专利名称：：一种炭疽芽孢杆菌芽孢的蛋白质悬浮芯片制备及定量检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种炭疽芽孢杆菌(勘"7/zAya/7^rac")芽孢(endospore)蛋白质悬浮芯片的制备方法及其定量检测方法。
背景技术：
：炭疽芽孢杆菌(Ac/7/ma/^力/"ac/力是引起人兽共患病-炭疽的病原菌，为革兰氏阳性可形成芽孢的需氧菌，芽孢可以通过呼吸道、消化道、皮肤接触感染人类，一般在接触后7天出现感染症状，以皮肤型炭疽最常见。吸入大量炭疽芽孢(大于8000个)可引起吸入型炭疽，也称肺炭疽。由于炭疽芽孢具有对外界环境极强的抵抗力，致污染可持续存在，在军事上一直被列为是头号生物战剂之一。在一些国家曾生产并作为武器储存，而今又成为恐怖袭击选用剂，对人类造成新的更大的威胁。炭疽芽孢杆菌的抗原包括菌体抗原和芽孢抗原。炭疽芽孢杆菌的生存、增殖不需特殊条件设备及环境，在土壤中就可增殖，人工大量培养及使之变为芽孢十分容易。由于芽孢独特的生物学性状和危害，对炭疽芽孢的快速定量检测意义重大。出于公共卫生和国家安全的目的，研究和开发快速、定性、定量枱r测传染病病原体是所属
技术领域：
中长期致力追求的目标。尤其对于炭疽菌来说，作为一种烈性传染病的病原体，能否实现定量检测至关重要。目前用于炭疽菌的实验室常规检测方法有细菌学检测方法、血清学检测方法及检测核酸的分子生物学方法。但是，细菌学检测方法、血清学检测方法(例如间接血凝方法)及核酸检测法等现有检测技术存在许多缺陷。对于细菌学检测法，细菌培养耗时较长，不适合对炭疽菌的快速检测。对于核酸检测法，尽管采用了PCR技术对炭疽菌进行检测和分析特异性高，不容易被污染，但是现有PCR技术的方法繁瑣，特别是此类方法包括DNA/RNA的提取和复杂的操作步骤，而且不能用于非核酸物质如蛋白质的检测，因此核酸检测法具有局限性且不方便。新近发展的免疫学检测方法生物传感器技术，如光纤传感器、电化学传感器、上转换磷光生物传感器、纳米传感器等以抗体检测报道较多，抗原直接检测的报道较少。本发明选择炭疽芽孢作为产芽孢的细菌及其芽孢的代表建立蛋白质悬浮芯片检测模型。悬浮芯片(suspensionarray)也称液相芯片(1iquidarray,liquidchip),是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5jum，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至凄t十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测炭疽及其芽孢，是否适合从粉末、液体等样品中快速直接检测，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。
发明内容本发明的目的是提供一种炭疽芽孢杆菌(Ac/7/mmMwc/"芽孢的蛋白质悬浮芯片，同时还提供基于该芯片的炭疽芽孢杆菌芽孢的定量检测方法。本发明技术方案如下一种检测炭疽芽孢蛋白质悬浮芯片，该悬浮芯片包括编码微球(例如025号)，包被微球的所述炭疽芽孢的捕获抗体(例如羊抗sterne(炭疽疫苗4朱)抗体)、生物素标记的炭疽芽孢检测抗体(例如兔抗sterne抗体)、链亲和素—藻红蛋白(SA-PE)及相关緩沖溶液。一种炭疽芽孢的蛋白质悬浮芯片检测方法，检测过程中全部反应可在96孔滤板上进行也可在微量离心管中进行。包括下列步骤(l)每孔加入含已包被捕获抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入检测样品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化4企测抗体，孵育后清洗；(4)加入链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加入检测緩冲液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取FMI数值(平均荧光强度)并分析数据判定检测结果阴性或阳性。一种炭疽芽孢的蛋白质悬浮芯片定量检测方法，该方法包括下列步骤(1)加入的炭疽芽孢悬液经10倍梯度倍比系列稀释，(2)制作样品浓度对应FMI值的剂量-反应标准曲线，(3)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(4)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断样品检测浓度，可判定方法检测限和动态检测范围。本发明人经过大量和深入的研究，对炭疽芽孢的蛋白质悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的优化，其具有下列优点1、抗体包被量的改进抗体的包被量需要以检测效果进行优化，悬浮芯片所需的抗体包被量很低，优化结果为10pg/1.25x106个《效球，即20-40ng/2500"5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为200ng/测试。2、生物素标记的改进标记抗体所用的生物素是过量的，过量的值试剂盒中有参考的计算公式。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不4皮微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能降低的现象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。3、检测的灵敏度及动态范围本发明炭疽芽孢蛋白质悬浮芯片定量检测方法与经典的免疫学ELISA检测方法相比，结果有着很好的吻合性(相关系数R2=0.9564)。同时，悬浮芯片方法灵敏度(103cfu/mL)高于ELISA方法(104cfu/mL)灵敏度l个数量级；并且悬浮芯片方法动态检测范围(103-107cfu/mL)高于ELISA方法动态检测范围(104-107cfu/mL)1个数量级。4、方法的特异性本发明通过选用炭疽芽孢为检测标的抗原，分别以羊抗sterne抗体为捕获抗体，以兔抗sterne抗体为检测抗体。本研究试验证明，在存在假结核菌、小肠结肠炎菌、鼠疫耶尔森菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌等干扰背静条件下本方法具有良好的特异性。5、样品的检测能力本发明评价了悬浮芯片方法对"白色粉末"等环境和食品样品的检测能力。通过对奶粉、小麦面粉、玉米淀粉、混合型果珍粉末等模拟添加样品的检测，初步证实了该方法在检测可疑污染炭疽芽孢的"白色粉末"样品中的实用性。图1:炭疽芽孢检测用025号微球包被炭疽芽孢抗体检测示意图2:蛋白质悬浮芯片方法检测炭疽芽孢标准曲线图3:ELISA方法检测炭疽芽孢标准曲线图4:蛋白质悬浮芯片与ELISA方法检测炭疽芽孢的相关性。具体实施例方式本发明涉及的炭疽芽孢的蛋白质悬浮芯片制备方法、检测及定量方法通过下面的具体实施方式作进一步"i兌明，4旦本发明不以任何方式受该实施例的限定。7一、材料1.蛋白质悬浮芯片的相关緩冲液(1)0.03MPB緩冲液(pH7.2):2.83gNa2HP04,1.36g0^04定容至1L。(2)0.01MPB緩冲液(pH7.2):由0.03MPB緩冲液稀释而成。(3)PBS緩冲液(pH7.4):NaCl137mmol/L;KC12.7mmol/L;Na2HP04lOmmol/L;KH2P042隱o]/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04。用HC1调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi(1.05kg/cm2)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室、、曰孤。(4)微球清洗液:PBS(pH7.4)，0.05%TWEEN-20。(5)微球活化緩沖液IOOmMNa跳:3gNaH2P04，5NNaOH1.5mL，定容于250mL，pH6.2。(6)微球包被緩沖液0.05MMES,pH5.0:2.44gMES，5NNaOH0.15mL,定容于25UmL。(7)微球保存液PBS-TBN:PBS,0.1%BSA，0.02%TWEEN，0。05°/叠氲化物，pH7.4。(8)微球封闭液PBS-BN:PBS,簡A，0.05%叠氮化物,pH7.4。(9)检测緩沖液PBS，1%BSA,pH7.4。(10)抗体稀释液0.01mmol/LPB(pH7.2)。(ll)微球稀释液PBS，1%BSA，pH7.4。(12)样品稀释液0.01MPB,pH7.2。(13)生物素化抗体稀释液PBS-TBN(PBS,0.1%BSA，0.02%TWEEN-20,0.05%NaN3，pH7.4)。(14)SA-PE稀释液PBS(pH7.4)，1%BSA。2.菌抹本发明所使用炭疽芽孢杆菌为疫苗4朱Sterne菌林。3.抗原与抗体本发明所使用炭疽芽孢抗原为疫苗抹Sterne菌林所产芽孢。本发明所使用捕获抗体为羊抗Sterne抗体，检测抗体为生物素化兔抗Sterne抗体，为本研究室以正辛酸-饱和硫酸铵提纯法纯化制备获得。二、待测样品的制备1、目标分析物样品的制备目标分析物为炭疽芽孢，但涉及烈性传染病生物安全问题，以炭疽芽孢杆菌疫苗抹Sterne芽孢作为目标分析物样品。炭疽芽孢杆菌疫苗林(Sterne)接种于芽孢培养基DSM，37。C培养23周，孔雀绿沙黄芽孢染色，镜检观察，当芽孢占菌体数95%以上时收获芽孢，灭菌PB緩冲液(0.01M，Ph7.2)沖洗2遍，PB重悬后，IO倍稀释，并用平^反活菌计数法确定芽孢拷贝数，4'C保存备检。稀释后菌悬液浓度范围为101—107cfu/mL。干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检测物外的其它细菌，包括假结核菌、小肠结肠炎菌、鼠疫耶尔森菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌等接种于营养琼脂培养基，37°C24小时，肉眼观察菌苔的均一性，刮取菌落，以无菌PB緩冲液稀释菌液，麦氏标准比浊法初步计数，4。C保存备检。菌悬液浓度约为105—107cfu/mL。比较实验中，相同炭疽芽孢样品用于ELISA和悬浮芯片的检测。2、模拟污染样品分别将0.5g奶粉、玉米淀粉、小麦面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL样品稀释液中，将不同浓度的炭疽芽孢掺入到粉末样品中，经充分振摇混匀，静置2h以上，使目标分析物与待测模拟白色粉末充分吸附。再用脱脂棉、薄滤纸、厚滤纸、0.45pm滤膜滤纸过滤或低速离心(2000rpm,lmin)后，上清液作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。实施例l、检测炭疽芽孢的蛋白质悬浮芯片的制备1、捕获抗体包被编码微球本发明采用的025号编码樣支J求购自美国BIO-RAD/>司，编码孩U求用于标记可以捕获炭疽芽孢的抗体，即利用羊抗Sterne抗体包被微球。A、编码微球的活化取100nL(1.25x106个)编码微球到1.5mL离心管中，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100jaL的微球清洗緩沖液悬浮，震荡并超声后14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100pL的微球活化緩冲液，4妄着先加入10|iL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10nL新鲜配置的50mg/mL的氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)或羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)，在室温震摇20分钟。加入150(aL的PBS(pH7.4),震荡后，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100pL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球。b、用抗体包被编码微球取捕获抗体羊抗Sterne抗体4-50jug加入到活化后的编码」微球中，用PBS緩冲液定容至500|iL,室温震摇2小时。14000g离心，小心吸出并弃去上清液。用500jaL的PBS緩冲液洗一次，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250jLiL的封闭緩冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500juL的微球保存液洗涤编码孩&求，16000g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150iaL的微球保存液悬浮编码微球，于4。C避光保存备用。c、包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(O.10mm;1/400mm2)在普通显微镜下计数。根据公式(每个大格数x104x稀释倍数x体积(mL))计算微球数量。2、检测抗体标记生物素a、生物素的标记分别配制好浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分装，-2(TC冻存备用。b、抗体用量计算以标记2mg/mL的IgG(免疫J求蛋白，分子量150，000)1mL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约27m1。计算过程如下.,…2mglgG1mmollgG20mmo旧otin，.t.'lm||gGx_x-^——x-=0.000268誦o:lB,ot,n1mlIgG.150,000mgIgG1mmolIgG1000,000ylL0.000266mmolBiotin>;~-x--=26.6piBbtinReagentL10mmolc、生物素化抗体的优化选择用ELISA方法对生物素化抗体进行质量控制，方法如下101)用抗原包被ELISA96孔板每孔加入50iaL，4。C静止过夜；2)加入封闭液(含5°/。BSA的PBS溶液)在37。C封闭lh;3)洗液(含0.5%Tween20的PBS)洗3次，拍干；4)加入生物素化的抗体，每孔50pL，室温放置30min;5)洗液洗3次，拍干；6)加入适量SA/HRP(辣根酶标记链霉亲和素)，50jiL/孔，室温放置30min;7)洗液洗3次，拍干；8)加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50pL/孔，室温;故置10min;9)最后用2MH2S04终止反应。应用酶标4义测读A450nm数值。结果判定若阴性对照孔出现^f艮淡蓝色，阳性孔颜色很深，则生物素化抗体可使用；否则，需重新进行新一轮抗体的生物素化标记。实施例2、悬浮芯片制备法条件的优化1、微球包被抗体及抗体包被量的选择分别以4pg、8pg、10pg、16pg、24pg、40^g、48pg的量包被100pL编码为025号的微球。经检测效果比较，以lOpg/1.25x106个微球即20-40ng/2500~5000个微球/测试包被效果最好，显孩M竟下计数后避光冷藏保存待用。如图l所示，包被羊抗Sterne抗体的025号微球均落在其正确检测区域内，并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的悬浮芯片检测系统可成功用于炭疽芽孢检测。2、生物素化抗体的优化本发明分别用氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)和羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)标记检测抗体，经质控过程检测效果比较，本实验中SH-活性的生物素标记检测抗体检测效果较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或安装制造商的产品i兌明书所述的方法。本发明人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的抗体以l:200稀释作为检测抗体进行检测，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-兔抗Sterne抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果。实施例3、悬浮芯片样品制备、检测及结果判定1、待测样品制备用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白质悬浮芯片检测。2、样品的检测及结果判定4企测过程全部反应均在96孔滤板上进行，；险测过程如下1)每孔加入50|iL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2)加入50jLiL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；3)加入50jiL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4)加入50jiL的SA-PE,混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；5)加入125iaL的才企测^^沖液，经蜗i走重悬混匀；6)用悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。3、检测结果判定根据试验研究结果与相关研究报道，本发明定义蛋白质悬浮芯片方法检测炭疽芽孢的最低检出限(LOD值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光才企测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即Cutoff值为=MFIBlank+3xSD。若检测结果高于LOD对应荧光强度值则判定为炭疽芽孢检测结果阳性；若检测结果低于LOD对应焚光强度值则判定为炭疽芽孢检测结果阴性。实施例4、悬浮芯片对炭疽芽孢抗原的特异性检测应用悬浮芯片检测方法分别对菌液浓度105-1()7cfu/mL假结核菌、小肠结肠炎菌、鼠疫耶尔森菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆等进行检测，根据实施例3中^f企测结果判定标准，仅炭疽芽孢抗原为阳性，其余干扰抗原均为阴性。说明本发明所建立的炭疽芽孢抗原悬浮芯片检测方法与其它测试细菌均不发生交叉反应或非特异反应。实施例5、悬浮芯片定量检测模型的建立1、炭疽芽孢抗原标准曲线样品制备用样品稀释液将炭疽芽孢菌悬液由1.84xl07cfu/mL以IO倍倍比梯度稀释至1.84x10、fu/mL成系列浓度样品。同时，相同样品用于ELISA方法检测。2、剂量-反应标准曲线的绘制按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统检测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表炭疽芽孢的浓度(cfu/mL)，Y轴代表悬浮芯片〗义;险测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定。悬浮芯片系统根据检测结果拟合炭疽芽孢剂量-反应标准曲线方程FI=3.73169+(229.979-3.73169)/[1+(Conc/96161.2)—L13863]08933333、悬浮芯片检测炭疽芽孢的灵敏度和动态范围根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即蛋白质悬浮芯片方法检测炭疽芽孢的灵敏度为103cfu/mL(Cutoff=12.86，Blank=6.5，SD=2.12)。本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着炭疽芽孢浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当炭疽芽孢浓度超过l()7cfu/mL时，抗原抗体的免疫反应达到饱和状态，MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再检测。因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即悬浮芯片定量检测炭疽芽孢的动态范围为103~107cfu/mL。实施例6、蛋白质悬浮芯片方法与ELISA方法检测炭疽芽孢的比较1、ELISA检测方法作为对这，采用包括下列步骤的双抗体夹心ELISA检测1)向普通ELISA微孔板每孔加入50iaL用PB緩沖液稀释的捕获抗体5-50ng,4。C静止过夜；2)加入封闭液，在37。C封闭2小时；3)洗液洗3次，拍干；4)加入检测样品，每孔50jaL,室温放置40分钟；洗液洗3次，拍干；5)加入适量生物素化检测抗体，每孔50pL,室温放置3Q分钟；洗液洗3次，拍干；6)加入适量SA/HRP(辣根酶标记链霉亲和素)，50pL/孔，室温放置3分钟；洗液洗3次，拍干；7)加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50pL/孔，室温放置IO分钟；8)用2MH2S(X终止反应；9)应用酶标仪测读A4^数值。2、样品的悬浮芯片检测方法1)每孔加入50jaL含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵4由滤2次；2)加入5Q|iL检测样品，混匀后室温避光震摇3G分钟，用清洗液洗涤并抽滤3次；3)加入50iaL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤3次；4)加入50jliL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。用清洗液洗涤并真空泵抽滤3次；5)加入125iaL的检测緩沖液，经蜗旋重悬混匀；6)用Bio-Plex悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。3、两种检测方法的灵敏度和动态范围及相关性的比较实施例5中制备的相同一组炭疽芽孢样品同时应用悬浮芯片和ELISA方法进行检测。绘制ELISA方法检测炭疽芽孢的标准曲线(图2和3中横坐标为样品浓度，纵坐标为吸光度值，坐标轴取对数-对数关系)，并与实施例5中悬浮芯片方法结果进行比较。根据两种方法标准曲线悬浮芯片方法(如图2所示)灵敏度为103cfu/mL，动态检测范围103~107cfu/mL;ELISA方法(如图3所示)灵敏度为104cfu/mL,线性检测范围104~107cfu/mL。可以得出结论检测相同炭疽芽孢样品，蛋白质悬浮芯片方法比ELISA方法具有更高的检测灵敏度，即即高l个数量级；并且具有更宽的动态检测范围，即高1个数量级。另外，将两种方法检测结果在104~107cfu/mL范围内进行比较(如图4所示)可以判定蛋白质悬浮芯片方法与ELISA方法有良好的相关性，相关系数为0.9564。实施例7、人工污染"白色粉末"样品的检测1、人工污染"白色粉末"样品的制备将一定含量的炭疽芽孢或空白(样品稀释液)依照不同浓度分别掺入奶粉、淀粉、面粉、速溶果珍等粉末样品制备人工污染样品。将0.5g粉末加入到5mL样品稀释緩沖液中，充分混匀，静置2小时，让待测样品与白色粉末充分吸附。2、人工污染"白色粉末"样品的检测对上述被污染的"白色粉末"样品进行处理，选用棉花、薄滤纸、厚滤纸、0.45nm滤膜、0.22pm滤月莫过滤，以及2000rpm、5分4中和1000rpm、4分钟低速离心等方法处理人工添加样品后的粉末溶液，收集滤液或上清液后按照实施例进行悬浮芯片分析检测。表l:悬浮芯片对人工污染"白色粉末"样品的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>12淀粉+2.18x104cfii/mL炭疽芽孢+13面粉+空白一14淀粉+2.18x105cfij/mL炭疽芽孢+15面粉+1.36xl()Scfli/mL炭疽芽孢+16面18x104cfWmL炭疽芽孢+17混合粉末+空白一18混合粉末+1.36xl0ScfWmL炭疽芽孢+注+代表3险测结果阳性；一一戈表检测结果阴性冲艮据所检测的18个样品中，检测结果(如表1所示)全部正确，初步证明了蛋白质悬浮芯片方法可以快速、准确、高效地应用于炭疽芽孢污染的"白色粉末"样品的实际检测工作。1权利要求1、一种利用蛋白质悬浮芯片检测炭疽芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤(1)向孔加入含已包被捕获抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入待测样品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；(4)加入SA-PE，孵育后清洗；(5)加入检测缓冲液后混匀；(6)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(FMI)数值并分析数据判定检测结果。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕获抗体为抗炭疽芽孢抗体，采用生物素标记的抗炭疽芽孢抗体作为^^测抗体，并且其组合组成检测体系。3、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被微J求的捕获抗体羊抗Sterne抗体用量为lOpg/1.25xio6个编码微球或20-40ng/2500~5000个孩吏球/测试。4、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体兔抗Sterne抗体的生物素为羧基活性的生物素。5、如权利要求l所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗体Bio-兔抗Sterne抗体以1:50-1:5000稀释作为检测抗体进行4全测。6、一种定量检测炭疽芽孢杆菌芽孢的蛋白质悬浮芯片方法，其特征在于，该方法包括下列步骤(1)加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释，所述梯度倍比稀释为IO倍；(2)将系列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应荧光值(MFI);(3)制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应曲线；(4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；(5)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断未知样本中炭疽芽孢浓度。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕获抗体为羊抗Sterne抗体，采用生物素标记的兔抗Sterne抗体作为检测抗体，并且其组合组成4企测体系。8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的包被;微球的捕获抗体羊抗Sterne抗体用量为lOpg/1.25xio6个编码微球或20-40ng/2500-5000个孩i球/测试。9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体兔抗Sterne抗体的生物素为羧基活性的生物素。10、如权利要求6所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的一企测抗体Bio-兔抗Sterne抗体以1:50-1:5000稀释作为才企测抗体进行检测。11、一种检测炭疽芽孢杆菌芽孢的蛋白质悬浮芯片，其特征在于包括编码微球，包被微球的所述炭疽芽孢的捕获抗体、生物素标记的炭疽芽孢检测抗体、链亲和素—藻红蛋白及所述的緩沖溶液。12、权利要求ll所述的蛋白质悬浮芯片，其特征在于用于包被微球的捕获抗体为羊抗Sterne抗体，采用生物素标记的兔抗Sterne抗体作为才企测抗体，并且其组合组成4全测体系。全文摘要本发明涉及一种炭疽芽孢杆菌芽孢蛋白质悬浮芯片的制备方法、检测方法及定量方法。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了以炭疽芽孢为代表的细菌芽孢检测的开放性检测模式化平台。文档编号G01N33/569GK101504415SQ200910080259公开日2009年8月12日申请日期2009年3月17日优先权日2009年3月17日发明者蕾周,孙肖红,宇杨,杨瑞馥,静王,胡孔新申请人:中国检验检疫科学研究院