非病毒载体与cxcr4质粒的复合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体涉及一种非病毒载体与CXCR4质粒的复合物及其制备方法和应用。首先，本发明提供了一种非病毒载体与CXCR4质粒的复合物。优选的，复合物的粒径为5nm-5μm。其次，本发明还提供了非病毒载体与CXCR4质粒的复合物的制备方法。非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于改变细胞体内分布等应用。本发明将趋化因子受体通过非病毒基因导入的手段导入到细胞或增加受损部位的趋化因子的浓度，从而改变细胞的体内分布从而达到靶向治疗的效果对于细胞治疗的临床应用具有重要的意义和前景。尤其对于脑损伤和肿瘤靶向药物的制备具有重大意义。
【专利说明】非病毒载体与CXCR4质粒的复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种非病毒载体与CXCR4质粒的复合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]随着生物技术的发展，细胞疗法作为一种新的治疗手段已经得到了越来越广泛的应用。细胞治疗通常采集人体自身细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，然后再回输到人体进行治疗。目前，细胞疗法在慢性退行性疾病，退行性疾病，免疫及恶性肿瘤疾病中都已经得到应用。
[0003]然而，目前通过静脉注射的细胞往往容易聚集于肺、肝部等非靶部位，这会导致治疗时需要移植大量细胞，而大量细胞在非靶组织的聚集会带来安全隐患。成为许多细胞疗法的障碍之一。如何使更多的细胞向受损部位迁移，达到更好的治疗效果成为亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0004]为克服以上问题，本发明提供一种CXCR4质粒，及非病毒载体与CXCR4质粒的复合物，及其制备方法和应用。
[0005]首先，本发明提供了一种非病毒载体与CXCR4质粒的复合物。
[0006]优选的，复合物的粒径为5nm_5 μ m,优选为150_250nm或150_300nm。
[0007]非病毒载体与CXCR4质粒的复合物，载体优选为精胺修饰的普鲁兰糖(Spermine-PulIulan),聚乙烯亚胺修饰的壳聚糖(chitosan-PEI)，聚乙烯亚胺修饰的环糊精(PE1-β-cyclodextrin), lipofectamine2000,载体与 CXCR4 质粒的质量比为 1-200:1，优选为1-50:1。
[0008]其中，载体Spermin-Pullulan 与 CXCR4 质粒的质量比为 1-10, chitosan-PEI与CXCR4质粒的质量比为5-50，PE1-β -cyclodextrin与CXCR4质粒的质量比5-20,lipofectamine2000 与 CXCR4 质粒的质量比为 1-10。
[0009]其次，本发明还提供了非病毒载体与CXCR4质粒的复合物的制备方法。
[0010]非病毒载体与CXCR4质粒的复合物的制备方法:包括如下步骤:
[0011](I)将非病毒载体稀释到0.l-4mg/ml ；
[0012](2)将 CXCR4 质粒稀释至 0.001-lmg/ml (优选 100ug/ml)；
[0013](3)将非病毒载体加入CXCR4质粒溶液，静置孵育制得非病毒载体与CXCR4质粒的复合物(纳米粒)。
[0014]优选的，步骤3)静置孵育时间为5-60分钟；非病毒载体和CXCR4的质量比为
0.1-1000:1。
[0015]优选的，所述的非病毒载体选自聚阳离子，脂质体，囊泡，树突状大分子化合物中的一种。[0016]更优选的,所述非病毒载体为精胺修饰的普鲁兰糖(Spermine-Pullulan),聚乙烯亚胺修饰的壳聚糖(chitosan-PEI),聚乙烯亚胺修饰的环糊精(PE1-β-cyclodextrin),lipofectamine2000,非病毒载体与CXCR4质粒的质量比为1-50:1。其中，载体Spermine-Pul Iulan 与 CXCR4 质粒的质量比为 1-10 优选的，Spermine-Pullulan 与 CXCR4 质粒的质量比为 2.16), chitosan-PEI 与 CXCR4 质粒的质量比为 5-50, PE1-β-cyclodextrin与CXCR4质粒的质量比5-20，lipofectamine2000与CXCR4质粒的质量比为1-10(lipofectamine2000 与 CXCR4 质粒的质量比为 2.16)。
[0017]更优选的，将载体Spermin-Pullulan稀释到0.l-4mg/ml, CXCR4质粒稀释到100ug/ml，将载体分别加入到等体积的DNA溶液中，吹打均匀，静置孵育20min。
[0018]另外，本发明还提供了非病毒载体与CXCR4质粒的复合物的应用。
[0019]非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于改变细胞体内分布。
[0020]非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于制备诱导细胞定向迁移药物中的应用。
[0021]非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于制备治疗脑损伤药物中的应用。
[0022]非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于制备抗肿瘤药物中的应用。
[0023]由于，通过一些趋化因子受体，如CXCR4，CX3CR1, CXCR6, CCRI，CCR7等，可以分别与相对应的趋化因子CXCL12 (SDF-1)，CX3CL1，CXCL16，CCL3，CCL19等发生反应而诱导细胞的定向迁移。因此，在组织损伤部位通过分泌增加的趋化因子的浓度以及增加细胞表达的趋化因子受体的浓度 对于细胞的生存，增殖，趋向和迁移具有重要的调控作用。
[0024]本发明将趋化因子受体通过非病毒基因导入的手段导入到细胞或增加受损部位的趋化因子的浓度，从而改变细胞的体内分布从而达到靶向治疗的效果对于细胞治疗的临床应用具有重要的意义和前景。尤其对于脑损伤和肿瘤靶向药物的制备具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是实施例1体外transwell实验对照图,可以看出:转染CXCR4后,有更多细胞向下层肿瘤细胞迁移。
[0026]图2是实施例1体外加入SDF-1后的实验对照图，有更多的干细胞向含有SDF-1的血清迁移。
[0027]图3是实施例1体内细胞分布实验，在脑卒中模型中，转染了 CXCR4的干细胞更多向脑分布，减少了肺的分布。
[0028]图4是实施例2用lipofectamine2000转染CXCR4质粒入MSCs，和未经转染的MSCs的transwell迁移实验对照图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0030]下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。
[0031]CXCR4 质粒的取得见文献 van Buul JDl, Voermans C，van Gelderen J, AnthonyEC,van der Schoot CE，Hordijk PL.Leukocyte-endotheIium interaction promotesSDF-1-dependent polarization of CXCR4.J Biol Chem.2003Aug8 ；278 (32): 30302-10.[0032]实施例1
[0033]1.载体/DNA的制备
[0034]将载体(Spermine-Pullulan)稀释到0.l-4mg/ml, CXCR4 质粒稀释到 IOOug/ml,将载体分别加入到等体积的DNA溶液中，吹打均匀，静置孵育20min，得到载体(Spermine-PulIulan)与CXCR4质粒的复合物。zeta_sizer粒径仪测定粒径及电位。粒径约为 150-250nm，电位为 10_20mV。
[0035]2.转染CXCR4质粒到干细胞
[0036]取细胞生长到培养皿80%满的MSCs，弃去培养液，PBS清洗两遍，按IOml每皿加入不含血清的DMEM低糖培养液(例如葡萄糖浓度为5.6mmol/L)，再加入1ml已配制好的载体/DNA复合物(Spermine-Pul Iulan与CXCR4质粒的质量比为2.16)，转染4小时后换成含15% FBS的DMEM低糖培养液，37°C，5% C02培养一天后移植细胞。
[0037]3.体外 Transwell 实验
[0038]DMSCs培养至2-6代，换成0.5%的血清培养12hr，用移液枪吸净培养液后，加入含0.2% EDTA的胰酶消化，调整密度为4*105/ml。
[0039]2)取0.1ml加入transwell上层(视情况加入0.05 % ~0.2% BSA),下层加入600 μ I肿瘤细胞，培养12-18hr。
[0040]3)取出transwell,用棉签擦去内室的一层细胞，另一面用冰甲醇室温固定IOmin, PBS洗3次，结晶紫染色20min，PBS洗3次，倒置显微镜观察，拍照，计数。
[0041]实验对照图见图1，可以看出:转染CXCR4后，有更多细胞向下层肿瘤细胞迁移。
[0042]通过体外加入SDF-1后的实验对照图(附图2)，有更多的干细胞向含有SDF-1的血清迁移。
[0043]4.MSCs 的 CM-Dil 染色
[0044]I)用移液枪吸去培养液后，PBS洗两遍，加入含0.2% EDTA的胰酶消化，光镜下观察，待细胞蜷缩成圆形时，立刻加入含FBS的DMEM培养液终止消化。
[0045]2)用移液枪反复吹打成细胞悬液，置离心管中，1200rpm离心5min。
[0046]3)弃去上清液，计数，106个细胞悬浮于含I μ ICM-Dil (lmg/ml)的500 μ I PBS中。
[0047]4) 37°C孵箱放置5min，4°C冰箱放置15min，此过程注意避光。
[0048]5) 1200rpm离心3min后，再用PBS洗两遍,最后重悬于PBS中。
[0049]5.脑缺血再灌注模型(MCAO)的建立
[0050]10%水合氯醛麻醉大鼠，钝性分离右侧的颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。结扎ECA近端和CCA近心端，并在其分叉处打一活结备用。用微动脉夹夹住ICA,在CCA距动脉分叉3~5mm处剪一小口，插入MCAO线栓，松开夹住ICA的动脉夹，将线栓缓慢向ICA插入，继续将线栓缓慢向ICA入炉方向推进，插入深度约17~18_，微遇阻力时停止，扎紧预制活结，缝合皮肤。2h后拔掉线栓。
[0051]6.MSCs的体内迁移
[0052]MSCs细胞用胰酶消化后，重悬于PBS中，计数，IO6个细胞加入含I μ LCM-Dil的500 μ L的PBS，避光于37°C孵育5min，4°C放置15min，再用PBS洗两遍，即可获得CM-Dil标记的MSCs。[0053]大鼠尾静脉注射CM-Dil标记的MSCs，一天后处死，心脏灌流后取出新鲜脑组织及其他组织用小动物活体荧光成像系统观察细胞在组织中的分布情况。结果见图3。
[0054]实施例2
[0055]1.载体/DNA的制备
[0056]将载体(lipofectamine2000)稀释到0.1-lmg/ml, CXCR4 质粒稀释到 100ug/ml,将载体分别加入到等体积的DNA溶液中，吹打均匀，静置孵育20min，zeta-sizer粒径仪测定粒径及电位。粒径约为150-300nm，电位为10_30mV。
[0057]2.转染CXCR4质粒到干细胞
[0058]取细胞生长到培养皿80%满的MSCs，弃去培养液，PBS清洗两遍，按IOml每皿加入不含血清的DMEM低糖培养液，再加入1ml已配制好的载体/DNA复合物(lipofectamine2000与CXCR4质粒的质量比为2.16)，转染4小时后换成含15% FBS的DMEM低糖培养液，37°C，5% C02培养一天后移植细胞。
[0059]4.体外 Transwell 实验
[0060]DMSCs培养至2-6代，换成0.5%的血清培养12hr，用移液枪吸净培养液后，加入含0.2% EDTA的胰酶消化，调整密度为4*105/ml。
[0061]2)取0.1ml加入transwell上层(视情况加入0.05 % -0.2% BSA),下层加入600 μ I肿瘤细胞，培养 12-18hr。
[0062]3)取出transwell，用棉签擦去内室的一层细胞，另一面用冰甲醇室温固定IOmin, PBS洗3次，结晶紫染色20min，PBS洗3次，倒置显微镜观察，拍照，计数。
[0063]图4是用I ipofectamine2000转染CXCR4质粒入MSCs，和未经转染的MSCs的transwell迁移实验对照图。
【权利要求】
1.一种非病毒载体与CXCR4质粒的复合物。
2.根据权利要求1所述的非病毒载体与CXCR4质粒的复合物，其特征在于:粒径为5nm_5 μ m。
3.权利要求1所述的非病毒载体与CXCR4质粒的复合物的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将非病毒载体稀释到0.l-4mg/ml ； (2)将CXCR4 质粒稀释至 0.001-lmg/ml ； (3)将非病毒载体加入CXCR4质粒溶液，静置孵育制得非病毒载体与CXCR4质粒的复合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤3)静置孵育时间为5-60分钟；非病毒载体和CXCR4的质量比为0.1-1000:1。
5.根据权利要求1一 4任一所述的非病毒载体与CXCR4质粒的复合物或非病毒载体与CXCR4质粒复合物的制备方法，其特征在于:所述的非病毒载体选自聚阳离子，脂质体，囊泡，树突状大分子化合物中的一种。
6.根据权利要求5所述的非病毒载体与CXCR4质粒的复合物或非病毒载体与CXCR4质粒复合物的制备方法，其特征在于:所述非病毒载体为精胺修饰的普鲁兰糖(Spermine-PulIulan),聚乙烯亚胺修饰的壳聚糖(chitosan-PEI)，聚乙烯亚胺修饰的环糊精(PE1-β-cyclodextrin), lipofectamine2000,非病毒载体与CXCR4质粒的质量比为1-50:1。
7.非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于改变细胞体内分布。
8.非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于制备诱导细胞定向迁移药物中的应用。
9.非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于制备治疗脑损伤药物中的应用。
10.非病毒载体与CXCR4质粒的复合物用于制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103993028SQ201410209647
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月18日 优先权日:2014年5月18日
【发明者】胡瑜兰, 高建青, 黄冰 申请人:浙江大学