专利名称：用于抗炭疽毒素的g免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对细菌炭疸芽孢杆菌(Bacillus anthraCis)PA亚基(保护性抗原) 的灵长源化G免疫球蛋白。
现有技术炭疽是由革兰氏阳性细菌炭疽芽孢杆菌引起的传染病。该细菌是非运动性的，其 形成具有高度抗性的孢子，在例如人或动物血液或组织的环境中存在时萌发形成营养体 型。尽管非常具有抗性，所述孢子不复制，但是另一方面它们可在土壤中存活数十年。炭疽毒素介导的感染可以下列三种形式发生皮肤、肺或消化道。肺感染是最常 致命的。一旦吸入，炭疽芽孢杆菌孢子穿过肺泡，特别地，在那里它们被巨噬细胞和树突状 细胞所吞噬。在这些细胞中所述孢子萌发，营养体型在淋巴结中扩增。然后，细菌进入血液 循环，连续复制并产生毒素，部分地对该疾病的致命特性负责。炭疽毒素由三种不同的蛋白 质组成保护性抗原(PA，在细胞内酶切割之前为83kDa，切割后为63kDa)，致死因子(LF， 90kDa)和水肿因子(EF,89kDa)。致死毒素由PA和LF形成；水肿毒素由PA和EF形成，在 疾病病理中的作用较不显著。这些蛋白质通过细菌作为无毒单体分泌，聚集在靶细胞表面上形成有毒复合物。到目前为止，已经使用多种抗生素比如青霉素、多西环素和氟喹啉酮类(例如环 丙沙星)治疗炭疽感染。但是，这些抗生素中的一些可能对一些对抗生素有抗性的菌株无效。特别地，这些 治疗中的一些可能不可用于对抗恐怖主义或者细菌战争，在这些情况下可故意传播抗生素 抗性株。另外，因为抗生素不能抑制炭疽毒素作用，有必要将这些抗生素在感染的早期阶 段施用，但是由于最初症状是非特异性的，所以很难建立早期诊断。已经开发出主要成分是保护性抗原PA的疫苗，但是仅用于强烈怀疑接触过炭疽 芽孢杆菌的人。另外，由于获得足够的免疫性需要几个月的时间，所以这些疫苗不能用于紧 急情况。目前在法国，这些疫苗中没有一种被批准用于人体。因此，需要开发不同于抗生素 的新的治疗和预防方法。通过抗体的被动免疫是中和所述毒素的有效策略。已经进行了一些努力来使用针 对保护性抗原(PA)和致死因子(LF)的单克隆抗体中和炭疽致死毒素。通过使用抗体中和 炭疽致死毒素，例如可通过抑制PA与其细胞受体的结合、通过抑制PA切割、通过抑制PA与 LF的结合或者通过抑制LF作用来实现。因此，开发能够中和炭疽毒素的新型抗体以预防和有效治疗炭疽受到普遍关注。在最近的工作中，已经用保护性抗原PA83免疫短尾猴，获得用于治疗炭疽毒素介 导的人感染的抗体。本发明人从骨髓扩增了编码PA83-特异抗体片段的基因，并对其克隆 以构建文库。已经分离出称为35PA83的高亲和性(Kd = 3. 4nM)和强中和的片段(50%抑制浓5. 6+/~0. 13nM) (Laffly ^Α antimicrobial agents andchemotherapy, 2005,49 (8) 3414-3420)。免疫球蛋白片段35PA83通过抑制PA与其细胞受体的任何相互作用来中和炭疽毒但是，在准备用于将此免疫球蛋白片段用于医学(预防或治疗)用途时，改善其亲 和性可有利地降低施用给患者的量以及治疗费用。另一方面，因为该免疫球蛋白片段的猿 来源，其可带来免疫原性的风险以及人生物利用率的变化。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供获得自所述免疫球蛋白片段35PA83的针对抗原 PA的IgGl或IgG2同种型的完全免疫球蛋白，其经过预先修饰使得对抗原的亲和性提高，并 具有与人抗体更大的相似性。因此，本发明的一个目的是提供针对炭疽毒素的保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋 白(IgG)，其包含抗体35PA83的可变区，其已突变了少数残基，以及一些人来源的恒定区。本发明的另一个目的是提供编码本发明IgG的核酸，以及包含这些核酸的载体和 含有该载体的宿主细胞。本发明的另一个目的是提供包含本发明IgG的组合物以及包含所述IgG的药物组 合物。本发明的另一个目的是提供本发明的IgG在制备用于治疗或预防炭疽芽孢杆菌 感染的药物中的用途。本发明还涉及炭疸毒素检测试剂盒，体外检测炭疽毒素的方法，以及含有本发明 IgG的免疫缀合物。发明详述因此本发明的一个目的是提供针对炭疽毒素的保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋 白(IgG)，其包含-轻链可变区，其包含与序列SEQID NO=I有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序 列，和-重链可变区，其包含与SEQID NO :2有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列，并 且包含分别对应于25位丝氨酸残基、54位赖氨酸残基和60位精氨酸残基的氨基酸残基，其 特征在于由IgGl或IgG2组成。根据本发明，具有与参考的第二核酸至少90%同一性的第一核酸将具有与所述参 考的第二核酸至少 90%、优选至少 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,97. 5%,98%, 98. 3%,98. 6%,99%,99. 6%的核苷酸同一性。根据本发明，具有与参考的第二多肽至少90%同一性的第一多肽将具有与所述参 考的第二多肽至少 90%、优选至少 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,97. 5%,98%, 98. 3%,98. 6%,99%,99. 6%的氨基酸同一性。由通过比较窗口比较两个最佳比对序列来确定如本文使用的两个核酸序列或两 个多肽序列之间的“同一性百分比”。因此，所述比较窗口中核苷酸或氨基酸序列的部分可包含相比于参考序列(其不
5包含这些添加或缺失)的添加或缺失(例如“缺口”)，从而获得两个序列之间的最佳比对。通过下述步骤来计算同一性百分比确定相同的核酸碱基或相同氨基酸残基位置 的数目，其可标注于两个比较的序列，然后将观察到两者的核酸碱基或两者的氨基酸残基 之间相同的位置的数目除以比较窗口中位置的总数，之后将结果乘以100，获得两个序列之 间核苷酸同一性的百分比或者两个序列之间氨基酸同一性的百分比。可通过计算机使用已知算法来进行所述序列最佳比对的比较。最优选地，使用CLUSTALW软件(1. 82版)确定序列同一性百分比，其参数设 置如下(I)CPU MODE = Clustalff mp ； (2)ALIGNMENT = “ full “ ； (3)OUTPUT FORMAT =〃 aln w/numbers“ ； (4)OUTPUT ORDER = " aligned" ； (5)COLOR ALIGNMENT = " no"； (6)KTUP(word size) = “ default “ ； (7)WINDOW LENGTH = “ default “ ； (8)SCORE TYPE = “ percent “ ； (9)T0PDIAG = “ default “ ； (lO)PAIRGAP = “ default “ ； (11) PHYL0GENETIC TREE/TREE TYPE=" none" ； (12) MATRIX = 〃 default" ； (13) GAP OPEN ="default" ； (14) END GAPS = " default" ； (15) GAP EXTENSION = " default"； (16) GAP DISTANCES=" default" ； (17) TREE TYPE=" cladogram 〃禾口(18)TREE GRAP DISTANCES=" hide"。关于本发明抗体的轻链可变区和重链可变区上突变的注释，以及更一般性地补充 本发明抗体一些实施方案的说明，本领域技术人员可查阅2007年9月26日提交的法国专 利申请No. FR 07/06744 “用于抗炭疽毒素的抗体”的说明书，其内容附在本说明书的最后， 从48页至75页。序列SEQ ID NO 2的25位丝氨酸残基的存在对应于图11的“35H”部分上标记为 “31A”的突变，在那里此突变也可称为“G/S(31A) ”。序列SEQ ID NO 2的54位赖氨酸残基的存在对应于图11的“35H”部分上突变 “66”，在那里此突变也可称为“R/K(66) ”。序列SEQ ID NO 2的60位精氨酸残基的存在对应于可称为“K/R(73) ”的突变，并 对应于图11的“35H”部分上73位精氨酸残基。根据本发明，“对应于”25位丝氨酸残基、54位赖氨酸残基和60位精氨酸残基的残 基组成上文所述的残基，以及(i)其位于与序列SEQ ID NO 2具有至少90%同一性的序列中的相同位置，或(ii)其位于不同的位置，例如由于相比于作为参考的序列SEQ IDNO :2，与序列 SEQ ID NO :2具有90%同一性的序列包含一个或多个氨基酸缺失或添加。本发明的另一个目的是提供如上文定义的G类免疫球蛋白(IgG)，其特征在于含 有-具有序列SEQID NO 1所示氨基酸序列的轻链可变区，和
-具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重链可变区。已经通过用炭疽的保护性抗原PA83免疫短尾猴获得由Fd片段的轻链构成的免疫 球蛋白片段35PA83，如Laffly等人(2005)所述。可通过本领域技术人员已知的常规方法测定抗体的亲和性“K/。亲本非修饰抗体(即非突变的)35PA83具有3. 4 10_9M的亲和KD。已经从通过表 面等离振子共振实时测量的结合和解离常数计算得到此亲和常数，如实施例中所述。
本发明IgG的轻链可变区(SEQ ID NO 1)来自于免疫球蛋白片段35PA83的轻链 可变区，其序列可获得自计算机数据库，如Genbank，登录号为CAH17921和AJ810487。有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本发明IgG的轻链可变区另外 包含至少一个选自下列的突变-无/A(I)-无/I (2)-无/Q(3)-无/L(4)-Y/S(14)-K/R(18)-H/R(24)-L/V(124)。突变无/A(I)表示氨基酸“Α”添加在图11 “35L”部分的序列1位处，以及序列 SEQ ID NO :1的-4位处，即如果存在的话残基N°-3紧接着的上游，或者如果不存在的话残 基N°-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N°-l紧接着的上游，或者如果不存在的话残 基N°1紧接着的上游。突变无/I⑵表示氨基酸“I”添加在图11 “35L”部分的序列的2位处，以及序列 SEQ ID NO :1的-3位处，即如果存在的话残基N°-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基 N0-I紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N°1紧接着的上游。突变无/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在图11 “35L”部分的序列3位处，以及序列 SEQ ID NO :1的-2位处，S卩如果存在的话残基N°-l紧接着的上游，或者如果不存在的话残 基N°1紧接着的上游。突变无/L(4)表示氨基酸“L”添加在图11 “35L”部分的序列4位处，以及序列 SEQ ID NO 1的-1位处，即残基N°1紧接着的上游。突变Y/S(14)表示位于图11 “35L”部分的序列14位以及序列SEQ IDNO :1的10
位的氨基酸"Y"替换为氨基酸“S”。突变K/R(18)表示位于图11 “35L”部分的序列18位以及序列SEQ IDNO :1的14 位的氨基酸"K"替换为氨基酸“R”。突变H/R(24)表示位于图11 “35L”部分的序列24位以及序列SEQ IDNO :1的20 位的氨基酸"H"替换为氨基酸“R”。突变L/V(124)表示位于图11 “35L”部分的序列124位以及序列SEQ IDNO 1的 100位的氨基酸"L"替换为氨基酸“V”。优选地，添加这些突变中至少一个能够使得相比于其所来源的片段35PA83降低 本发明IgG轻链可变区的免疫原性。特别有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本发明IgG的轻链可变区 包含下列的突变-无/A(I)-无/I (2)-无/Q(3)
7
-无/L (4)。特别有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本发明IgG的轻链可变区 包含下列的突变-无/A(I)-无/I(2)-无/Q(3)-无/L(4)-Y/S(14)-K/R(18)-H/R(24)-L/V(124)。优选地，添加这些残基能够使得相比于其所来源的片段35PA83降低本发明IgG轻 链可变区的免疫原性。本发明IgG的重链可变区(SEQ ID NO 2)来自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd 片段的可变区，其序列已在计算机数据库中登记，如Genbank，可通过登录号CAH17920和 AJ810486 获取。有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重链可变区另外包含至少一个 选自下列的突变-无/Q(I)-无/V ⑵-无/Q(3)-无/L(4)-无/Q(5)-无/E (6)-L/V(12)-Α/Τ (24)-Α/Τ (122)-V/L(123) ο突变无/Q⑴表示氨基酸“Q”添加在图11上“35H”部分的序列1位处，以及序列 SEQ ID NO :2的-6位处，S卩如果存在的话残基N°-5紧接着的上游，或者如果不存在的话残 基N°-4紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N°-3紧接着的上游，或者如果不存在的话 残基N°-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N°-l紧接着的上游，或者如果不存在的话 残基N°1紧接着的上游。突变无/V⑵表示氨基酸“V”添加在图11上“35H”部分的序列2位处，以及序列 SEQ ID NO :2的-5位处，S卩如果存在的话残基N°-4紧接着的上游，或者如果不存在的话残 基N°-3紧接着的上游，或者如果不存的话残基N°-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基 N0-I紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N°1紧接着的上游。突变无/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在图11上“35H”部分的序列3位处，以及序列 SEQ ID NO :2的-4位处，S卩如果存在的话残基N°-3紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N°_2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N°_l紧接着的上游，或者如果不存在的话残 基N°1紧接着的上游。突变无/L(4)表示氨基酸“L”添加在图11上“35H”部分的序列4位处，以及序列 SEQ ID NO :2的-3位处，S卩如果存在的话残基N°-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基 N0-I紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N°1紧接着的上游。突变无/Q (5)表示氨基酸“Q”添加在图11上“35H”部分的序列的5位处，以及序 列SEQ ID NO :2的-2位处，S卩如果存在的话残基N°-l紧接着的上游，或者如果不存在的话 残基N°1紧接着的上游。突变无/E(6)表示氨基酸“Ε”添加在图11上“35Η”部分的序列的6位处，以及序 列SEQ ID NO 2的-1位处，即残基N0I紧接着的上游。突变L/V(12)表示位于图11上“35H”部分的序列的12位处以及序列SEQ ID NO 2的5位处的氨基酸"L"替换为氨基酸V。突变A/T(24)表示位于图11上“35H”部分的序列的14位处以及序列SEQ ID NO 2的17位处的氨基酸"A"替换为氨基酸T。突变A/T(122)表示位于图11上“35H”部分的序列的122位处以及序列SEQ ID NO :2的113位处的氨基酸〃 A"替换为氨基酸T。突变V/L的(123)表示位于图11上“35H”部分的序列的123位处以及序列SEQ ID NO 2的114位处的氨基酸〃 V"替换为氨基酸L。优选地，添加这些突变中至少一个能够使得相比于其所来源的片段35PA83降低 本发明IgG重链可变区的免疫原性。本发明IgG的重链可变区(SEQ ID NO 2)来自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd 片段的可变区，其序列已经在计算机数据库中登记，如Genbank，可通过登录号CAH17920和 AJ810486获取。与免疫球蛋白片段35PA83的可变区相比，本发明的重链可变区(SEQ ID NO 2)经过修饰，因为其包含三个下列突变:G/S(31A)、R/K(66)和K/R(73)。有利地，相比 于免疫球蛋白片段35PA83可变区，这三个突变使得能够改善根据本发明IgG重链可变区的 亲和性。特别有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重链可变区另外包含下列 的突变-无/Q(I)-无/V ⑵-无/Q(3)-无/L(4)-无/Q(5)-无/E(6)。特别有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重链可变区另外包含下列 的突变-无/Q(I)-无/V ⑵-无/Q(3)
9
-无/L(4)-无/Q(5)-无/E(6)-L/V(12)-Α/Τ (24)-Α/Τ (122)-V/L(123) ο优选地，添加这些突变中至少一个能够使得相比于其所来源的片段35PA83降低 本发明IgG轻链可变区的免疫原性。在本发明的一个特定实施方案中，所述抗体的轻链可变区(SEQ IDNO=I)包含下 列突变-无/A(I)-无/I(2)-无/Q(3)-无/L(4)，以及，所述抗体的重链可变区(SEQ ID NO 2)包含下列突变-无/Q(I)-无/V ⑵-无/Q(3)-无/L(4)-无/Q(5)-无/E(6)。有利地，本发明IgG的轻链恒定区包含包含序列SEQ ID NO 3的氨基酸序列，重链 恒定区包含包含序列SEQ ID NO 4的氨基酸序列。出于说明本发明的目的，术语“免疫球蛋白”旨在表示具有特异性结合特定抗原能 力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子片段。公知的免疫球蛋白片段为例如F(ab' )2、 Fab、Fv、scFv 禾口 Fd 片段。G型免疫球蛋白(IgG)是由通过二硫键彼此结合的2条重链和2条轻链组成的异 二聚体。每个链由N端位置的所述免疫球蛋白针对的抗原特异性的可变区或结构域(轻链 由重排的基因V-J编码，重链由V-D-J编码)以及C端位置的恒定区构成，所述恒定区对轻 链来说由单个结构域CL或者对重链来说由三个结构域(CHpCH2和CH3)组成。重链和轻链 的可变结构域以及CH1和CL结构域的相互作用形成Fab部分，其通过非常柔性的铰链区与 Fc区域连接，使得每个Fab结合其抗原靶标，同时介导所述抗体效应子性质的Fc区域保持 可接近免疫效应子、吞噬细胞或杀伤细胞以及补体；这些恒定区不参与抗原的结合。由2个 球形结构域CH2和CH3构成的Fc区域在CH2结构域上糖基化，在两条链的每一条上存在结 合于Asn 297的乳糖胺类型的双天线N-聚糖。关于可变区，其涉及所述抗体与其表位的结合。恒定区(Fe)已经过酶促切割使得从其中保留绞链区的抗体称为F(ab' )2片段， 其保留两个抗原结合位点。
类似地，其恒定区的绞链区已经过酶促切割或者产生没有该区域的恒定区的抗体 称为Fab片段，其保留两个抗原结合位点中的一个。Fd片段由VH和CH1区域形成。决定互补性的区域(⑶R，互补决定区)位于可变区中，也称为高变区，其直接与抗 原相互作用。对CDR进行修饰使得有可能修饰抗体的亲和性。位于可变区中的第二种类 型区域称为构架区(FR)，其保留CDR的三级结构。这些构架区对抗体来源的物种来说是相 对特异性的。有四个构架区(FRl至FR4)位于在重链和轻链的Fd片段中，其分别由三个 CDR(CDR1 至 CDR3)所隔开。根据上文对本发明抗PA IgG的重链可变区和轻链可变区氨基酸的描述，本领域技 术人员能够合成或使得合成编码这些氨基酸序列的核酸。有利地，本发明IgG的每个轻链和重链的恒定区是人恒定区。优选地，本发明IgG每个轻链的恒定区是κ类型。任何同种异型可适用于实施本 发明，例如Km(1)、Km(1，2)、Km(1，2，3)或Km(3)，尽管优选的同种异型是Km(3)。每个抗体重链的恒定区可以是Yl型、Y 2型或Y 3型，这三种类型的恒定区具有 附着人补体的特征，或者Y 4型。优选地，每个抗体重链的恒定区是Yl型，因为此类抗体能够在最大量的个体 (人)中诱导ADCC活性。在这方面，任何同种异型可适用于实施本发明，例如Glm(3)、 Glm(l，2，17)、Glm(l，17)或 Glm(l，3)。优选地，同种异型是 Glm(l，17)。有利地，本发明IgG的每个重链恒定区是Y 1型，包含SEQ ID NO 4的氨基酸序 列，本发明IgG的每个轻链恒定区包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列。有利地，本发明的IgG的每个轻链包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列，本发明IgG的 每个重链包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供编码本发明IgG的核酸。本发明IgG的每个轻链可变区由核酸序列SEQ ID NO 7编码，根据本发明的每个 抗体重链的可变区由小鼠核酸序列SEQ ID NO 8编码。在本发明的一个特定方面，本发明IgG的每个重链恒定区由人核酸序列SEQ ID NO :9编码，其每个轻链恒定区由人核酸序列SEQ ID N0:10编码。更特定地，根据本发明的每个抗体轻链由核酸序列SEQ ID NO 11编码，每个重链 由核酸序列SEQ ID NO 12编码。本发明的另一个目的是提供包含编码本发明IgG的核酸的载体。本文使用的“载体”表示可通过限制性酶切然后连接插入目的序列的核酸，其用于 转移到多种遗传环境及其中或者用于在宿主细胞中表达。载体例如是质粒、粘粒、酵母人工 染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和来源于噬菌体Pl的人工染色体(PAC)、病毒来源的 载体。克隆载体是能够在宿主细胞中复制的载体，其另外的特征在于存在一个或多个核酸 内切酶限制性位点。表达载体是其中通过限制性酶切或连接的方法插入了目的DNA序列使 得能够复制和/或转录成RNA的载体。所述载体可另外含有一个或多个标志物，用以选择 或鉴定已经被所述载体转化或转染的细胞。这些核酸可引入到重组载体中，用以克隆或表达本发明的抗体。本发明包括所有用于真核或原核细胞转化、转染或基因治疗的含编码序列的重组载体。根据分子生物学的常规方法制备这些载体，其还包含合适的启动子，任选地用于输出 或分泌的信号序列以及所述核苷酸序列转录所需的调节序列。纯化本发明抗体可能需要融合多肽。所述融合结构域可包含例如多组氨酸尾，其 使得能够在M2+柱上纯化或者丝状噬菌体膜锚，其特别可用于根据称为“噬菌体展示”的技 术筛选文库。适用于本发明背景的载体有适于接受和表达第一和第二 DNA序列的重组DNA分 子，使得能够表达异二聚化抗体，例如根据本发明的全长抗体或F(ab' )2或Fab片段。这 些载体提供了在载体中所存在的两个分开的盒中独立克隆两种DNA序列的系统，使得形成 表达所述异二聚体抗体的第一和第二多肽的两个分离的顺反子。这些表达载体称为双顺反 子载体。本发明的经修饰抗体可在真核细胞比如CHO细胞或者人或小鼠杂交瘤细胞例如 以及转基因植物和动物细胞中产生。本发明的另一个目的是提供原核或真核的宿主细胞，其包含根据本发明的载体。有利地，本发明表达载体使得能够表达本发明IgG的轻链。在此特定实施方案中， 所述载体是核酸分子，其中插入了编码每个IgG轻链的可变区的核酸序列SEQ ID N0:7以 及编码每个抗体轻链的恒定区的核酸序列SEQ ID NO :10，从而将它们引入宿主细胞并保持 于其中。其使得能够在宿主细胞中表达这些核酸外源片段，因为其具有此表达所需的序列 (启动子、多腺苷化序列、选择基因)。这些载体是本领域技术人员公知的，可以是腺病毒、 逆转录病毒、质粒或噬菌体，此列表是非限制性的。另外，任何哺乳动物细胞可用作宿主细 胞，也就是说表达本发明IgG轻链的表达载体所携带的核酸片段的细胞，例如YB2/0、CH0、 CHO dhfr-(例如 CHO DXBl 1、CHO DG44)、CHO Lecl3、SP2/0、NS0、293、BHK 或 COS。有利地，本发明的表达载体使得能够表达本发明IgG的重链。在此特定实施方案 中，所述载体是使得能够表达本发明IgG的分子，其重链由核酸序列SEQ ID N0:12所编 码。此载体是核酸分子，其中已经插入编码每个IgG重链的可变区的核酸序列SEQ ID NO 8以及编码每个抗体重链的恒定区的核酸序列SEQ ID NO :9，使得将它们引入宿主细胞并 将其保持在那里。其使得能够在宿主细胞中表达这些核酸外源片段，因为其具有此表达所 需的序列(启动子、多腺苷化序列、选择基因)。如上所述，所述载体可以是例如质粒、腺 病毒、逆转录病毒或噬菌体，并且宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞，例如YB2/0、CHO、CHO dhfr- (CHO DX Bll、CH0DG44)、CHO Lecl3、SP2/0、NS0、293、BHK 或 COS。本发明的载体可包含编码本发明免疫球蛋白的重链和/或轻链的序列。实现本发明IgG重链和轻链表达的载体实例在实施例2中给出。此载体是含有针 对本发明IgG的重链和轻链的两个转录单元的独特载体。本发明的另一个目的是提供包含例如如上所述定义的载体的宿主细胞。有利地，本发明宿主细胞选自SP2/0，YB2/0, IR983F，Namalwa人骨髓瘤， PERC6, CHO 细胞系，特别是 CH0-K-1，CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec 13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4，C0S-7，293-ΗΕΚ，BHK, Κ6Η6, NSO, SP2/0_Ag 14 和 P3X63Ag8. 653。在一个优选实施方案中，在YB2/0大鼠杂交瘤(YB2/3HL.P2.G11. 16Ag. 20细胞，其 以登录号ATCC CRL-1662提交于美国典型培养物保藏中心)中产生所述抗体。选择该细胞系是因为其能够产生具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性的抗体，其相比于 在例如CHO细胞中获得的类似一级结构的抗体有改善。在本发明的一个特定方面，表达本发明抗体的稳定细胞系，更特别地选自上述的 那些群体，整合了例如上述的重链和轻链的表达载体之一或之二。本发明的另一个目的是提供包含至少一种本发明IgG的组合物。本发明的另一个目的是提供包含至少一种本发明IgG的药物组合物。所述药物组合物优选地包含可药用载体。本文使用的这些载体旨在表示不干扰所 述组合物活性组分生物活性效力的无毒材料。表述“可药用”指与生物学体系例如细胞、细 胞培养物、组织或有机体相容的无毒材料。所述载体的特征依赖于施用方法。本发明涉及至少一种本发明的IgG在制备用于治疗或预防炭疽芽孢杆菌感染的 药物组合物或药物中的用途。本文使用的术语“预防”意为在个体特别是人中疾病尚未出现之前防止所述疾病 的发生。本文使用的术语“治疗”对应于对该疾病的抑制，即停止其发展、消退、或者疾病的 症状和后果消失、或者疾病的原因消失。可标记本发明的IgG。合适标志物的例子包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体 金属、化学发光化合物和生物发光化合物。标志物与抗体的结合方法是本领域技术人员公知的。另一种标记方法为将所述抗体与低分子量半抗原偶联，所述半抗原可通过第二反 应进行具体修饰。合适半抗原的例子包括生物素，其与亲和素反应，或者二硝基酚、吡哆醛 或荧光素，其与抗半抗原特异性抗体反应。本发明的一个目的是提供含PA炭疽毒素检测试剂盒。该试剂盒包含-包含至少一种本发明抗PAIgG的容器，该抗体带有标记或未带标记，-任选地，包含缓冲溶液的容器，-和任选地包含带标记IgG检测工具的容器，例如与报告分子如荧光或酶标记物 相结合的生物素-结合蛋白，如亲和素或链霉亲和素。此容器还可包含非标记的IgG检测 工具，即基本上的抗体或抗体片段。本发明的IgG可用于体外，例如在免疫学测定中，其中它们在液相中或者固定于 固相载体上使用。公知载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖、尼龙、淀粉 酶、天然或改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖或磁铁。使用本发明抗PA IgG的免疫学测定的 实例有放射性免疫测定、组织免疫学标记技术、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀测定、免疫扩 散测定、补体固定测定、荧光激活细胞分选测定(Fluorescence-activatedCell Sorting, FACS)或者蛋白质芯片分析。本发明的另一个目的是提供用于体外检测生物样品中含PA炭疽毒素的方法，其 包括下列步骤-将所述样品与包含至少一种本发明抗PAIgG相接触，和-检测所述抗体的结合，作为所述炭疽毒素的存在的指示。生物样品可以是液体例如唾液、尿、脑脊液、血清或血液，或者固体或半固体，例 如组织或粪便或实体组织例如常规用于组织学诊断的。
13
本发明的另一个目的是提供用于体内检测含PA炭疽毒素的方法，其中向个体施 用带标记的本发明IgG。带标记IgG的施用量应足以使得所述抗体结合待检测的毒素。带 标记IgG的施用量取决于一些因素，例如个体的年龄和性别，以及疾病的阶段。所述施用量 可以为 0. 01mg/kg 至 50mg/kg 不等，优选 0. lmg/kg 至 20mg/kg，更优选 0. lmg/kg 至 2mg/kg。为了实施体内诊断，本发明经修饰的抗PA IgG应直接或通过官能团间接与放射性 同位素相连。通常使用的官能团包括例如二亚乙基-三胺-五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙 酸(EDTA)。放射性同位素金属离子的例子包括mIn，97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As,89&和2Q1T1。为了使用磁共振成像(MRI)或者通过电子自旋共振(ESR)进行诊断，经修饰的本 发明抗PA IgG也可用顺磁同位素标记。还可使用发射正电子的Y放射性同位素，例如 157Gd, 55Mn, 162Dy, 68Ga, 52Cr 和 56Fe0本发明的IgG也可用于体外或体内监测疾病治疗的发展，例如通过确定炭疽毒素 靶向的细胞数增加或减少，或者生物样品中PA毒素浓度的变化。本发明的一个目的是提供治疗可能被炭疽芽孢杆菌感染的个体、优选人的方法， 其中向所述个体施用治疗有效量的根据本发明修饰的抗PA抗体。本文使用的表述“治疗有效量”旨在表示在施用给需要治疗的个体时足以实施该 治疗的量。治疗有效量取决于个体、所治疗疾病的阶段以及施用方法，其由本领域技术人员 通过常规程序确定。本文使用的术语“炭疽，，旨在表示任何由炭疽芽孢杆菌感染直接地或间接地造成 的疾病。吸入感染的最初症状与鼻炎类似(发烧、肌肉痛)。数天后，这些症状发展为呼吸 困难和脓毒性休克的严重问题。吸入炭疽细菌通常是致命的。在细菌通过之前存在的皮肤间隙穿透皮肤时，发生炭疽皮肤感染。此感染最初导 致形成丘疹，其在两到三天内发展成小泡，之后发展为1至3厘米直径的溃疡，中心有坏死 区域。炭疽肠胃传染是由摄入受污染的肉引起的，其特征在于肠道急性炎症。治疗有效量对应于足以减轻少疾病症状和感染发展的量。该量根据个体的年龄和 性别以及疾病阶段而不同，由本领域技术人员所决定。治疗有效量可以是每天一剂或多剂 中 0. 0lmg/kg 至 50mg/kg 不等，优选 0. lmg/kg 至 20mg/kg,更优选 0. lmg/kg 至 2mg/kg,持 续一天或更长。施用方法可以是注射或逐渐输注。注射可以是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或者透 皮类型。用于胃肠外施用的制剂可包含无菌水溶液或非水溶液、混悬液或乳剂。非水溶剂 的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄或者可注射有机酯例如油酸乙酯。水载体包 括水、醇/水溶液、乳剂或混悬液。本发明的另一个目的是提供免疫缀合物，其包含与治疗剂直接或间接相结合的本 发明IgG。这些治疗剂包括化学剂、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素或酶 抑制剂。毒素的例子有白喉毒素A链、外毒素A链、篦麻毒蛋白A链、红豆碱A链、蒴莲根 毒蛋白A链、α-帚曲毒素、Aleurite fordii蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogelline、局限曲菌素(restrictocine)、酚霉
14素(phenomycine)、enomycine 禾口 tricothecenes。放射性核素的例子包括 212Bi, 1311，131In, 90Y 和 186Re。有利地，本发明IgG与基于四环素的预防性治疗相结合。通过在基于四环素的快 速治疗(“短期治疗”)之后注射本发明IgG，本发明IgG通过在暴露风险之后以安全的方 式停止使得能够缩短基于四环素的预防。有利地，本发明IgG与使用环丙沙星的治愈性治疗相结合。使用下列有关抗PA IgG制剂例子的补充描述更容易理解本发明。
在下列实施例中，将提及下文以举例形式给出的附图图1 区域VKV2(本发明IgG的轻链可变区，其包含表1所述的突变)的扩增示意 图。图2 区域VHV2 (本发明IgG的重链可变区，其包含表2所述的突变)的扩增示意 图。图 3 载体 CHK463-23 的图。图 4 载体 HK558-12 的图。图5 使用IgG 35PA83v2(包含表1和表2所述突变的本发明IgG)的预防性治疗。 2mg/kg的IgG 35PA83v2使得能够获得60%的存活率，5mg/kg使得能获得100%的存活。直 至第30天，未观察到新事件。图6 使用四环素的预防性治疗。在第7天后停止四环素施用，该治疗停止后第4 至第7天之间所有小鼠死亡。图7:使用多西环素的预防性治疗，补充或不补充IgG 35PA83。在A/J小鼠中起 始基于四环素的治疗(5mg/kg的每日剂量)。12小时后，用10 OOOLD50的Sterne菌株孢子 感染动物。在注射或不注射35PA83(1或2mg/kg)的情况下，在治疗的第7天停止四环素注 射。超过图上所示时间段未观察到特殊事件(第500小时)。在图上用符号"指示 出高度显著的作用。图8:基于环丙沙星的治疗，IgG 35PA83v2或其两者。单独使用环丙沙星或IgG 35PA83v2基本上没有存活，而两种分子的组合实现了 80%的存活率。直至第30天，未观察 到新事件。图9 使用补充或未补充IgG 35PA83的环丙沙星的治疗。用IOOOLD5q的Steme孢 子感染A/J小鼠。感染后12小时，在两个独立的组中(每组10只动物)，开始单独的基于 环丙沙星的治疗(每天两次25mg/kg)，持续5天，或者注射单剂IgG 35PA83 (10mg/kg)。在 感染后的三个不同时间(12、24或48小时)，每次由不同组的动物参加，小鼠接受联合的基 于环丙沙星的治疗(每天两次25mg/kg，共5天)加一次注射IgG 35PA83 (lOmg/kg)。超 过图上所示时间段未观察到特殊事件(第150小时)。在图上用符号"*" (ρ = 0.03) 或"(ρ = 0. 0007)指示出显著作用。图10 使用IgG 35PA83的被动预防性治疗。感染(IOOOOLD5q)之前12小时施用一 次35PA83注射(2mg/kg或5mg/kg)。在第30天，对30天后仍然存活的小鼠再次感染(10 OOOLD5tl)。超过图上所示时间段未观察到特殊事件(第40天)。在图上用符号〃 ***〃指示出高度显著的作用(P = 0. 0001)。图11 非突变35PA83抗体重链可变区和轻链可变区的珍珠串构型。IMGT珍珠串构型是与IMGT命名法一致的。点表示非常类似于35PA83的人基因与 35PA83的差异。阴影环对应于根据IMGT命名法的缺失位置。
实施例实施例1 构津Fab(35PA83)突变体文库材料和方法大肠杆菌菌株使用下列大肠杆菌菌株-XLl (Stratagene, the jolla, CA) :recAl, endAl, gyrA96 thi-1 hsdR17sup E44 relAl lac[F' proAB lacIqZAM15 TnlO(Tetr)].-SURE(Stratagene) :el4(McrA) Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endAlsupE44 thi-1 gyrA96 relAl lac recB recj sbcC umuC::Tn5(Kanr)uvrC[F ' proAB IacIqZ Δ M15 TnlO(Tetr)]-HB2151 (Carte 等人，1985)，用于表达可溶性 Fab。毒素炭疽毒素(PA83，LF和EF)获得自List实验室。构建35PA83突变体文库构建免疫球蛋白片段35PA83的突变体以人源化。通过实施如表3和4中所述的 突变获得该突变体表1 为了人源化35PA83轻链的突变
权利要求
针对炭疽毒素保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋白(IgG)，其包含 轻链可变区，其包含与序列SEQ ID NO1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和 重链可变区，其包含与SEQ ID NO2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，并且包含对应于25位丝氨酸残基、54位赖氨酸残基和60位精氨酸残基的氨基酸残基，其特征在于它由IgG1或IgG2组成。
2.根据权利要求1的G类免疫球蛋白，其特征在于它包含 -具有序列SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的轻链可变区，和 -具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重链可变区。
3.根据权利要求1的IgG，其特征在于轻链可变区(SEQID No 1)包含选自下列的至 少一个突变-无/A⑴ -无/I⑵ -无/Q⑶ -无/L (4) -Y/S(14) -K/R(18) -H/R(24) -L/V(124)。
4.根据权利要求3的IgG，其特征在于轻链可变区(SEQID No 1)包含下列突变 -无/A⑴-无/I⑵ -无/Q⑶ -无/L (4) -Y/S(14) -K/R(18) -H/R(24) -L/V(124)。
5.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于重链可变区(SEQIDNo 2)包含选自下 列突变的至少一个突变-无/Q⑴ -无/V⑵ -无/Q⑶ -无/L (4) -无/Q (5) -无/E (6) -L/V(12) -Α/Τ (24) -Α/Τ(122) -V/L(123)。
6.根据权利要求4的IgG，其特征在于具有序列SEQID NO :2所示氨基酸序列的重链 可变区包含下列突变-无/Q⑴ -无/V⑵ -无/Q⑶ -无/L (4) -无/Q (5) -无/E (6) -L/V(12) -Α/Τ (24) -Α/Τ(122) -V/L(123)。
7.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其轻链恒定区包含序列SEQID NO 3 所代表的氨基酸序列，并且重链恒定区包含由序列SEQID NO :4代表的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其每个重链的恒定区为Yl型。
9.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其每个重链的恒定区为Yl型并且包 含氨基酸序列SEQ ID NO :7，并且其每个轻链的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID No :8。
10.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其每个轻链包含氨基酸序列SEQID NO :9，并且其每个重链包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。
11.编码权利要求1至10任一项抗体的核酸。
12.包含权利要求11的核酸的载体。
13.包含权利要求12的载体的宿主细胞。
14.根据权利要求13的宿主细胞，其特征在于它是选自SP2/0，YB2/0,IR983F， Namalwa 人骨髓瘤，PERC6, CHO 细胞系，特别是 CHO-K-l，CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec 13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4，C0S-7，293-ΗΕΚ，BHK, Κ6Η6, NS0, SP2/0-Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的细胞。
15.包含至少一种根据权利要求1至10任一项的人IgG的组合物。
16.包含至少一种根据权利要求1至10任一项的人IgG的药物组合物。
17.根据权利要求1至10任一项的人IgG在制备用于治疗或预防炭疽芽孢杆菌感染的 药物中的用途。
18.用于检测含PA炭疽毒素的试剂盒，所述试剂盒包含-包含至少一种标记的根据权利要求1至10任一项的IgG的容器，和 -包含检测此经标记的IgG之工具的容器。
19.体外检测生物学样品中含PA炭疽毒素的方法，其包括下列步骤 -将所述样品与至少一种根据权利要求1至10任一项的IgG相接触，和 -检测所述IgG的结合，作为所述炭疽毒素存在的指示。
20.免疫缀合物，其包含与治疗剂结合的根据权利要求1至10任一项的IgG。
全文摘要
本发明涉及针对炭疽毒素保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋白(IgG)，其包含轻链可变区，其包含与如说明书中所定义的序列SEQ ID NO1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和重链可变区，其包含与如说明书中所定义的SEQ ID NO2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，其特征在于它由IgG1或IgG2组成。
文档编号G01N33/569GK101952311SQ200880118635
公开日2011年1月19日 申请日期2008年11月28日 优先权日2007年11月29日
发明者C·贝朗, P·蒂利耶 申请人:Lfb生物技术公司;由军事总代理代表的法国国家