专利名称：一种制备重组炭疽保护性抗原的方法及其专用表达质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白的制备方法及其专用表达质粒，特别是涉及制备重组炭疽保护性抗原的方法及其专用表达质粒。
背景技术：
炭疽毒素包括三种蛋白因子，即保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)，其中PA能诱导机体的保护性免疫，是目前获美国食品和药品监督管理局(FDA)批准的炭疽疫苗(anthrax vaccine adsorbed，AVA)的主要免疫活性成分。目前AVA的生产仍沿用传统工艺，用Al(OH)3从炭疽减毒株的培养物中吸附PA，因此含有微量的其他成分，如LF、EF等，AVA在使用中出现的局部疼痛、水肿等副作用可能与此有关。此外，AVA免疫程序也较繁琐，需18个月内免疫6针，其后每年需加强免疫一次。疫苗生产时需要较高的生物安全设施，也加大了其生产成本。因此，目前各国都在发展基于重组PA的基因工程疫苗。
PA基因全长2295bp，编码29个氨基酸的信号肽和735个氨基酸的成熟蛋白(DuesberyNS，Vande Woude GF.Anthrax toxins.Cell Mol Life Sci，1999，55(12)1599-1609.)用基因工程方法表达PA国外已有一些报道，但存在产量低，在表达过程中易降解，或难以纯化等问题。研究显示，用枯草杆菌或杆状病毒表达重组PA(rPA)产量较低，实用价值不大。用乳酸菌或沙门氏菌表达PA来发展口服疫苗虽有创新，但短期内难以投入实际应用。用pQE30载体系统在大肠杆菌中表达rPA，虽然产量较高，但重组蛋白形成包涵体，在纯化过程中需要变性、复性步骤，可能影响蛋白形成天然构象；此外该系统在重组蛋白上融合了6×His标签，给今后的应用带来困难，因为作为人用疫苗的成分最好不含外源标签序列。也有作者在大肠杆菌中分泌表达rPA，但表达量较低，1L培养物只能获得约3mg rPA。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用大肠杆菌高效表达重组炭疽保护性抗原的方法及其专用的质粒。
本发明所提供的重组炭疽保护性抗原的表达质粒，其DNA序列为序列表中的序列1或在高严谨条件下可以与序列1杂交的序列。质粒命名为pAS-PA。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
制备重组炭疽保护性抗原的方法，是用重组炭疽保护性抗原的表达质粒转化大肠杆菌，获得工程菌株，发酵得到目的产物；所述表达质粒的DNA序列为序列表中的序列1或在高严谨条件下可以与序列1杂交的序列。
所述发酵得到的目的产物经过下述步骤得到纯化1)细菌外周质分离；2)离子交换；3)疏水层析；4)凝胶过滤。
所述发酵工程菌株的过程是从固体培养基上挑取工程菌单菌落，接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃250转/分培养至0D600 0.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃250转/分诱导表达5h，离心收集细菌沉淀。
用本发明的表达质粒和制备方法可在大肠杆菌中实现rPA的高效分泌型表达，其优点是一方面使rPA以可溶形式表达保持其正确构象；另一方面防止rPA被胞内蛋白酶降解。经过纯化每升培养物可获得rPA约15mg，纯度高于95％，其N端序列与天然炭疽保护性抗原完全一致，并且具有较好的生物学活性和免疫原性，具有广泛的应用价值和深远的理论意义。
图1为质粒pAS-PA的结构示意图。
图2为本发明表达与纯化不同阶段的SDS-PAGE电泳图。
图3为Western Blot图。
图4为显示生物学活性的曲线图。
具体实施例方式
实施例1、表达质粒pAS-PA的构建1、表达载体pAS20的构建以通用表达载体pASK84(Skerra A.A general vector，pASK84，for cloning，bacterial production，and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 1994，14179-84.)为模板，将其与通用克隆载体pUC18分别用EcoR I/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收pASK84的载体片段和pUC18的多克隆位点片段，将二者连接后通过TSS法转化大肠杆菌XL1-blue，提质粒用EcoR I/HindIII酶切鉴定，对多克隆位点插入正确的质粒进行序列测定，序列正确的质粒命名为pAS18。将pAS18用BamH I/HindIII双酶切，电泳回收载体片段，用Klenow酶补平后连接，通过TSS法转化XL1-blue菌，提质粒进行序列测定，序列正确的质粒命名为pAS20。其中，测序引物为P185’-GCTTCCGGCTCGTATAATGTG-3’。
2、PA基因的克隆用常规分子生物学方法将炭疽保护性抗原PA基因插入表达载体pAS20。PA基因从炭疽杆菌A16R株(购自兰州生物制品所)中以PCR方法获得。PCR引物PA 5’端引物5’-AGGAGAACCGGTTATTAAATGAATC-3’PA 3’端引物5’-CGCGAGCTCTTATCCTATCTCATAGCCTTTTTTAG-3’SacI从培养A16R菌株的琼脂平板上挑取少量细菌，置100μL纯水中，煮沸10分钟，离心后取5μL上清进行PCR反应。反应总体积50μL，含1×Ex Taq buffer，0.2mmol/LdNTPs，引物各0.5μmol/L，2.5U Ex Taq。94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃120s，30循环，72℃延伸5min。
3、表达质粒pAS-PA的构建PCR产物用SacI酶切，形成5’平末端3’粘末端；载体pAS20用PstI切后，用T4DNA聚合酶处理成平末端，再用SacI酶切，也形成5’平末端3’粘末端。载体和片段连接后常规转化E.coli DH5α，PCR(引物与条件同步骤2)筛选阳性克隆，提质粒进行酶切鉴定和序列测定，测序引物同步骤1。序列正确的质粒命名为pAS-PA(如图1所示)。
实施例2、重组炭疽保护性抗原(rPA)的表达及纯化1、表达从固体LB培养基上挑取被质粒pAS-PA转化的E.coli DH5α工程菌单菌落，接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃250转/分培养至0D600＝0.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃250转/分诱导表达5h，离心收集细菌沉淀。
2、细菌外周质的分离1L诱导培养物离心后的菌体，用100mL 20％蔗糖溶液(20mmol/L TrispH8.0，1mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF)重悬，冰上放置5min，4℃8000g离心20min。沉淀用100mL 5mmol/L MgSO4(1mmol/L PMSF)重悬，冰上放置10min，4℃10000g离心10min，收集上清液用于纯化rPA。
3、离子交换将步骤2中收集的上清液先用Q Sepharose进行粗纯化。以平衡缓冲液(20mmol/LTris pH8.0)平衡柱，调节样品盐浓度至20mmol/L Tris pH8.0后上样。用含0.5mol/LNaCl的平衡缓冲液进行洗脱。分部收集洗脱液，进行12％SDS-PAGE分析。
含rPA的管合并后用Source 30Q进行下一步纯化。以平衡缓冲液(同上)平衡柱，样品稀释5倍后上样。用含0～0.25mol/L NaCl的平衡缓冲液梯度洗脱。
4、疏水层析将步骤3的Source 30Q洗脱液合并后用phenyl sepharose疏水柱进一步纯化。以含1.0mol/L硫酸胺的缓冲液(20mmol/L Tris pH8.0)平衡柱，调节样品液至同样盐浓度后上样，用含1.0～0mol/L硫酸胺的同样缓冲液梯度洗脱。
5、凝胶过滤将步骤4的洗脱液合并后用Centriplus YM-30超滤管(Millipore)浓缩，再过Superdex 200凝胶柱，用PBS洗下rPA，-70℃保存。1L培养物经纯化后可获得约15mgrPA，用HPLC方法分析rPA的纯度为97％。
6、凝胶电泳与免疫印迹分析将各步纯化样品进行12％SDS-PAGE，观察纯化效果，结果如图2所示，图中1，工程菌诱导前；2，工程菌诱导后；3，含rPA的细菌外周质；4，Q Sepharose纯化后；5，Source 30Q纯化后；6，phenyl Sepharose纯化后；7，Superdex 200纯化后；M，蛋白分子量标准。从图中可以明显看出，随着本发明工艺步骤的进程，目的蛋白rPA得到表达后，逐步得到了纯化。将经10％SDS-PAGE后的rPA电转移至PVDF膜上，进行蛋白N端测序，结果前5个氨基酸为EVKQE，与天然PA一致，表明信号序列已被正确切去，得到的产物是正确的。
用抗-PA单克隆抗体(以rPA为抗原，制备方法见《免疫学常用实验方法》，北京人民军医出版社，200023-50)为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG(Sigma)12000稀释为二抗，按照常规方法进行Western blot分析，结果如图3所示，图中1，工程菌诱导前；2，工程菌诱导后；3，含rPA的细菌外周质；4，Q Sepharose纯化后；5，Source 30Q纯化后；6，phenyl Sepharose纯化后；7，Superdex 200纯化后，图中的结果可以证明PA基因确实得到了表达，同时表达产物得到了纯化。
实施例3、本发明方法制备的rPA的生物活性和免疫原性分析1、rPA的生物活性分析炭疽保护性抗原(PA)与致死因子(LF)结合称为致死毒素(lethal toxin，LT)，在体外可导致敏感细胞(如小鼠巨噬细胞J774A.1)的死亡。
将小鼠巨噬细胞J774A.1以105/ml接种于96孔培养板，长至90％满，不同浓度的rPA与重组LF(rLF，制备方法见Gupta P，et al.Expression and purificationof the recombinant lethal factor of Bacillus anthracis.Infection and Immunity1998，66(2)862-865.)加入细胞孔中，37℃孵育3h，用MTT法观察细胞存活率。结果如图4所示，当固定rPA与rLF其中的一种，增加另一种蛋白的浓度时，细胞存活率明显下降；而只加入rPA或rLF的细胞孔无明显变化，表明rPA有较好的生物学活性。
2、rPA的免疫原性分析用rPA免疫健康的家兔(2kg)，采用背部皮下分点注射，免疫时间为第0、3、6周，第4、8周采血。免疫剂量为0.5mg/只/次，首次免疫使用完全弗氏佐剂，后二次使用不完全弗氏佐剂。用ELISA测定抗血清中抗rPA抗体的滴度。结果显示免疫4周后(两次)血清中抗rPA抗体滴度达1×106，免疫8周后(三次)抗体滴度达2×106，表明rPA具有良好的免疫原性。
序列表<160>1<210>1<211>5988<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>序列号acccgacacc atcgaatggc gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 60gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc 120cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa 180aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc 240acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct 300gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag 360cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa 420tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc 480cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca 540gacacccatc aacagtatta ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca 600tctggtcgca ttgggtcatc agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc 660ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat 720agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct 780gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc 840aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata 900cgacgatacc gaagacagct catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt 960tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt 1020gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa 1080tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 1140ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 1200aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg 1260gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cggattcact ggaactctag 1320ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac tggctggttt 1380cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaaga agttaaacag gagaaccggt tattaaatga 1440atcagaatca agttcccagg ggttactagg atactatttt agtgatttga attttcaagc 1500acccatggtg gttacctctt ctactacagg ggatttatct attcctagtt ctgagttaga 1560aaatattcca tcggaaaacc aatattttca atctgctatt tggtcaggat ttatcaaagt 1620taagaagagt gatgaatata catttgctac ttccgctgat aatcatgtaa caatgtgggt 1680
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权利要求
1.重组炭疽保护性抗原的表达质粒，其DNA序列为序列表中的序列1或在高严谨条件下可以与序列1杂交的序列。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于所述质粒是pAS-PA。
3.一种制备重组炭疽保护性抗原的方法，是用重组炭疽保护性抗原的表达质粒转化大肠杆菌，获得工程菌株，发酵工程菌株得到目的产物；所述表达质粒的DNA序列为序列表中的序列1或在高严谨条件下可以与序列1杂交的序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵得到的目的产物经过下述步骤得到纯化1)细菌外周质分离；2)离子交换；3)疏水层析；4)凝胶过滤。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵工程菌株的过程是从固体培养基上挑取工程菌单菌落，接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃ 250转/分培养至OD6000.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃ 250转/分诱导表达5h得到目的产物。
全文摘要
本发明公开了一种制备重组炭疽保护性抗原的方法及其专用表达质粒，本发明提供的重组炭疽保护性抗原的表达质粒，其DNA序列为序列表中的序列1或在高严谨条件下可以与序列1杂交的序列。本发明所提供的制备重组炭疽保护性抗原的方法，是用重组炭疽保护性抗原的表达质粒转化大肠杆菌，获得工程菌株，发酵工程菌株得到目的产物。用本发明的表达质粒和制备方法可在大肠杆菌中实现rPA的高效分泌型表达，其优点是一方面使rPA以可溶形式表达保持其正确构象；另一方面防止rPA被胞内蛋白酶降解。经过纯化每升培养物可获得rPA约15mg，纯度高于95％，其N端序列与天然炭疽保护性抗原完全一致，并且具有较好的生物学活性和免疫原性，具有广泛的应用价值和深远的理论意义。
文档编号C12N15/70GK1746313SQ200410074358
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月10日 优先权日2004年9月10日
发明者陈薇, 徐俊杰, 董大勇, 付玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所