大肠杆菌-链霉菌穿梭型bac载体及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法，该BAC载体含有多克隆位点MCS，Am抗性基因，整合酶基因int，整合位点attp，接合转移片段oriT，BAC载体的复制区oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位点和loxP位点。本发明从pBeloBAC11出发，用Red同源重组技术将其上的氯霉素抗性基因替换为用于接合转移（oriT）、定点整合（attp-int）和抗性筛选（Am）的oriT-attp-int-Am的DNA片段（称之为替换盒），得到载体pBTIBAC1，为实现大片段基因簇在链霉菌中的异源表达奠定了基础。
【专利说明】大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法，具体涉及一种可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的BAC载体及其构建方法，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002]链霉菌是微生物中产抗生素种类最多的种属，目前世界上发现的5000多种抗生素中，60%以上是由链霉菌合成的，作为抗生素的生产菌，链霉菌在传统发酵工业中的应用有着悠久的历史，而分子遗传学的发展则为链霉菌的基因重组展现了广阔的应用前景，自1980年首次报导链霉菌基因克隆以来，链霉菌基因工程日益兴起。
[0003]载体作为基因工程的重要工具是链霉菌基因工程首先遇到的问题。起初科学家们根据对一部分链霉菌遗传背景已有的认识，构建了一系列链霉菌质粒和噬菌体克隆载体系统，后来为了研究链霉菌基因功能和构建其基因文库，须将链霉菌基因转入大肠杆菌中进行一些遗传操作，然后再转移到某些模式链霉菌中作进一步研究，于是各个实验室纷纷开始构建大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，文献记载最早的是1982年Richardson MA等构建的大肠杆菌-链霉菌双功能载体PFJ123，然后就是1989年Hill RT等构建的大肠杆菌-链霉菌正筛选穿梭载体PLR591，国内有关这方面较早的研究是谭华荣等1990年构建的链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体 pSE-3。
[0004]与此同时链霉菌基因转移系统也开始建立，文献记载较早的是原生质体转化法，包括PEG介导和脂质体协助，但在实际应用中常常遇到不少障碍，主要由于链霉菌特殊的结构特点，要么其原生质体难以制备，要么其难以被外源质粒所转化，还有电击转化法，效率也很低，自Trien-Cuot等人首次阐明大肠杆菌与许多革兰氏阳性细菌之间可进行质粒的接合转移的现象，两年后Mazodier发展了质粒在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移的方法，即在大肠杆菌-链霉菌穿梭载体上引入接合转移顺式作用元件oriT，将其转化到携带RP4质粒的大肠杆菌中，载着目的基因的载体就在RP4上的反式作用元件tra的诱导下由大肠杆菌接合转移到链霉菌中去。这种方法不但易于操作，而且可避开链霉菌的甲基化限制作用，提高外源基因的存活率。
[0005]已有报导，重组质粒在链霉菌中显示结构的不稳定性，人们就尝试构建一种可整合至链霉菌基因组的载体，其中主要包括由Streptomyces ambofaciens质粒pSAM2衍生和链霉菌噬菌体cpC31衍生的载体，而cpC31衍生载体因有较高的转化效率而颇受偏爱，如PSET152就是由目前研究较热的链霉菌噬菌体OC31的整合系统衍生而来的，即在载体上引入attP序列(phage attachment site)和整合酶基因(int),整合酶可介导attP与链霉菌基因组内的attB (bacterial attachment site)间位点特异性重组,从而将整个载体包括外源基因整合进链霉菌基因组中，使外源基因在没有选择压力的情况下在链霉菌中稳定存在，这可作为其用于大规模生产的一个极大的优势。
[0006]链霉菌基因组测序完成后人们发现，在链霉菌基因组中与某一天然产物生物合成途径相关的基因往往成簇存在，因此都比较大(>60kb)，要想完整地克隆这些基因簇就必须要有能装载大片段的载体。目前应用较广的大片段克隆载体有酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)，BAC的插入片段不如YAC长，但其有很多优点可弥补YAC的不足，这就使得其应用和发展远远超过了 YAC。
【发明内容】
[0007]本发明的主要目的是提供一种大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体，本发明成功构建了一种可由大肠杆菌接合转移至链霉菌，并整合至其基因组的穿梭型BAC载体pBTIBACll，以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后转移至链霉菌中异源表达。
[0008]本发明由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体，其含有多克隆位点MCS，安普抗性基因Am，整合酶基因int，整合位点attp，接合转移位点oriT，BAC载体的复制区oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位点和1xP位点。
[0009]多克隆位点(MCS )，序列如SEQ N0.1 ；
[0010]安普抗性基因(Am)，序列如SEQ N0.2 ；
[0011]整合酶基因(int)，序列如SEQ N0.3 ;
[0012]整合位点(attp)，序列如SEQ N0.4 ；
[0013]接合转移片段(oriT)，序列如SEQ N0.5 ；
[0014]BAC载体复制区(oriS)，序列如SEQ N0.6 ；
[0015]BAC载体的repA基因，序列如SEQ N0.7 ；
[0016]BAC载体的sopA基因，序列如SEQ N08 ；
[0017]BAC载体的sopB基因，序列如SEQ N09 ；
[0018]BAC载体的sopC片段,序列如SEQ N010 ；
[0019]BAC载体的cos位点，序列如SEQ NOll ；
[0020]BAC载体的1xP位点，序列如SEQ N012。
[0021]所述的BAC载体pBTIBACll，其具有SEQ N0.13所示的序列。
[0022]本发明的另一个目的是提供本发明上述BAC载体的构建方法。本发明从原始载体pBeloBACll出发，将其上的氯霉素抗性基因替换为用于接合转移(oriT)、定点整合(attp-1nt)和抗性筛选(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段(称之为替换盒),为了精确替换，本发明采用了 Red同源重组的方法，即将一段两端与染色体(或载体)特定靶序列两翼各有40~60bp同源序列的PCR线性DNA片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶使该线性片段与靶序列发生同源重组，线性DNA片段即可替换靶序列，得到的替换子命名为pBTIBACl。其中Red重组酶由辅助质粒pKD46携带，其表达受L-阿拉伯糖诱导，且具有温度敏感型的复制子，在温度高于37°C时，自动从宿主菌中清除。
[0023]为了验证pBTIBACl是否具有接合和整合的功能，在其原多克隆位点反向插入链霉菌的组成型启动子ermEPA和绿色荧光蛋白基因(GFP )，得到重组质粒pBTIBACl-ermEPiP^GFP,将该重组质粒转化ET12567 (pUZ8002)(接合转移供体菌)，再通过接合转移转至变铅青链霉菌中，通过EnSpire多标记微孔板检测仪(酶标仪)和激光扫描共聚焦显微镜观察，结果都显示了绿色荧光蛋白的表达，说明载体pBTIBACl具有预期的功能，为实现大片段基因簇在链霉菌中的异源表达奠定了基础。
[0024]为便于以后使用，合成新的多克隆位点MCS，其上包含EcoR 1、Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa I ,BamH I酶切位点，通过EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相应位点(插入原载体MCS的EcoR I和BamH I之间)，得到最终载体pBTIBACll (见图1)。
[0025]其具体构建方法，包括如下步骤:
[0026](I)首先设计一对引物，5’端带有待替换氯霉素抗性基因上下游各55bp的同源臂，通过PCR扩增出含接合转移(oriT)、定点整合(attp-1nt)和抗性筛选(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段,称之为替换盒；
[0027](2)将Red同源重组辅助质粒pKD46电转至含待替换质粒pBeloBACll的大肠杆菌k-12 内，得至Ij E.coli k_12/pBeloBACll/pKD46 ；
[0028](3)30°C培养Ε.coli k_12/pBeloBACll/pKD46 过夜，次日按 1:100 转接，加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖，30°C培养至0D_=0.4~0.6，制成电转感受态，将上述替换盒电转至其中，通过安普抗性筛选得到氯霉素抗性基因被替换了的替换子，命名为pBTIBACl ；
[0029](4)体外合成链霉菌组成型启动子ermEP^，并与绿色荧光蛋白基因(GFP)正确连接，由EcoR I和BamH I酶切连入pBTIBACl，得到重组质粒pBTIBACl_eGFP，将该重组质粒转化ET12567/pUZ8002 (接合转移供体菌)，再通过接合转移转至变铅青链霉菌中，EnSpire多标记微孔板检测仪(酶标仪)和激光扫描共聚焦显微镜观察都检测到绿色荧光蛋白的表达；
[0030](5)合成新的多克隆位点 MCS,其上包含 EcoR I > Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa 1、BamH I酶切位点，通过EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相应位点，得到最终载体pBTIBAClI ο
[0031]本发明的BAC载体，具有以下特点:
[0032]1.载体上的oriT片段，方便其由大肠杆菌接合转移至链霉菌中，克服了链霉菌难于转化和链霉菌严格限制系统的问题；
[0033]2.attP-1nt元件，可使插入的外源基因(簇)连同载体一起整合至链霉菌基因组中，提闻了外源基因(族)的稳定性；
[0034]3.安普霉素抗性基因可用于载体转化大肠杆菌和链霉菌的特异性筛选标记；
[0035]4.保留了 BAC载体克隆大片段的特点；
[0036]5.保留了 LacZ，可使用蓝白斑筛选重组克隆；
[0037]6.已用绿色荧光蛋白验证其接合和整合功能；
[0038]7.重新合成了多克隆位点，方便外源片段的酶切连入。
[0039]本发明从pBeloBACll出发，用Red同源重组技术将其上的氯霉素抗性基因替换为用于接合转移(oriT)、定点整合(attp-1nt)和抗性筛选(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段(称之为替换盒)，得到载体pBTIBACl，用绿色荧光蛋白验证其功能后，又重新合成MCS插入原载体MCS的EcoR I和BamH I之间，得到载体pBTIBACll，为实现大片段的基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后转移至链霉菌中异源表达奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是pBTIBACll结构示意图。
[0041] 图2是pBTIBACll构建的示意图。
[0042]图3是替换盒连pMD18T vector菌液PCR琼脂糖凝胶电泳结果。
[0043]图4是阳性克隆质粒BsaI酶切琼脂糖凝胶电泳结果。
[0044]图5是替换子菌液PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳结果。
[0045]图6是变铅青链霉菌TK24转化子的EnSpire多标记微孔板检测仪(酶标仪)结果处理图表。
[0046]图7是变铅青链霉菌1326转化子的EnSpire多标记微孔板检测仪(酶标仪)结果处理图表。
[0047]图8是变铅青链霉菌TK2412#转化子表达绿色荧光蛋白照片(1000倍镜)，con:阴性对照；12:TK2412#转化子。
[0048]图9是变铅青链霉菌132617s转化子表达绿色荧光蛋白照片(1000倍镜)，con:阴性对照；17:132617s转化子。
【具体实施方式】
[0049]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0050]下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了列举说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0051]在实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所使用试剂的来源、商品名以及必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
[0052]实施例中所用到的质粒和菌株如下:
[0053]pMD18T vector为商品化载体，用于PCR胶回收产物的克隆和测序，购于TaKaRa公司。
[0054]pBeloBACll (U-JIN KIM et al.(1996).“Construct1n and Characterizat1nof a Human Bacterial Artificial Chromosome Library，，GEN0MICS34, 213 - 218),本实施例中所使用的pBeloBACll (保存在E.coli k-12内)购自NEB公司。
[0055]pESPBAC (Huang Huiying,Song Jie,Shang Guangdong (2010).“Construct1nof an E.col1-Streptomyces-Pseudomonas Shuttle Express1n BAC Vector，，.JOURNALOF NANJING NORMAL UNIVERSITY (Natural Science Edit1n).33 (2): 104-108)，用于替换盒扩增模板，为南京师范大学尚广东老师馈赠。
[0056]pKD46 (Kiri 11 A.Datsenko and Barry L.Wanner (2000 ).u One-stepinactivat1n of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products，，.PNAS.97(12):6640-6645)，为Red同源重组辅助质粒，由本实验室保存。
[0057]pET28a-EGFP为扩增GFP基因的模板，由本实验室保存。
[0058]E.coli DH5 α感受态用于DNA片段克隆，购于北京康为生物科技有限公司。
[0059]Ε.coli ET12567 (pUZ8002) (Paget,M.S.B., L.Chamberlin, A.Atrih, S.J.Foster,and M.J.Buttner.1999.Evidence that the extracytoplasmic funct1n sigma factorsE is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3(2).J.Bacter1l.181:204 - 211.)为接合转移供体菌，由上海交通大学陶美凤博士馈赠。
[0060]变铅青链霉菌TK24和1326为接合转移受体菌，由上海交通大学陶美凤博士馈赠。
[0061]ermEPlP2为链霉菌组成型启动子，序列由GenBank(登录号为AB093584)获得，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成部合成。
[0062]本发明的由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体pBTIBACll的构建，请参见图2。
[0063]一、载体平BTIBAC1的构建(参见图1)
[0064]1、以pESPBAC为模板，PCR扩增替换盒
[0065]引物为:
[0066]P1
[0067]5jGGTCTC| TTATTCAGGCGTAGCAACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGC CTTAAAAAAAGT
CAGCCAATCGACTGGCGAGCG3，，
[0068]P2
[0069]SlGGTCTCl ACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAG GAAGCTAAAACCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGG3，。
[0070]其中加边框的为BsaI酶切位点(酶切后为5’突出端，且没有酶切位点碱基残留)，加下划线的碱基序列为待替换氯霉素抗性基上下游同源臂，扩增片段大小为3365bp。
[0071]PCR 体系(50 μ L):10 X KOD Buffer (K0D 缓冲液)5μ L,2mM dNTPs (三磷酸脱氧核苷酸)5 μ L，25mM MgSO4 (硫酸镁)2 μ L，1mM引物各1.5 μ L，模板I μ L，ddH20 (双蒸水)33 μ L, KOD plus DNA 聚合酶 I μ L。PCR 反应条件 94°C 2min, (94°C 15s，68°C 4min) 30cycles,68 °C 7min。
[0072]2、替换盒PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收，末端加A，连pMD18T载体，转化DH5a
[0073]胶回收用AXYGEN胶回收试剂盒，操作按其说明书；末端加A反应如下:PCR胶回收产物30 μ L，10mMdATP (三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)0.2 μ L，1XDyNAzyme buffer(DyNAzyme 缓冲液)5 μ L，ddH2013.8 μ L，DyNAzyme II DNA 聚合酶 I μ L，72°C 20min ；TA 克隆反应如下:末端加 A 后溶液 6.5 μ L，pMD18T vector (pMD18T 载体)1 μ L, Slout1nI7.5 μ L,16°C 30min。取5 μ L连接产物转化50 μ LDH5 a化学感受态细胞。
[0074]3、转化子菌液PCR鉴定，阳性克隆提质粒酶切鉴定
[0075]菌液PCR如下:弓丨物P15，~GGTCICITATOGG03TAG(M-3，，P25，~GGICIU\CrA003GG03TATnT-3，，PCR体系(20 μ L):10XIA Buffer II OA缓冲澈5μ L，1(MVMR).8μ L，模板 I μ L，引物各 0.8μ L，dcH014 4μ L，TaKafe IA Taq DNA 聚合酶 0.2μ L。PCR 射牛:94°C 3tain, (94°C 30s,55°C 30s,72°C 4^^30^,72^ lQnin。
[0076]图3是替换盒连pMD18T载体菌液PCR琼脂糖凝胶电泳结果，M:Trans5K Marker ；+:替换盒扩增PCR胶回收产物；1~10:克隆菌液；阳性片段大小为3373bp。确定3#和7#为阳性克隆，提其质粒，用BsaI酶切，反应体系如下:10XNEBuffer4 (NEB缓冲液4)2 μ L，100XBSA0.2μ L，质粒 10 μ L, ddH207.3 μ L, Bsa10.5 μ L, 37°C 3h，然后跑琼脂糖凝胶电泳，结果见图4，7#为阳性质粒，命名为pMD18T-r印box。
[0077]4、pMD18T-替换盒质粒测序
[0078]测序引物如下:
[0079]M13F GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG
[0080]M13R GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
[0081]WlF GGGCCTCGATCAGTCCAAGTG
[0082]W2F TTCCGCAACGAACTTGTCGAG
[0083]与理论序列用DNAssist2.2软件作序列比对，结果正确。
[0084]5、替换盒从pMD18T_repbox上切下,用DpnI消化
[0085]用BsaI 酶切 pMD18T_repbox 质粒，反应体系如下:10XNEBuffer420 μ L,100XBSA02 μ L，质粒100 μ L，ddH2073 μ L，BsaI5 μ L，37°C过夜，然后跑琼脂糖凝胶电泳，并用AXYGEN胶回收试剂盒回收，回收产物用DpnI酶切，反应体系如下:胶回收产物80 μ L，10XNEBuffer420y L，ddH2070 y L，DpnI5y L，37°C放置 4h，用 AXYGEN PCR清洁试剂盒回收。
[0086]6、Ε.coli k-12/pBeloBACll转感受态的制备及pKD46的转化(可参考《分子克隆实验指南》)
[0087]电转化感受态细胞的制备:
[0088]⑴接菌，摇过夜；
[0089]⑵按1:100 转接，摇 2 ~2.5h, 0D600 约为 0.4 ；
[0090]⑶分装到5mL预冷离心管，4°C 100g离心5min,倒去上清；
[0091]⑷用4mL预冷的无菌水重悬(注:操作要轻柔，不要吹打，上下翻转即可)；
[0092](5) 40C 100g 离心 5min，倒去上清；
[0093](6)重复上一步骤2次；
[0094](7佣10%的甘油重悬，_70°C冰箱中保存。
[0095]电击转化:
[0096]取300ng的pKD46质粒与上述制备好的50 μ L感受态细胞混合，加入预冷的0.1cm电击杯中，电转仪设置1.8kV5ms,电击后迅速加入ImL预冷的无抗LB液体培养基将细菌洗出移至小试管中，摇约2h后将菌液涂布于LB+Cm (氯霉素)+Amp (氨苄青霉素)固体培养基平板上，37°C温育14~18h，获得的克隆即为转化子，命名为E.coli k-12/pBeloBACll/PKD46。
[0097]7、替换盒电转至E.coli k-12/pBeloBACll/pKD46及替换子的获得
[0098]接50 μ L E.coli K_12/pBeloBACll/pKD46 至 5ml LB+Cm+Ap3(TC摇过夜；次日，取200 μ L过夜培养菌液接种到含有20ml液体LB+Cm+Ap培养基的摇瓶中，30°C培养至OD600~0.3，加入终浓度0.2%L-阿拉伯糖，30°C继续振荡培养约lh，至OD6tltl = 0.4-06,诱导表达Red重组酶；诱导完成后，将菌液于冰上放置20min左右，制备电转感受态^fDpnI消化后的替换盒电转至E.coli K-12/pBeloBACll/pKD46中，菌液涂布到LB+Am (安普霉素)平板，37°C过夜培养；挑单克隆，用特定的引物进行菌液PCR验证，设E.coli K-12/pBeloBACll/pKD46菌液为阳阴性对照，阴性条带为811bp，阳性条带为3406bp ；PCR结果见图5，M:DL2000DNA Marker ;1~5:替换子菌液；-:阴性对照(K-12/pBeloBACll);阳性片段大小为3406bp，阴性片段大小为811bp。阳性菌42°C摇菌(清除pKD46)，提质粒测序，序列正确的命名为pBTIBACl。
[0099]二、pBTIBACl 功能验证
[0100]PCR扩增ermEPlP2和EGFP片段，分别连入pMD18T载体，测序正确后取正向连入的ermEP 1P2重组质粒命名为pMD 18T_ermEP 1P2，反向连入的GFP重组质粒命名为pMD 18T-GFP，将ermEPlP2从pMD18T_ermEPlP2切下连入pMD18T_GFP的相应位点，所得重组质粒命名为pMD18T-eGFP，再将ermEPlP2+GFP从其上切下，连入pBTIBACl相应位点，所得重组质粒命名为pBTIBACl-eGFP，将其通过接合转移转化到变铅青链霉菌TK24和1326中，得到的接合子可在含Am (50ug/mL)和萘啶酮酸(25ug/mL)的MS平板上传代生长三次，刮取接合子孢子至YEME(含50ug/mL安普霉素和25ug/mL萘啶酮酸)液体培养基30°C 200rpm培养72h，将接合子孢子摇出的菌液先用分光光度计测浓度，然后用EnSpire多标记微孔板检测仪(酶标仪)检测绿色荧光蛋白的表达，以未转化的变铅青链霉菌菌液为空白对照，每一样品加三个孔，参数设置为:激发波长480nm，发射波长510nm，测量两次，相隔10s，第一次测量前振荡10s，第二次测量前振荡15s，所得数据取平均值后除以菌浓度绘制成图表，结果见图6、图7。图6是变铅青链霉菌TK24转化子的EnSpire酶标仪结果，其中，横坐标为样品标号，con为空白对照，I~12为转化子；纵坐标为EnSpire酶标仪测量值/(0D_*1000)。图7是变铅青链霉菌1326转化子的EnSpire酶标仪结果，其中，横坐标为样品标号，con为空白对照，I~17为转化子；纵坐标为EnSpire酶标仪测量值/ (0D6CICI*1000)。
[0101]取TK2412#和132617s转化子菌液用激光扫描共聚焦显微镜观察，结果见图8、图9，从左到右分别为明场、暗场和明暗叠加。图8是变铅青链霉菌TK2412#转化子表达绿色荧光蛋白照片(1000倍镜)，con:阴性对照；12:11(2412#转化子。图9是变铅青链霉菌132617s转化子表达绿色荧光蛋白照片(1000倍镜)，con:阴性对照；17:132617#转化子。
[0102]三、MCS的插入得到载体pBTIBACll
[0103]由两条寡核苷酸链退火得到，两条寡核苷酸分别为:
[0104]5，AATTCCCTAGGTTAATTAAGTTTAAACATTTAAATG3，，
[0105]5，GATCCATTTAAATGTTTAAACTTAATTAACCTAGGG3，，对应的限制性内切酶分别为EcoR1、Avr I1、Pac1、Pme1、Swa1、BamHI,通过 EcoRI 和 BamHI 酶切插入，得到最终载体pBTIBACll，其结构示意图参见图1。
[0106]pBTIBACll 全长 10117bp，其序列如 SEQ N0.13 所示，其中
[0107]333-374:多克隆位点(MCS);
[0108]1558-782:安普霉素抗性基因(Am)；
[0109]3520-1679:整合酶基因(int);
[0110]3537-3575:整合位点(attp);
[0111]3923-4034:接合转移片段(oriT)；
[0112]4980-5046:BAC 载体的复制区(oriS)；
[0113]5375-6130:BAC 载体的 r印A 基因；
[0114]6718-7884:BAC 载体的 sopA 基因；
[0115]7884-8855:BAC 载体的 sopB 基因；
[0116]8928-9401 =BAC 载体的 sopC 片段；
[0117]9651-10059 =BAC 载体的 cos 位点；
[0118]10104-10110:BAC 载体的 1xP 位点。
【权利要求】
1.一种由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体，其特征在于，其含有多克隆位点MCS, Am抗性基因，整合酶基因int，整合位点attp，接合转移片段oriT，BAC载体的复制区oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位点和1xP位点。
2.根据权利要求1所述的由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体，其特征在于，所述的BAC载体为pBTIBACll，其核苷酸序列如序列表中序列13所示。
3.权利要求1所述的由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体的构建方法，包括以下步骤: (O首先设计一对引物，5’端带有待替换氯霉素抗性基因上下游各55bp的同源臂，通过PCR扩增出含接合转移oriT、定点整合attp-1nt和抗性筛选Am的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段，称之为替换盒； (2MfRed同源重组辅助质粒pKD46电转至含待替换质粒pBeloBACll的大肠杆菌k_12内，得到 Ecoli k-12/pBeloBACll/pKD46 ； (3)30°C培养E.coli k-12/pBeloBACll/pKD46过夜，次日按1:100转接，加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖，30°C培养至0D_=0.4~0.6，制成电转感受态，将上述替换盒电转至其中，通过安普抗性筛选得到氯霉素抗性基因被替换了的替换子，命名为pBTIBACl ； (4)体外合成链霉菌组成型启动子ermEP^，并与绿色荧光蛋白基因GFP连接，由EcoR I和BamH I酶切连入pBTIBACl，得到重组质粒pBTIBACl_eGFP，将该重组质粒转化ET12567/pUZ8002,再通过接合转移转至变铅青链霉菌中； (5)合成新的多克隆 位点MCS,其上包含EcoR1、Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa 1、BamH I酶切位点，通过EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相应位点，得到最终载体pBTIBAClI ο
【文档编号】C12N15/64GK104046648SQ201310083678
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2013年3月15日
【发明者】刘刚, 戴素琴, 陈惠鹏, 邢玉华, 张部昌 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所