专利名称：Hcv ns3蛋白酶复制子穿梭载体的制作方法
HCV NS3蛋白酶复制子穿梭载体本发明涉及新的HCV NS3蛋白酶复制子穿梭载体，其可用于筛选、测试和评价HCV 和其他黄病毒蛋白酶抑制剂。丙型肝炎病毒是全世界主要的健康问题，并且是慢性肝病的主要病因(Boyer， N.等人，J.H印atol.200032 :98-112)。HCV感染的患者有发展为肝硬化和随后发展为肝细 胞癌的危险，因此HCV是肝移植的主要指征。根据世界卫生组织，世界范围存在超过2亿感染个体，每年至少3百万至4百万人 感染。一旦被感染，约20%的人清除该病毒，但其余人可能余生携带HCV。10%至20%的慢 性感染个体最终发展为破坏肝脏的肝硬化症或癌症。这种病毒病以肠胃外方式由污染的血 液和血液制品传播、由污染的针头传播、或者以性方式传播或者从感染母亲或携带母亲垂 直地传播至后代。针对HCV感染的现有疗法具有有限的临床益处，特别对于基因型1，其中 所述的现有疗法限于用重组干扰素- α单独或与核苷类似物利巴韦林联合的免疫治疗，迫 切需要有效战胜慢性HCV感染的改进的治疗剂。HCV已经划归作为黄病毒科(Flaviviridae)的成员，黄病毒科包括黄病毒属 (f laviviruses)、癌病毒属(pestiviruses)禾口月干炎病毒属(hepaciviruses)，其中所 述肝炎病毒属包括丙型肝炎病毒(Rice，C. M.，Flaviviridae :The viruses and their r印lication，在《Fields Virology》中，Fields，B. N.，Knipe，D. Μ·和 Howley，P. Μ·编著， Lippincott-RavenPublishers, Philadelphia, Pa.，第 30 章，931-959，1996)。HCV 是含有 约9. 4kb正义单链RNA基因组的有包膜病毒。病毒基因组由一个5’非翻译区(UTR)、编码 大约3011个氨基酸的多聚蛋白前体的一个长可读框(ORF)和一个短的3’ UTR0 5’ UTR是 HCV基因组中最高度保守的部分，并且对于多聚蛋白翻译的启动和调控重要。HCV的遗传分析已经确定在DNA序列呈现> 30%趋异性的6种主要基因型。每种 基因型含有一系列更密切相关的亚型，其中所述亚型在核苷酸序列上显示20% 25%趋 异性(Simmonds，P.，2004，J. Gen. Virol.85 :3173-88)。已经区分出多于 30 种亚型。在美 国，大约70%的感染个体患有Ia型和Ib型感染。Ib型是在亚洲的最流行亚型(X. Forns 禾口 J. Bukh, Clinics in Liver Disease 1999, 3 :693_716 ; J. Bukh 等人，Semin. Liv. Dis., 1995，15 41-63)。遗憾地，1型感染对现有疗法应答比2型或3型基因型更小(N. N. Zein, Clin. Microbiol. Rev.，2000，13 :223_235)。瘟病毒和肝炎病毒的ORF的非结构蛋白部分的基因组织和多聚蛋白加工是非常 相似的。这些正链RNA病毒具有单一的大可读框(ORF)，编码病毒复制必需的全部病毒蛋 白。这些蛋白质作为多聚蛋白表达，其中所述的多聚蛋白经细胞蛋白酶和病毒编码的蛋白 酶共翻译和翻译后地加工以产生成熟的病毒蛋白。负责病毒基因组RNA复制的病毒蛋白定 位于羧基端。ORF的三分之二称为非结构(NS)蛋白。对于瘟病毒和肝炎病毒而言，成熟的 非结构(NS)蛋白从非结构蛋白编码区的氨基端至该ORF羧基端的依次顺序由p7、NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B 组成。瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白共有以特定蛋白质功能为特征的序列结构域。例如， 这两组病毒中的病毒NS3蛋白具有属于丝氨酸蛋白酶特征的氨基酸序列基序和属于解旋
6酶特征的氨基酸序列基序(Gorbalenya 等人，Nature 1988333 22 ；Bazan 和 Fletterick， Virology 1989，171 :637_639 ;Gorbalenya等人，Nucleic Acid Res. 1989，17，3889-3897)。 类似地，瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白具有属于RNA指导RNA聚合酶特征的基序(Koonin， Ε. V.和 Dol ja，V. V.，Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1993，28 :375_430)。瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白在病毒生活周期中的实际作用和功能是直接类似 的。在这两种情况下，NS3丝氨酸蛋白酶负责ORF中其位置下游的多聚蛋白前体的所有蛋 白酶解加工(Wiskerchen 和 Collett, Virology, 1991，184 :341_350 ；Bartenschlager 等 人，J. Virol. 1993,67 3835-3844 ；Eckart 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993,192 399-406 ；Grakoui 等人，J. Virol. 1993,67 :2832_2843 ；Grakoui 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1993,90 10583-10587 ；Ilijikata 等人，J. Virol. 1993,67 4665-4675；Tome 等 人，J.Virol. 1993,67 =4017-4026) 在这两种情况下，NS4A蛋白均作为辅因子与NS3丝 氨酸蛋白酶作用(Bartenschlager 等人，J. Virol. 1994,68 5045-5055 ；Failla 等人， J. Virol. 1994,68 :3753_3760 ；Xu 等人，J Virol. 1997,71 :5312_5322)。这两组病毒的 NS3 蛋白均也发挥解旋酶的作用(Kim 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995，215 160-166 ； Jin 禾口 Peterson, Arch.Biochem. Biophys. 1995,323 :47_53 ；Warrener 禾口 Collett, J. Virol. 199569 :1720_1726)。最后，瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白均具有预测的RNA依 赖的 RNA 聚合酶活性(Behrens 等人，EMBO 1996，15 12-22 ；Lechmann 等人，J. Virol. 1997， 71 8416-8428 ；Yuan 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997，232 :231_235 ；Hagedorn, PCT WO 97/12033 ；Zhong 等人，J. Virol. 1998，72 :9365_9369)。HCV NS蛋白3(NS3)含有帮助加工大部分病毒酶的丝氨酸蛋白酶活性并因此视 为对病毒复制和感染是必需的。已知在黄热病毒NS3蛋白酶中的突变降低病毒感染性 (Chambers 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87 :8898_8902)。已显示 NS3 的头 181 个 氨基酸(病毒多聚蛋白的第1027 1207位残基)含有NS3的丝氨酸蛋白酶结构域，该结构 域加工HCV多聚蛋白的全部4个下游位点(Lin等人，J. Virol. 1994，68 :8147_8157)。HCV NS3丝氨酸蛋白酶及其相关的辅因子NS4A帮助加工全部的病毒酶，并因此视为对病毒复制 是必需的。这个加工过程似乎与人免疫缺陷病毒的天冬氨酰蛋白酶所实施的加工过程类 似，其中所述天冬氨酰蛋白酶也参与病毒酶加工HIV蛋白酶抑制剂，其中所述的HIV蛋白酶 抑制剂是人类中的强效抗病毒药，从而表明破坏病毒生活周期的这个阶段导致了治疗活性 剂。因此，它是发现药物的有吸引力的靶点。当前存在有限数量的目前可用于治疗HCV感染的已批准疗法。已经综述了治 疗HCV和抑制HCV NS5B聚合酶的新治疗方法和现有治疗方法R.G.Gish，Sem. Liver. Dis. ,1999,19 5 ；Di Besceglie, Α. Μ.禾口 Bacon， B. R， Scientific American，1999 年 10月，80-85 ；G.Lake-Bakaar，“针对慢性HCV病毒肝病的现今和将来的疗法(Current and FutureTherapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease)，，，Curr. DrugTarg. Infect Dis. 2003, 3 (3) :247_253 ；P. Hoffmann 等人，“关于丙型肝炎病毒实 验性疗法的最近专利(1999-2002 年)(Recent patents onexperimental therapy for hepatitis C virus infection)(1999-2002)Exp. Opin. Ther. Patents 2003,13(11) 1707-1723 ；F. F. Poordad 等人，"2000-2002 年期间丙型肝炎疗法进展(Developments in Hepatitis Ctherapy during 2000-2002)，，，Exp. Opin. Emerging Drugs 2003,8(1) 9-25 ；M. P. Walker等人，“用于慢性丙型肝炎治疗的有前景候选物(Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C) ”，Exp. Opin. Investig. Drugs 2003，12(8) : 1269-1280 ；S. _L. Tan等人，“丙型肝炎治疗药现今状况和新出现的策 略(Hepatitis C Therapeutics Current Status and Emerging Strategies)，，，Nature Rev. DrugDiscov. 2002,1 :867_881 ；R. De Francesco 等人，“走向丙型肝炎病毒疗法的新 纪元NS3-4A丝氨酸蛋白酶抑制剂和NS5B RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂(Approaching a new era for hepatitis C virus therapy inhibitors of the NS3—4A serine protease and the NS5B RNA-dependentRNA polymerase), Antiviral Res. 2003,58 1-16 ;Q.M. Wang等人，“丙型肝炎病毒编码的蛋白质抗病毒治疗的靶Ofepatitis C virus encodedproteins targets for antiviral therapy)，，，Drugs of the Future 2000, 25 (9) =933-8-944 ;J. A. Wu和Ζ. Hong, “靶向NS5B依赖的RNA聚合酶用于抗HCV化学治疗 (Targeting NS5B_Dependent RNA Polymerase forAnti-HCV Chemotherapy)，，，Cur. Drug Targ. -Inf. Dis. 20033 :207_219。尽管在理解该病毒的基因构造和病毒蛋白的功能方面取得进展，然而HCV复制和 病理发生的基础方面仍是未知的。获得实验性理解HCV复制的主要挑战是缺少允许产生感 染性病毒颗粒的有效细胞培养系统。虽然已经报道了原代细胞培养物和某些人细胞系的感 染，然而那些系统中所产生病毒的量和HCV复制的水平太低以致不允许详细分析。已经报道了以最小效率在人肝癌细胞系Huh-7中复制的可选择性亚基因组HCV RNA的构建。Lohman等人报道通过缺失蛋白质编码区的C_p7或C-NS2区构建从克隆的 全长HCV共有基因组(基因型lb)衍生的复制子(I377/NS3-3’ ) (Lohman等人，Science 1999285 110-113)。该复制子含有以下元件(i)与衣壳编码区的12个氨基酸融合的HCV 5’ -UTR ； (ii)新霉素磷酸转移酶基因(NPTID ； (iii)插入NPTII基因下游并指导HCV蛋白 质NS2或NS3至NS5B翻译的来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES和(iv)3，-UTR。在转染 Huh-7细胞后，仅那些支持HCV RNA复制的细胞表达NPTII蛋白并显现针对药物G418的抗 性。尽管从此类G418抗性集落衍生的细胞系含有显著水平的复制子RNA和病毒蛋白，然而 106个转染的Huh-7细胞中仅1个细胞支持HCV复制。相似的可选择性HCV复制子基于HCV-H基因型Ia感染性克隆(Blight等人， Science 2000290 1972-74)构建。HCV-H衍生的复制子不能够建立有效的HCV复制，表 明上文L0hmarm(1999)较早构建的复制子依赖于那些实验中使用的特定基因型Ib共有性 cDNA克隆。上文的Blight等人(2000)通过实施基于PCR的基因装配方法重复了由上文 Lohmann等人(1999)所进行的复制子的构建并且获得了耐受G418的Huh_7细胞集落。将 独立的G418耐受细胞克隆测序以确定高水平HCV复制是否需要复制子适应宿主细胞。鉴 定了在HCV非结构蛋白NS5A中簇集的多个独立的适应性突变。所述突变赋予增加的体外 复制能力，与本领域较早构建的复制子相比，具有从0.2%至10%转染细胞的转导效率，例 如I377/NS3-3，复制子具有0. 0001%转导效率。本发明以发展新的HCV复制子穿梭载体为特征，其在NS3基因的蛋白酶结构域的 5’和3’端处导入独特的限制性酶位点，从而自HCV感染患者的样品衍生的NS3蛋白酶序列 可以在该穿梭载体中克隆并且可以评价所得复制子的复制适应性和对HCV NS3蛋白酶抑制 剂的易感性。因为个体HCV感染患者一般含有因NS5B RNA聚合酶的高差错率所致的遗传多样的病毒群体，故使用本发明的穿梭载体将允许表征特定患者衍生的NS3蛋白酶变体和 这些变体对药物治疗的敏感度或抗性。因此，本发明提供了包含HCV多核苷酸序列的HCV复制子穿梭载体，其中所述的 HCV多核苷酸序列依次包含位于来自编码NS3蛋白的多核苷酸序列5’端的10个5’核苷酸 与10个3’核苷酸之间的独特限制性酶序列；编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序 列；位于来自编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列3’端的10个5’核苷酸与10 个3’核苷酸之间的独特限制性酶序列；编码NS3蛋白的解旋酶结构域的多核苷酸序列；编 码NS4A蛋白的多核苷酸序列；编码NS4B蛋白的多核苷酸序列；编码NS5A蛋白的多核苷酸 序列；和编码NS5B蛋白的多核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，已经修饰或缺失编 码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列，从而NS3蛋白的蛋白酶结构域是无功能的。在本发明的另一个实施方案中，在编码NS3蛋白的多核苷酸序列5’端处的独特限 制性酶序列识别EcoRV并且在编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列3’端处的独 特限制性酶序列识别AsiSI。仍在本发明的一个实施方案中，HCV复制子穿梭载体包含选自 SEQ ID NO 3或SEQ IDNO 6的HCV多核苷酸序列。本发明的又一实施方案提供了用于评估HCV NS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制 HCV感染的有效性的方法，包括步骤提供来自感染HCV的受试者的样品，通过使用包含独 特限制性酶序列的有义链引物和包含不同的独特限制性酶序列的反义链引物从样品中存 在的多个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列，克隆所述的 PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV复制子质粒，线性化 所述嵌合的HCV复制子质粒并对所述的线性化质粒进行体外转录以产生嵌合的HCV复制子 RNA,并且用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCV NS3蛋白酶抑制剂存在或不 存在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。本发明的再一实施方案提供了用于评估HCV NS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制 HCV感染的有效性的方法，包括步骤提供来自感染HCV的受试者的样品，通过使用包含独 特限制性酶序列的有义链引物和包含不同的独特限制性酶序列的反义链引物从样品中存 在的多个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列，克隆所述的 PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV复制子质粒，转化所 述的质粒至细胞中以产生转化细胞的多个集落，汇集所述集落并从汇集的集落分离嵌合的 HCV复制子质粒，线性化所述嵌合的HCV复制子质粒，对所述的线性化质粒进行体外转录以 产生嵌合的HCV复制子RNA，并且用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCV NS3 蛋白酶抑制剂存在或不存在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。本发明的前述和其他优点和特征以及获得它们的方式将在考虑以下本发明详述 连同伴随的实施例后变得轻易显见，其中所述的实施例阐述了示例性实施方案。附图简 述
图1是HCV复制子穿梭载体的组分的示意图。图2显示NS3蛋白酶复制子穿梭载体(A)pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI (SEQ ID NO 3) ； (B)pSC_lb_NS3/蛋白酶/LacZ_EcoRV_AsiSI(SEQ ID NO 6)的质粒图谱。图3显示pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI以及含有来自HCV基因型-Ia或基 因型Ib的患者衍生的NS3蛋白酶的复制子的复制能力。RLU代表在转染96小时后观察到的萤火虫萤光素酶信号水平。本发明中使用的术语在下文定义。术语“HCV复制子”指来自丙型肝炎病毒的能够指导自身拷贝产生的核酸。如本文 中所用，术语“复制子”包括RNA以及DNA及其杂合体。例如，HCV基因组的双链DNA形式可 以用来产生构成HCV复制子的单链RNA转录物。HCV复制子可以包括全长HCV基因组或也 称作“亚基因组复制子”的HCV亚基因组构建体。例如，本文中所述的HCV亚基因组复制子 含有该病毒非结构蛋白的大多数基因，但是没有编码结构蛋白的大多数基因。亚基因组复 制子能够指导为病毒亚基因组复制、亚基因组复制子复制所必需的全部病毒基因表达，而 不产生病毒颗粒。基本HCV复制子是含有HCV 5’-非翻译(UTR)区、HCV NS3-NS5B多聚蛋白编码区 和HCV 3’-UTR的亚基因组构建体。可以存在其他核酸区域如提供HCV NS2、HCV结构蛋白 的那些核酸区域和非HCV序列。HCV 5’_UTR区提供用于蛋白质翻译的内部核糖体进入位点(IRES)和复制所需的 元件。HCV 5’-UTR区包括延伸进入HCV核心编码区约36个核苷酸的天然存在HCV 5'-UTR 和其功能衍生物。5’ -UTR区可以在不同位置存在，如在编码选择蛋白、报告蛋白或HCV多 聚蛋白的序列下游的位点。除了 HCV 5，-UTR-PC区，非HCV IRES元件也可以存在于复制子中。非HCV IRES元 件可以在不同位置存在，包括紧邻编码HCV多聚蛋白的区域上游。可以使用的非HCV IRES 元件的实例是EMCV IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和牛病毒性腹泻病病毒IRES。HCV 3，-UTR帮助HCV复制。HCV 3，UTR包括天然存在的HCV3，-UTR和其功能衍 生物。天然存在的3’ -UTR包括聚U区域和约100个核苷酸的额外区域。NS3-NS5B多聚蛋白编码区提供了在细胞中可以加工成不同蛋白质的多聚蛋白。 可以是复制子的部分的合适NS3-NS5B多聚蛋白序列包括在不同HCV毒株中存在的那些 NS3-NS5B多聚蛋白序列和导致NS3-NS5B加工以产生功能性复制装置的其功能等同物。恰 当的加工可以通过测试NS5B RNA依赖性RNA聚合酶进行测量。“载体”是一段DNA，如质粒、噬菌体或粘粒，其中另一段DNA区段可以与之连接，从 而引起所连DNA区段的复制、表达或整合。“穿梭载体”指载体，其中可以在特定限制性酶位 点处插入或从载体中切除DNA区段。插入穿梭载体的DNA区段通常编码目的多肽或RNA，并 且设计限制性酶位点以确保DNA区段插入恰当的可读框中用于转录和翻译。多种载体可以用来表达核酸分子。此类载体包括染色体型、附加型和病毒衍生的 载体，例如从细菌质粒、从噬菌体、从酵母附加体、从酵母染色体元件(包括酵母人工染色 体)衍生的载体、从病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、痘病毒、伪狂 犬病毒、疱疹病毒和逆转录病毒衍生的载体。载体也可以从这些来源的组合中衍生，如从 质粒和噬菌体遗传元件衍生的那些载体，例如粘粒和噬菌粒。用于原核和真核宿主的适宜 克隆和表达载体在 Sambrook 等人，(1989)Molecular Cloning =ALaboratory Manual.第 2 版.Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, USA 中描述。含有适宜核酸分子的载体可以使用已知技术导入适宜宿主细胞以增殖或表达。宿 主细胞可以包括细菌细胞，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Sti^ptomyces)和 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真核细胞，包括但不限于酵母、昆虫细胞如果蝇(Drosophila)、动物细胞如 Huh_7、HeLa、COS、HEK 293、MT-2T、CEM-SS 和 CHO 细胞，和植 物细胞。载体通常包括能够选择含有重组载体构建体的细胞亚群的选择标记。该标记可以 在含有本文中所述核酸分子的相同载体中包含或可以存在于分立的载体上。标记包括用于 原核宿主细胞的四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因和用于真核宿主细胞的二氢叶酸 还原酶或新霉素抗性。然而，提供表型性状选择的任何标记将是有效的。“多核苷酸”或“核酸分子”通常指任意多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它可以 是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、作 为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、和作为单链区和双链域区的混合物的 RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或更一般地是双链或是单链区和双链区的 混合物。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或包含RNA和DNA两者的三链区。“多核苷 酸”也包括常称作寡核苷酸的相对短的多核苷酸。另外，术语“DNA分子”仅指分子的一级结构和二级结构，并且不将DNA分子限于任 何具体的三级结构形式。因此，该术语特别地包括在线性DNA分子(例如限制性片段)、病 毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论具体双链DNA分子的结构时，可以在本文中根 据仅给出5’至3’方向的序列连同非转录的DNA链(即，具有与mRNA同源的序列的链)的 常规习惯描述序列。"RNA分子”指处于其单链形式或双链螺旋形式的核糖核苷酸的多聚形式。在讨论 具体RNA分子的结构时，可以在本文中根据给出5’至3’方向序列的常规习惯描述序列。术语“限制性酶序列，，指由均在特定核苷酸序列处或其附近切割双链DNA的细菌 酶识别和切割的特定双链DNA序列。限制性酶“EcoRV”识别序列5’ GAT ^ATC 3’并在所 示(以▼▲显示的)核苷酸位置处切割3' CTAaTAG 5'双链DNA。限制性酶“AsiSI ”识别序列5，GCGAT ▼ CGC 3，并在识别序列3' CGCaTAGCG 5'的T残基之后切割。如本文中所用的术语“引物”指RNA或DNA的、单链或双链的、通过限制性酶消化生 成而从生物系统衍生的或合成产生的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在置于恰当环境下时能 够功能性地充当模板依赖性核酸合成的引发物。当连同适宜核酸模板、核酸的合适核苷三 磷酸前体、聚合酶、合适辅因子和条件如合适的温度和PH存在时，引物可以通过聚合酶作 用或产生引物延伸产物的相似活性所致的核苷酸添加而在引物的3’末端延伸。引起物可 以根据具体的应用条件和要求在长度方面变化。例如在PCR反应中，引物长度一般是15-25 个核苷酸或更长。引物必须与目的模板充分互补以引发目的延伸产物合成，即能够与目的 模板链以这样的方式复性，所述方式足以提供处于适宜并置的引物3’ -羟基部分以用在启 动由聚合酶或相似酶引起的合成中。不要求引物序列代表目的模板的完全互补体。例如， 非互补的核苷酸序列(例如限制性酶识别序列)可以连接至否则是互补引物的5’ -末端。 备选地，非互补的碱基可以散布在寡核苷酸引物序列内部，条件是该引物序列与目的模板 链具有足够互补性以功能性地提供模板引物复合体用于合成延伸产物。如本文中所用的术语“嵌合的”意指从来自两个或多个不同来源的DNA产生的已
11经融合或剪接在一起的DNA分子。如本文中所用，术语“准种”意指优势HCV基因组序列(即基因型)的微变体集 合，所述微变体在单一感染的受试者中甚至在单个细胞克隆中因HCV复制期间的高突变率 形成。如本文中所用的术语“受试者”指脊椎动物，特别地哺乳动物物种的成员，并且包 括但不限于啮齿类、兔、駒鼯和灵长类，后者包括人。术语“样品”指从受试者分离的组织或体液的样品，包括但不限于例如血浆、血清、 脊髓液、淋巴液、皮肤外切片(the external sections of theskin)、呼吸道、肠道和泌尿生 殖道、泪、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官和还有体外细胞培养物组成的样品(包括但不限于 来自所培养细胞、推定的病毒感染的细胞、重组细胞生长产生的条件培养基和细胞组分)。当将外源或异源DNA或RNA导入细胞内部时，则细胞已经被此类DNA或RNA “转 化”或“转染”。转化性或转染性DNA或RNA可以或可以不整合(共价地连接)入构成细胞 基因组的染色体DNA。例如在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化性DNA可以维持在附 加型元件如质粒上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是这样的细胞，其中转化性DNA已经 整合至染色体中，从而该DNA通过染色体复制被子代细胞继承。这种稳定性由真核细胞建 立细胞系或克隆的能力展示，其中所述的细胞系或克隆由含有转化性DNA的子代细胞群体 组成。在转化如本发明中所述哺乳动物细胞的HCV复制子的情况下，RNA分子例如HCV RNA 分子具有半自主复制的能力。携带HCV复制子的Huh-7细胞通过在该复制子上存在的选择 标记或报道基因检测。“克隆”指通常借助有丝分裂过程从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群体。实施例给出以下制备和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解并实施本发明。它 们不应当视为限制本发明的范围，而仅视为说明和描述本发明。实施例1质粒的构建NS3蛋白酶复制子穿梭载体从HCV复制子穿梭载体pSC_lb_NS3_EcoRV衍生，其中 所述的pSC_lb_NS3_EcoRV是用来产生HCV NS3复制子穿梭载体pSC_lb_NS3_EcoRV_XbaI 的中间载体并且在Chua等人于2007年9月27日提交的名为“HCV NS3复制子穿梭载体” 的美国专利申请USSN 60/995, 558中公开，所述文献通过引用的方式完整并入本文中作为 参考。所述复制子穿梭载体的组件在图1中显示并且含有来自5’ -UTR、NS3至NS5B蛋白 和3’ -UTR的HCV多核苷酸序列。所述载体也包括控制萤火虫萤光素酶基因翻译的脊髓灰 质炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)。在萤火虫萤光素酶基因的下游，来自脑心肌炎病毒 (EMCV)的 IRES 控制 HCV 非结构基因(NS3、NS4A、NS4B、NS5A 禾口 NS5B)的翻译。使用QuickChange位点定向诱变试剂盒，按照制造商说明书(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，将突变导入pSC_lb_NS3_EcoRV_XbaI。为了在NS3基因的蛋白酶结构域3’ 端(对应于氨基酸位置SerlSl)导入AsiSI限制性酶序列，使用以下引物有义引物5' -GAGTCTATGGGAACCACTATGCGATCGCCGGTCTTCACGGACAACTCGTC-3' (SEQ ID NO 1)反义引物
5' -GACGAGTTGTCCGTGAAGACCGGCGATCGCATAGTGGTTCCCATAGACTC-3'(SEQ ID NO 2)这些突变不改变NS3蛋白的氨基酸编码序列并且导致生成NS3蛋白酶穿梭载体 pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI(SEQ ID NO :3，图 2A)。生成了另一种 NS3 蛋白酶复制子 穿梭载体，其中编码NS3基因的蛋白酶结构域的序列被来自pUC19 (GenBank登录号M77789) 的半乳糖苷酶(IacZ)编码序列替代。使用以下引物，通过PCR扩增导入在IacZ基因 5’端的EcoRV限制性位点和在其3’端的AsiSI限制性位点5' -ATCATCATCGATATCACCGCGTTGGCCGATTCATTAATG-3' (SEQ ID NO 4) (EcoRV) (LacZ)5‘ -GATGATGATGCGATCGCCAGCTCCCGGAGACGGTCAC-3‘ (SEQ ID NO 5) (AsiSI) (LacZ)以生成载体 pSC_lb_NS3/ 蛋白酶 /LacZ_EcoRV_AsiSI (SEQ ID NO :6，图 2B)。使用实施例3中描述(和在图3中显示)的表型测定法评估NS3蛋白酶复制子穿 梭载体的复制能力。实施例2克隆从感染患者扩增的NS3蛋白酶结构域PCR样品至NS3蛋白酶复制子穿梭载体 中使用superscript III系统(Invitrogen)根据制造商的方案，通过来自血浆的 RNA的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)产生编码NS3基因的蛋白酶结构域的DNA序列，其 中所述的血浆从感染HCV基因型-Ia和基因型Ι-b的患者获得。用于该RT-PCR步骤的引 物如下。基因型Ia 有义引物(NS2)5，-CGTGCGGTGACATCATCAACGG-3，(SEQID NO 7)反义引物(NS3/ 解旋酶)5，-CTCGCCCCCGCAGTCTCTGC-3，(SEQ IDNO 8)基因型Ib 有义引物(NS2)5，-GAGACCAAGATCATCACCTGG-3，(SEQID NO 9)反义引物(NS3/解旋酶)5，-GTCCAGGACTGTGCCGATGCC-3，(SEQIDNO 10)首先在50°C进行复性并且随后是94°C变性、53°C复性和68°C延伸的PCR循环。随 后用PhusionTM高保真DNA聚合酶系统(New EnglandBiolabs)，使用在NS3蛋白的蛋白酶 结构域的5’和3’端导入独特限制性酶序列的引物，将扩增产物进行第二轮PCR。用来在患 者NS3基因序列5’端附近导入EcoRV限制性酶序列的有义引物如下基因型Ia5' -CTGTCTGTCTGATATCACCATGGCGCCCATCACGGCGTACGCC-3， (SEQ ID NO :11)基因型Ib5’-CTGTCTGTCTGATATCACCATGGCGCCTATTACGGCCTACTC-3’ (SEQ ID NO 12)用来在NS3基因的蛋白酶结构域3’端(对应于氨基酸位置SerlSl)附近导入 AsiSI限制性酶序列的引物如下基因型Ia5’-TAGTAGTAGGCGATCGCATGGTTGTCCCTAGGTTCTC-3，(SEOID NO 13)
基因型Ib5' -TAGTAGTAGGCGATCGCATAGTGGTTCCCATAGACTCG-3'(SEQ ID NO: 14)用98°C变性、53°C复性和72°C延伸的PCR循环实施扩增。扩增的患者NS3蛋白酶 DNA随后用Qiagen PCR纯化柱纯化并用EcoRV和SgfI (AsiSI的同切点酶)消化。NS3 蛋白酶穿梭复制子载体 pSC_lb_NS3/ 蛋白酶 _EcoRV_AsiSI 或 pSC_lb_NS3/ 蛋白酶/LaCZ_EC0RV_AsiSI通过用限制性内切核酸酶EcoRV和SgfI双重消化而制备。使 用MightMix连接试剂盒(Takara BioInc.)，将25ng穿梭载体与消化的患者扩增子在16°C 连接1.5小时。常规地使用1 2至1 4的载体对插入物之比。将5μ1反应物转化至 50μ 1的ToplO细胞(Invitrogen)中并在37°C表型表达1小时后涂板。挑出96个独立菌落以接种补充有50 μ g/ml氨苄青霉素的200 μ ITerrific肉汤 (ΤΒ)。这个“原种” 96孔平板在37°C孵育过夜。次日，使用该平板来制备一块重复平板。 使用48针复制器以将平板复制到补充有100 μ g/ml羧苄青霉素的两块LB平板上。将96 份独立的200 μ 1培养物也转移至补充有50 μ g/ml氨苄青霉素的1. 5ml TB培养基以用于 DNA制备。在37°C过夜孵育后，用6ml LB铺展复制平板以获得96个克隆的异质汇集物，所 述汇集物随后用于微量DNA制备。患者的这种DNA汇集物随后用于后续的复制子表型测定 法。在37°C过夜振摇后，将96份独立的1. 5ml TB培养物离心下来、倾析并且使用Qiagen 的Qiapr印96Turbo Mini-DNA试剂盒提取质粒DNA。这些独立的分子克隆用于测序反应， 其中所述独立的分子克隆代表用于复制子表型测定法的复合96汇集物。对异质克隆汇集物质粒DNA或独立的分子克隆进行测序以证实患者样品的身份 并在表型复制子测定法中检验对抑制剂的敏感性。实施例3表型复制子测定法A.体外转录RNA的制备5微克DNA质粒由Sca I限制性酶(Roche)线性化。在37°C过夜消化后，使用 Qiagen PCR纯化试剂盒纯化该DNA。使用T7RiboMAX Express (Promega)，按照制造商的方 案，将1微克的线性化DNA用于体外转录。在37°C孵育2小时后，在37°C进行30分钟DNA 酶处理以除去DNA模板。然后使用RNeasy离心柱(Qiagen)，按照制造商的方案，纯化体外 转录的RNA。B.肝癌细胞系将肝癌Lunet Huh_7细胞系在37 °C于含5% CO2的湿润气氛下培养在补充有 Glutamax 和100mg/ml丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。该培养基进 一步以10% (v/v) FBS和1% (ν/ν)青霉素/链霉素补充。全部试剂均来自Invitrogen/ Gibco0C.瞬时型复制子复制水平的确定使用电穿孔法，用5 μ g体外转录的RNA转染4百万个Lunet Huh7细胞。细胞随 后重悬于含有5% FBS的7. 2ml DMEM中并以50000个细胞/孔(在90 μ 1终体积中)铺种 在96孔平板中。在转染后24小时以3倍稀释度以DMSO终浓度添加抑制剂(当使用抑 制剂时)并且在添加抑制剂后72小时使用萤光素酶测定法系统(Promega)读取萤火虫萤光素酶报道信号。将IC5tl值评估为这样的抑制剂浓度，在所述抑制剂浓度时，与不添加化合 物时萤火虫萤光素酶信号的水平相比，观察到萤火虫萤光素酶报道蛋白的水平降低50%。用萤光素酶信号检验复制子穿梭载体pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI以及含 有HCV基因型-Ia和基因型-Ib患者衍生的NS3蛋白酶结构域的复制子的那些复制能力 并在图3中显示结果。也在这些复制子上检验了 HCV蛋白酶抑制剂BILN2061、VX-950和 NM107的抑制作用并且在表1中显示结果。表 1
权利要求
包含HCV多核苷酸序列的HCV复制子穿梭载体，所述HCV多核苷酸序列依次包含(a)位于来自编码NS3蛋白的多核苷酸序列5’端中的10个5’核苷酸与10个3’核苷酸之间的独特限制性酶序列；(b)编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列；(c)位于来自编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列3’端中10个5’核苷酸与10个3’核苷酸之间的独特限制性酶序列；(d)编码NS3蛋白的解旋酶结构域的多核苷酸序列；(e)编码NS4A蛋白的多核苷酸序列；(f)编码NS4B蛋白的多核苷酸序列；(g)编码NS5A蛋白的多核苷酸序列；和(h)编码NS5B蛋白的多核苷酸序列。
2.权利要求1的HCV复制子穿梭载体，其中已经修饰或缺失编码NS3蛋白的蛋白酶结 构域的多核苷酸序列，从而NS3蛋白的蛋白酶结构域是无功能的。
3.权利要求1或权利要求2的HCV复制子穿梭载体，其中在编码NS3蛋白的多核苷酸 序列5’端处的独特限制性酶序列识别EcoRV并且在编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核 苷酸序列3’端处的独特限制性酶序列识别AsiSI。
4.HCV复制子穿梭载体，其包含选自SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6的HCV多核苷酸序列。
5.用于评估HCVNS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步骤(a)提供来自感染HCV的受试者的样品；(b)通过使用包含独特限制性酶序列的有义链引物和包含不同的独特限制性酶序列的 反义链引物，从样品中存在的多个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多 核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV 复制子质粒；(d)线性化所述嵌合的HCV复制子质粒并对所述的线性化质粒进行体外转录以产生嵌 合的HCV复制子RNA ；和(e)用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制剂存在或不存 在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
6.权利要求5的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1的HCV复 制子穿梭载体。
7.权利要求5的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2的HCV复 制子穿梭载体。
8.权利要求5的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3的HCV复 制子穿梭载体。
9.权利要求5的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4的HCV复 制子穿梭载体。
10.用于评估HCVNS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步骤(a)提供来自感染HCV的受试者的样品；(b)通过使用包含识别EcoRV的限制性酶序列的有义链引物和包含识别AsiSI的限制 性酶序列的反义链引物，从样品中存在的多个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶 结构域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV 复制子质粒；(d)线性化所述嵌合的HCV复制子质粒并对所述的线性化质粒进行体外转录以产生嵌 合的HCV复制子RNA ；和(e)用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制剂存在或不存 在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
11.权利要求10的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1的HCV 复制子穿梭载体。
12.权利要求10的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2的HCV 复制子穿梭载体。
13.权利要求5的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3的HCV复 制子穿梭载体。
14.权利要求5的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4的HCV复 制子穿梭载体。
15.用于评估HCVNS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步骤(a)提供来自感染HCV的受试者的样品；(b)通过使用包含选自SEQID NO 11或SEQ ID NO 12的核苷酸序列的有义链引物和 包含选自SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14的核苷酸序列的反义链引物，从样品中存在的多 个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV 复制子质粒；(d)线性化所述嵌合的HCV复制子质粒并对所述的线性化质粒进行体外转录以产生嵌 合的HCV复制子RNA ；和(e)用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制剂存在或不存 在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
16.权利要求15的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1的HCV 复制子穿梭载体。
17.权利要求15的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2的HCV 复制子穿梭载体。
18.权利要求15的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3的HCV 复制子穿梭载体。
19.权利要求15的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4的HCV 复制子穿梭载体。
20.用于评估HCVNS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步骤(a)提供来自感染HCV的受试者的样品；(b)通过使用包含独特限制性酶序列的有义链引物和包含不同的独特限制性酶序列的 反义链引物，从样品中存在的多个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多 核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV 复制子质粒；(d)转化所述的质粒至细胞中以产生转化细胞的多个集落；(e)汇集所述集落并从汇集的集落分离嵌合的HCV复制子质粒；(f)线性化来自步骤(e)的所述嵌合的HCV复制子质粒并对所述的线性化质粒进行体 外转录以产生嵌合的HCV复制子RNA ；和(g)用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制剂存在或不存 在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
21.权利要求20的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1的HCV 复制子穿梭载体。
22.权利要求20的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2的HCV 复制子穿梭载体。
23.权利要求20的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3的HCV 复制子穿梭载体。
24.权利要求20的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4的HCV 复制子穿梭载体。
25.用于评估HCVNS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步骤(a)提供来自感染HCV的受试者的样品；(b)通过使用包含识别EcoRV的限制性酶序列的有义链引物和包含识别AsiSI的限制 性酶序列的反义链引物，从样品中存在的多个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶 结构域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV 复制子质粒；(d)转化所述的质粒至细胞中以产生转化细胞的多个集落；(e)汇集所述集落并从汇集的集落分离嵌合的HCV复制子质粒；(f)线性化来自步骤(e)的所述嵌合的HCV复制子质粒并对所述的线性化质粒进行体 外转录以产生嵌合的HCV复制子RNA ；和(g)用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制剂存在或不存 在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
26.权利要求25的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1的HCV 复制子穿梭载体。
27.权利要求25的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2的HCV复制子穿梭载体。
28.权利要求25的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3的HCV 复制子穿梭载体。
29.权利要求25的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4的HCV 复制子穿梭载体。
30.用于评估HCVNS3蛋白酶抑制剂在受试者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步骤(a)提供来自感染HCV的受试者的样品；(b)通过使用包含选自SEQID NO 11或SEQ ID NO 12的核苷酸序列的有义链引物和 包含选自SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14的核苷酸序列的反义链引物，从样品中存在的多 个HCV准种中PCR扩增编码NS3蛋白的蛋白酶结构域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR扩增的多核苷酸序列至HCV复制子穿梭载体中以产生嵌合的HCV 复制子质粒；(d)转化所述的质粒至细胞中以产生转化细胞的多个集落；(e)汇集所述集落并从汇集的集落分离嵌合的HCV复制子质粒；(f)线性化来自步骤(e)的所述嵌合的HCV复制子质粒并对所述的线性化质粒进行体 外转录以产生嵌合的HCV复制子RNA ；和(g)用所述的HCV复制子RNA转染Huh7细胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制剂存在或不存 在下测量所述HCV复制子RNA的复制水平。
31.权利要求30的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求1的HCV 复制子穿梭载体。
32.权利要求30的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求2的HCV 复制子穿梭载体。
33.权利要求30的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求3的HCV 复制子穿梭载体。
34.权利要求30的方法，其中步骤(c)的HCV复制子穿梭载体包含权利要求4的HCV 复制子穿梭载体。
全文摘要
本发明提供了新的HCV NS3蛋白酶复制子穿梭载体，其用于克隆来自HCV感染患者的样品的HCV多核苷酸序列并测试所得复制子的药物易感性。
文档编号C12N15/09GK101889085SQ200880119508
公开日2010年11月17日 申请日期2008年11月28日 优先权日2007年12月7日
发明者S·阿力, W-R·蒋 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司