专利名称：分泌型大肠杆菌表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分泌型大肠杆菌表达载体及其应用。
背景技术：
大肠杆菌表达系统是用来表达外源蛋白的最常用的表达系统之一。它具有操作简单、周期短、表达量高等优点，已被成功用于多种蛋白的表达。该系统常用的表达形式有细胞内表达和分泌型表达两种。在进行细胞内表达时，许多外源蛋白特别是来源于真核生物的蛋白会形成包涵体，需要经过溶解、复性等复杂过程才能部分恢复生物活性，有时还很难恢复到蛋白的原始构象。即便是可溶表达，在纯化时也很难将目的蛋白从复杂的胞内蛋白中纯化出来，往往需要在目的蛋白上加上一些序列标签，通过基于序列标签的亲和层析的方法来纯化目的蛋白，常用标签有6×His等，可是在表达具有药用价值的蛋白时，这些外源的标签序列又需要被去除，造成流程复杂，得率下降。
分泌型表达是通过一段大肠杆菌信号肽将目的蛋白引导到细菌外膜和内膜间的周质腔中，其优点是一方面使目的蛋白以可溶形式表达有利于其保持正确构象；另一方面防止目的蛋白被胞内蛋白酶降解；此外，由于外周质中细菌本身含有的蛋白较少，给目的蛋白的纯化带来方便。遗憾的是目前市场上可以购买到的大肠杆菌分泌型表达载体较少，而且许多或带有序列标签或是在信号肽切割后获得的蛋白N端仍带有多余的氨基酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在大肠杆菌中高效分泌表达外源蛋白的分泌型大肠杆菌表达载体。
本发明所提供的分泌型大肠杆菌表达载体，是含有外膜蛋白0mpA的信号肽序列的大肠杆菌表达载体，所述外膜蛋白0mpA的信号肽序列位于启动子序列和多克隆位点序列之间并紧密连接于所述多克隆位点序列。
所述表达载体不含有标签序列。
所述信号肽序列和多克隆位点序列可具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中的序列1由135个碱基组成。序列1的自5′端第1-63位碱基为外膜蛋白0mpA的信号肽序列，自64-135位碱基为多克隆位点序列。
含有序列1的信号肽序列和多克隆位点序列的分泌型大肠杆菌表达载体可具有序列表中序列2的核苷酸序列，其物理图谱如图1所示，名称为pAS18。
序列表中的序列2由3818个碱基组成，自5′端第1337-1471位碱基为外膜蛋白0mpA的信号肽序列和多克隆位点序列。
所述信号肽序列和多克隆位点序列还可具有序列表中序列3的核苷酸序列。
序列表中的序列3由101个碱基组成。序列1的自5′端第1-63位碱基为外膜蛋白0mpA的信号肽序列，自64-101位碱基为多克隆位点序列。
含有序列3的信号肽序列和多克隆位点序列的分泌型大肠杆菌表达载体可具有序列表中序列4的核苷酸序列，其物理图谱如图2所示，名称为pAS20。
序列表中的序列4由3792个碱基组成，自5′端第1337-1437位碱基为外膜蛋白0mpA的信号肽序列和多克隆位点序列。
所述信号肽序列和多克隆位点序列还可具有序列表中序列5的核苷酸序列。
序列表中的序列5由106个碱基组成。序列1的自5′端第1-63位碱基为外膜蛋白0mpA的信号肽序列，自64-106位碱基为多克隆位点序列。
含有序列5的信号肽序列和多克隆位点序列的分泌型大肠杆菌表达载体可具有序列表中序列6的核苷酸序列，其物理图谱如图3所示，名称为pAS22。
序列表中的序列6由3789个碱基组成，自5′端第1337-1442位碱基为外膜蛋白0mpA的信号肽序列和多克隆位点序列。
上述分泌型大肠杆菌表达载体均可按常规分子生物学方法构建。
本发明的分泌型大肠杆菌表达载体，均带有大肠杆菌外膜蛋白0mpA的信号肽序列，可引导外源蛋白进入细菌周质腔；多克隆位点丰富；不含任何标签序列；通用性好。pAS22的多克隆位点可使外源基因紧接在信号序列后面，在信号肽正确切割后可获得N端与天然蛋白完全一致的重组外源蛋白。
实验证明，在利用本发明的分泌型大肠杆菌表达载体表达外源蛋白rPA(重组炭疽保护性抗原)和PA-D4(炭疽保护性抗原结构域4)的过程中，信号肽被正确切割，外源蛋白序列正确并具有生物活性。本发明的分泌型大肠杆菌表达载体可在大肠杆菌中高效分泌表达外源蛋白。
图1为本发明表达载体pAS18的物理图谱和0mpA的信号肽及多克隆位点序列图2为本发明表达载体pAS20的物理图谱和0mpA的信号肽及多克隆位点序列图3为本发明表达载体pAS22的物理图谱和0mpA的信号肽及多克隆位点序列图4为pAS-PA的物理图谱图5为rPA表达与纯化不同阶段的SDS-PAGE电泳6为rPA的表达与纯化的Western Blot鉴定7为rPA的生物学活性曲线图8为PA-D4表达与纯化不同阶段的SDS-PAGE电泳图具体实施方式
实施例1、本发明表达载体pAS18的构建以通用表达载体pASK84(Skerra A.A general vector，pASK84，for cloning，bacterial production，and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 1994，14179-84.)为模板，将其与通用克隆载体pUC18分别用EcoR I/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收pASK84的载体片段和pUC18的多克隆位点片段，将二者连接后通过TSS法转化大肠杆菌XLI-blue，提质粒用EcoR I/HindIII酶切鉴定，对多克隆位点插入正确的质粒进行序列测定，序列正确的质粒命名为pAS18，其具有序列表中序列2的核苷酸序列，其物理图谱和0mpA的信号肽及多克隆位点序列如图1所示(图1中，箭头表示切割位点，-1表示信号肽最后一个氨基酸，+1表示成熟蛋白的第一个氨基酸)。其中，测序引物为P185’-GCTTCCGGCTCGTATAATGTG-3’。
实施例2、本发明表达载体pAS20的构建为了去除pAS18的多克隆位点中2个Pst I中的1个，以便利用多克隆位点中的Pst I，将pAS18用BamH I/HindIII双酶切，电泳回收载体片段，用Klenow酶补平后连接，通过TSS法转化XL1-blue菌，提质粒进行序列测定，序列正确的质粒命名为pAS20，其具有序列表中序列4的核苷酸序列，其物理图谱和0mpA的信号肽及多克隆位点序列如图2所示(图2中，箭头表示切割位点，-1表示信号肽最后一个氨基酸，+1表示成熟蛋白的第一个氨基酸)。其中，测序引物为P185’-GCTTCCGGCTCGTATAATGTG-3’。
实施例3、本发明表达载体pAS22的构建为了使表达的重组蛋白能形成正确的氨基端，并使多克隆位点更加实用，将pAS18的多克隆位点进行了改造。设计引物P225’-GACTCTAGAGCTCGAATTCGAAGGCCTGCGCTACGGTAG-3’。
以pAS18为模板，P22与P18为引物进行PCR反应。PCR反应总体积50μL，含1×Ex Taq buffer，0.2mmol/L dNTPs，引物各0.5μmol/L，模板100ng，2.5U Ex Taq。94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃120s，30循环，72℃延伸5min。所得扩增产物用琼脂糖凝胶电泳回收，再用Xba I酶切，电泳回收酶切产物。将pAS18也用Xba I酶切，电泳回收载体片段，将载体片段与产物片段连接，通过TSS法转化XL1-blue菌，提质粒用XbaI酶切鉴定，正确的质粒进行序列测定，序列正确的质粒命名为pAS22，其具有序列表中序列6的核苷酸序列，其物理图谱和0mpA的信号肽及多克隆位点序列如图3所示(图3中，箭头表示切割位点，-1表示信号肽最后一个氨基酸，+1表示成熟蛋白的第一个氨基酸)。其中，测序引物为P185’-GCTTCCGGCTCGTATAATGTG-3’。
实施例4、利用本发明表达载体pAS20使rPA(重组炭疽保护性抗原)在大肠杆菌中分泌表达，并使rPA具有正确的N端一、表达载体pAS-PA的构建用常规分子生物学方法将炭疽保护性抗原PA基因插入本发明表达载体pAS20中。PA基因从炭疽杆菌A16R株(购自兰州生物制品所)中以PCR方法获得。PCR引物PA 5’端引物5’-AGGAGAACCGGTTATTAAATGAATC-3’PA 3’端引物5’-CGCGAGCTCTTATCCTATCTCATAGCCTTTTTTAG-3’SacI从培养A16R菌株的琼脂平板上挑取少量细菌，置100μL纯水中，煮沸10分钟，离心后取5μL上清进行PCR反应。反应总体积50μL，含1×Ex Taq buffer，0.2mmol/L dNTPs，引物各0.5μmol/L，2.5U Ex Taq。94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃120s，30循环，72℃延伸5min。
PCR产物用Sac I酶切，形成5’平末端3’粘末端；载体pAS20用PstI切后，用T4DNA聚合酶处理成平末端，再用SacI酶切，也形成5’平末端3’粘末端。载体和片段连接后常规转化E.coli DH5α，PCR(引物与条件同上)筛选阳性克隆，提质粒进行酶切鉴定和序列测定，测序引物为P185’-GCTTCCGGCTCGTATAATGTG-3’。序列正确的质粒命名为pAS-PA(如图4所示)。
二、炭疽保护性抗原(rPA)的表达及纯化1、表达从固体LB培养基上挑取被质粒pAS-PA转化的E.coli DH5α工程菌单菌落，接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃250转/分培养至0D600＝0.7-0.8，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃250转/分诱导表达5h，离心收集细菌沉淀。
2、细菌外周质的分离1L诱导培养物离心后的菌体，用100mL 20％蔗糖溶液(20mmol/L TrispH8.0，1mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF)重悬，冰上放置5min，4℃8000g离心20min。沉淀用100mL 5mmol/L MgSO4(1mmol/L PMSF)重悬，冰上放置10min，4℃10000g离心10min，收集上清液用于纯化rPA。
3、离子交换将步骤2中收集的上清液先用Q Sepharose进行粗纯化。以平衡缓冲液(20mmol/LTris pH8.0)平衡柱，调节样品盐浓度至20mmol/L Tris pH8.0后上样。用含0.5mol/LNaCl的平衡缓冲液进行洗脱。分部收集洗脱液，进行12％SDS-PAGE分析。
含rPA的管合并后用Source 30Q进行下一步纯化。以平衡缓冲液(同上)平衡柱，样品稀释5倍后上样。用含0～0.25mol/L NaCl的平衡缓冲液梯度洗脱。
4、疏水层析将步骤3的Source 30Q洗脱液合并后用phenyl sepharose疏水柱进一步纯化。以含1.0mol/L硫酸胺的缓冲液(20mmol/L Tris pH8.0)平衡柱，调节样品液至同样盐浓度后上样，用含1.0～0mol/L硫酸胺的同样缓冲液梯度洗脱。
5、凝胶过滤将步骤4的洗脱液合并后用Centriplus YM-30超滤管(Millipore)浓缩，再过Superdex 200凝胶柱，用PBS洗下rPA，-70℃保存。1L培养物经纯化后可获得约15mg rPA，用HPLC方法分析rPA的纯度为97％。
6、凝胶电泳与免疫印迹分析将各步纯化样品进行12％SDS-PAGE，观察纯化效果，结果如图5所示，图中，1，工程菌诱导前；2，工程菌诱导后；3，含rPA的细菌外周质；4，Q Sepharose纯化后；5，Source 30Q纯化后；6，phenyl Sepharose纯化后；7，Superdex 200纯化后；M，蛋白分子量标准。从图中可以明显看出，rPA被分泌到细菌外周质中，并随着本发明工艺步骤的进程，目的蛋白rPA得到表达后，逐步得到了纯化。将纯化的rPA经10％SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，进行蛋白N端测序，结果前5个氨基酸为EVKQE，与天然PA一致，表明信号序列已被正确切去，得到的产物是正确的。
用抗-PA单克隆抗体(以rPA为抗原，制备方法见《免疫学常用实验方法》，北京人民军医出版社，200023-50)为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG(Sigma)12000稀释为二抗，按照常规方法进行Western blot分析，结果如图6所示，图中1，工程菌诱导前；2，工程菌诱导后；3，含rPA的细菌外周质；4，Q Sepharose纯化后；5，Source 30Q纯化后；6，phenyl Sepharose纯化后；7，Superdex 200纯化后，图中的结果可以证明PA基因确实得到了表达，同时表达产物得到了纯化。
三、rPA的生物活性分析及免疫原性分析1、rPA的生物活性分析炭疽保护性抗原(PA)与致死因子(LF)结合称为致死毒素(lethal toxin，LT)，在体外可导致敏感细胞(如小鼠巨噬细胞J774A.1)的死亡。
将小鼠巨噬细胞J774A.1以105/ml接种于96孔培养板，长至90％满，不同浓度的rPA与重组LF(rLF，制备方法见Gupta P，et al.Expression and purificationof the recombinant lethal factor of Bacillus anthracis.Infection andImmunity 1998，66(2)862-865)加入细胞孔中，37℃孵育3h，用MTT法观察细胞存活率。结果如图7所示，当固定rPA与rLF其中的一种，增加另一种蛋白的浓度时，细胞存活率明显下降；而只加入rPA或rLF的细胞孔无明显变化，表明rPA有较好的生物学活性。
2、rPA的免疫原性分析用rPA免疫健康的家兔(2kg)，采用背部皮下分点注射，免疫时间为第0、3、6周，第4、8周采血。免疫剂量为0.5mg/只/次，首次免疫使用完全弗氏佐剂，后二次使用不完全弗氏佐剂。用ELISA测定抗血清中抗rPA抗体的滴度。结果显示免疫4周后(两次)血清中抗rPA抗体滴度达1×106，免疫8周后(三次)抗体滴度达2×106，表明rPA具有良好的免疫原性。
实施例5、利用本发明表达载体pAS22使外源基因在大肠杆菌中分泌表达，并使重组蛋白具有正确的N端一、表达载体pAS-PA-D4的构建采用常规分子生物学方法，利用本发明表达载体pAS22上的StuI/SacI酶切位点，将炭疽保护性抗原结构域4(PA-D4)基因插入表达载体pAS22中。PA-D4基因(423bp)系用PCR法从质粒pAS-PA(见实施例4)上扩增而来。PCR引物PA-D45’端引物5’-CCTTTCATTATGATAGAAATAAC-3’pA-D43’端引物5’-CGCGAGCTCTTATCCTATCTCATAGCCTTTTTTAG-3’SacIPCR反应总体积50μL，含1×pyrobest DNA聚合酶buffer，0.2mmol/L dNTPs，引物各0.5μmol/L，pAS-PA 100ng，2.5U pyrobest DNA聚合酶。94℃预变性3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 120s，30循环，72℃延伸5min。PCR产物用SacI酶切3’端，形成5’平末端3’粘末端；载体pAS22用StuI和SacI双酶切，也形成5’平末端3’粘末端。将处理好的载体和片段连接过夜，用TSS法常规转化E.coli JM83菌，用PCR法(引物与条件同上)筛选阳性克隆，提质粒进行酶切鉴定和序列测定，序列正确的质粒命名为pAS-PA-D4。测序引物为P185’-GCTTCCGGCTCGTATAATGTG-3’。
二、PA-D4的表达及纯化从固体LB培养基上挑取被质粒pAS-PA-D4转化的大肠杆菌E.coli JM83工程菌单菌落，接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃250转/分培养至0D6000.3-0.4，加入IPTG至0.5mmol/L，28℃250转/分诱导表达6h，可获得PA-D4的高水平表达，表达量约占菌体总蛋白的10％，其分子量约16kD，与预期相符。
1L诱导培养物离心后的菌体，先用50ml 10mmol/L Tris(pH8.0)重悬，用低功率超声破碎，12000rpm离心10min，收集沉淀，再用25ml Tris重悬，用高功率超声破碎，12000rpm离心15min，收集上清用AKTA-explorer纯化PA-D4。
先用Q sepharose F.F.离子交换柱。以缓冲液(10mmol/L Tris pH8.0)平衡层析柱后上样，再用含0.5mol/L NaCl的缓冲液洗脱。分部收集洗脱峰，进行17％SDS-PAGE分析，含PA-D4的管合并后用Source 30Q柱进行下一步纯化。
用缓冲液(10mmol/L Tris pH8.0)平衡Source 30Q柱，将上一步收集的样品溶液用平衡缓冲液稀释约10倍后上样，再用含0～0.5mol/L NaCl的同样缓冲液进行梯度洗脱。分部收集洗脱峰，含PA-D4的管合并后用Superdex 75柱进行凝胶过滤。
用缓冲液(含0.15mol/L NaCl的50mmol/L磷酸钠，pH8.0)平衡凝胶柱后上样，再用平衡缓冲液洗脱，分部收集洗脱峰，获得的PA-D4蛋白溶液分装后-70℃保存。
将各步纯化样品进行17％SDS-PAGE，观察纯化效果，结果如图8所示，图中，1，工程菌诱导前；2，工程菌诱导后；3，含PA-D4的细菌超声液；4，Q sepharose F.F.纯化后；5，Source 30Q纯化后；6，Superdex 75柱纯化后；M，蛋白分子量标准。从图中可以明显看出，PA-D4随着工艺步骤的进程，逐步得到了纯化。1L培养物经纯化后可获得约10mg PA-D4。将纯化的PA-D4经17％SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，进行蛋白N端测序，结果前5个氨基酸为FHYDR，与PA-D4天然序列完全一致，表明PA-D4以分泌形式表达，并且信号肽被正确切割，重组蛋白具有正确的N端。
序列表<160>6<210>1<211>135<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>1atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag60gccgaagtta aactgcagga attcgagctc ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg120caggcatgca agctt 135<210>2<211>3818<212>DNA<213>人工序列<220>
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权利要求
1.分泌型大肠杆菌表达载体，是含有外膜蛋白OmpA的信号肽序列的大肠杆菌表达载体，所述外膜蛋白OmpA的信号肽序列位于启动子序列和多克隆位点序列之间并紧密连接于所述多克隆位点序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述分泌型大肠杆菌表达载体不含有标签序列。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于所述信号肽序列和多克隆位点序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述分泌型大肠杆菌表达载体具有序列表中序列2的核苷酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于所述信号肽序列和多克隆位点序列具有序列表中序列3的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述分泌型大肠杆菌表达载体具有序列表中序列4的核苷酸序列。
7.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于所述信号肽序列和多克隆位点序列具有序列表中序列5的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述分泌型大肠杆菌表达载体具有序列表中序列6的核苷酸序列。
9.权利要求1所述的分泌型大肠杆菌表达载体在表达外源蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种分泌型大肠杆菌表达载体及其应用，其目的是提供一种可在大肠杆菌中高效分泌表达外源蛋白的分泌型大肠杆菌表达载体及其应用。本发明的分泌型大肠杆菌表达载体，是含有外膜蛋白OmpA的信号肽序列的大肠杆菌表达载体，所述外膜蛋白OmpA的信号肽序列位于启动子序列和多克隆位点序列之间并紧密连接于所述多克隆位点序列。本发明的分泌型大肠杆菌表达载体可在大肠杆菌中高效分泌表达外源蛋白。
文档编号C12N15/70GK1746312SQ200410074359
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月10日 优先权日2004年9月10日
发明者陈薇, 徐俊杰, 郭强, 董大勇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所