽芽孢杆菌荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸的试 剂盒，属于炭疽芽孢杆菌的体外诊断领域。
[0002]
【背景技术】
[0003] 炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是有传染性的动物源性细菌，引起动物和人 类炭疽的病原菌，主要感染牛和羊等食草动物，人可以通过接触或食用患病动物及畜产品 而感染。
[0004] 根据传播途径的不同，人类炭疽可分为三型。第一型为皮肤炭疽(最多见），因接触 患病动物及受染皮毛而感染；病菌从皮肤伤口进入体内并在局部引起炎症，出现水疱、脓 疱，最后形成坏死、溃疡，中心有黑色坏死性焦痂，故名炭疽。第二型肠炭疽，多由食入未煮 熟的病畜肉而感染，以恶心、呕吐、厌食在先，继以发热、腹痛、频繁腹泻及血便，发病后2-3 天可因毒血症而死亡，病死率达25%_60%。第三型肺炭疽，多因处理病畜皮毛时吸入病菌芽 孢，在肺组织局部发芽繁殖，引起呼吸道症状及原发性肺炎，并伴发全身中毒症状。各型炭 疽均能并发败血症，以传染性休克为特征，心肺功能迅速衰竭而致死。败血症型炭疽亦可引 起出血性脑膜炎，患者出现呕吐、惊厥、高热、昏迷和脑膜炎刺激征，脑脊液呈血性或脓性， 继发多器官衰竭，多在第2-4天死亡，病死率100%。
[0005] 在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学 检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和 敏感性的基础。
[0006] 本发明分别针对炭疽芽孢杆菌毒力岛基因序列的保守区域特异的靶序列设计引 物和Taqman探针，利用real-time PCR的方法，用来快速检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌 的核酸。
【发明内容】
[0007] 本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌，提 供一种特异性检测炭疽芽孢杆菌的荧光PCR试剂盒。
[0008] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 一种特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、 阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和 dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无 RNase和DNase水，阳性质控品为 含炭疽芽孢杆菌特异性扩增位点的重组质粒。
[0009] PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对炭疽芽孢杆菌基因组 群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物;PCR反应液中用于荧光信号监测 的寡核苷酸探针为ProbeUProbel为针对炭疽芽孢杆菌基因组群特异性保守序列设计并经 预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团Χι为FAM，荧光淬灭基团YiSEclipse(见表 1)〇
[0010] 表1检测炭疽芽孢杆菌的引物和探针序列
本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测炭疽芽孢杆菌的应用方法， 包括： 试剂盒选用的PCR反应体系为20 μL，包括2XPCR缓冲液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探针0.2 μL、热启动Taq酶混合液0.4 μL、样品DNA 2 μL，加灭菌水至终体系20 μL。
[0011] 试剂盒的PCR反应循环参数为94°C，2min;进入循环阶段:94°C变性10s，56°C退火 50s，72 °C延伸15s，共反应40个循环。
[0012] 质量控制:每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无 Ct值(或Ct值为0)，阳性对照 Ct值< 30，否则实验结果不成立。
[0013]结果判读： 阳性：出现"S"型扩增曲线，Ct值< 35;可疑：出现"S"型扩增曲线，但Ct值> 35;阴性:没 有出现"S"型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈"S"型;对可疑结果，应重复实验， 如果重复实验还是出现"S"型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
[0014] 样本要求:采集皮肤炭疽的脓液、渗出物，肺炭疽的咯痰，肠炭疽的粪便以及病人 的的血液，疑似生物恐怖袭击的不明来源白色粉末；白色粉末可以室温运输，其余样本采集 后应带冰运输;标本应-20°C保存，不能反复冻融;从临床样本提取DNA，建议采用性能稳定 可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的DNA应立即检测，否 贝丨J，应将DNA分装后-80°C~-20°C保存。
[0015] 本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出炭疽芽孢杆菌，但不能检出非 炭疽芽孢杆菌病原体的核酸;对炭疽芽孢杆菌核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需 要2小时即可完成检测，可为炭疽芽孢杆菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。
【附图说明】
[0016] 图1为单重实时荧光PCR检测炭疽芽孢杆菌阳性标准品的扩增曲线图。从左至右的 每组曲线对应浓度依次为2 X 106-2 X 102c〇piesAU，试剂盒对炭疽芽孢杆菌的检测限均为 10拷贝每反应体系。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的A Rn值。 [00Π ]图2为单重实时荧光PCR检测体系检测10种细菌基因组DNA的扩增曲线图。10种细 菌包括:炭疽芽孢杆菌和9种阴性对照微生物。炭疽芽孢杆菌出现S型扩增曲线，而其他9种 病原微生物未出现S型扩增曲线。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出 的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使 用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人 员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
[0019]、引物和TaqMan探针的设计与合成 利用Biast工具对Genbank和国内外文献中的炭疽芽孢杆菌基因组序列进行分析，分别 选择其稳定的保守区域作为检测靶序列。炭疽芽孢杆菌检测靶序列为质粒PX01基因；并针 对检测靶序列设计和合成引物和探针（见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公 司合成，炭疽芽孢杆菌的检测探针5 '端标记FAM荧光基团，3 '端标记Eel ipse荧光淬灭基团。
[0020] 、检测菌种的准备 本实施例中所使用的炭疽芽孢杆菌以及其他阴性对照菌株(马耳他布鲁菌，鼠疫耶尔 森菌，小肠结肠炎耶尔森菌，土拉弗朗西斯菌，肺炎克雷伯菌，大肠杆菌，大肠埃希菌，流感 嗜血杆菌，嗜肺军团菌)均购买于中国药品生物制品检定所。