专利名称：重组vsv病毒载体和重组vsv病毒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组VSV(水疱性口炎病毒)病毒载体及重组VSV病毒，以及该病毒载体及重组病毒的制备方法。本发明还涉及重组VSV病毒载体在外源蛋白表达，抗体制备及疫苗研制等方面的用途。
背景技术：
疫苗对于由病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病具有高效的防治作用。传统制备疫苗的途径是利用灭活或减毒后的病原体，但是灭活，减毒的过程经常会破坏病原体的免疫原性，影响免疫效果，且安全性难以保证。亚单位疫苗和DNA疫苗虽安全性较好，但免疫原性也低，免疫效果不佳。
重组病毒载体由于表达效率高，引起免疫反应全面而成为目前疫苗研究中的热点。由于DNA病毒可能整合到宿主细胞基因组中，因此虽然有些DNA病毒载体疫苗能提供一定的免疫保护，但应用时其安全性受到怀疑。
因此，研制免疫原性高，同时安全性好的重组病毒载体受到了越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的是构建表达效率高、安全性好且容易进行分子操作和改造的重组病毒载体，以用于多种外源蛋白的表达，制备抗体及研制相应疫苗。
本发明选择水疱性口炎病毒(VSV)进行分子操作和改造，构建了重组病毒载体。
水疱性口炎病毒(VSV)为RNA病毒，含有线状单股负链RNA，从3’到5’端依次排列着N、P、M、G和L5个不重叠的基因，分别编码病毒的核蛋白(N)，磷酸蛋白(P)，基质蛋白(M)，病毒糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。VSV病毒分子结构简单，仅编码五种蛋白质，易于进行分子操作和改造，并可从DNA质粒恢复形成完整的重组VSV病毒，使其在宿主细胞中高效表达外源基因产物。
VSV病毒引起的水疱性口炎是接触性传染的良性病毒性疾病，常见于牛、鹿和猪。人只偶然感染，但常不显症状或仅轻微发热。同时VSV病毒只在细胞质中复制，不会整合到宿主的基因组中，将其应用于抗体制备及疫苗研究应用时具有较高安全性。
本发明构建了重组VSV病毒载体，该载体是包含已知VSV病毒基因组，可携带外源基因，能恢复出重组VSV病毒的质粒载体。
本发明还提供了具有复制功能的重组VSV病毒，该病毒由重组VSV病毒载体恢复形成，具有复制功能及感染性，可在被感染的宿主细胞中增殖并表达基因组中所携带的外源基因的病毒颗粒。
所述VSV病毒基因组或其一部分可以来源于不同血清型的VSV、HIV、SARS、MulV、HTLV、SIV或其它病毒；所述VSV病毒基因组中包含的一个或多个结构基因或其部分可以去除或通过改造其序列来改变病毒的结构特征；所述外源基因可以是带有或不带有报告基因的一段或一段以上编码生物活性物质的外源序列；所述报告基因可以选自GFP、EGFP、YFP、RFP、BFP、AP、SEAP、Luc、LacZ、CFP或CAT其中之一；所述VSV病毒载体基因组中所包含的结构基因顺序及外源基因与报告基因位置可以改变；本发明提供的VSV载体的制备方法是1.将VSV野生病毒的RNA抽提出来，通过RT-PCR的方法获得其基因组各片段，同时通过PCR的方法把核酶序列引入L基因的下游，将这些片段插入中间载体中；2.选择一种带有RNA聚合酶启动子序列的真核细胞表达质粒载体，在多克隆位点下游插入聚合酶的转录终止序列；3.把中间载体中VSV病毒各片段与改造的真核细胞表达质粒载体顺序拼接起来，即得到VSV载体。
所述核酶序列来源于丁型肝炎病毒的核酶；所述RNA聚合酶是通过重组痘病毒在细胞中表达的T7 RNA聚合酶。
本发明提供的重组VSV病毒的制备方法是1.质粒一的制备将外源基因的DNA序列插入VSV载体质粒中；2.质粒二的制备将VSV N蛋白基因插入真核细胞表达质粒中；3.质粒三的制备将VSV P蛋白基因插入真核细胞表达质粒中；4.质粒四的制备将VSV L蛋白基因插入真核细胞表达质粒中；5.将上述四种质粒共转染到某一支持VSV复制的细胞系中，24～48小时后收集细胞上清，扩增一至两代后收获重组的VSV病毒。
在上述制备方法中，所述外源序列可以是克隆的DNA序列，基因组DNA，由病原体或肿瘤RNA得到的cDNA，或化学合成的DNA序列。
质粒一中所述VSV载体在细胞中转录产生的RNA分子包括a)包含复制启动子的VSV正链RNA，其中复制非必需区域可以含有外源序列或被外源序列所取代；b)位于上述正链RNA下游的核酶序列，用于产生正确的正链RNA的3’末端。
所述外源序列既可与VSV病毒基因融合表达，也可以非融合形式表达。
所述真核细胞表达质粒均包含噬菌体RNA聚合酶启动子及RNA聚合酶的转录终止信号。
所述转染方法可以是脂质体转染法，磷酸钙转染法，电转染法等。
所述支持VSV复制的细胞包括BHK21，293T，Cos7，Vero等真核生物细胞系。
本发明将上述病毒载体及重组病毒用于高效表达外源基因。
本发明提供的重组VSV病毒表达的外源基因产物可被纯化，或直接将重组VSV病毒用于感染实验动物而获得外源基因产物的抗体或中和抗体，并可用于各种病毒或细菌性疾病的疫苗研制。
本发明的优点是1.安全重组VSV病毒具有感染性，可以在宿主细胞内高效表达外源基因产物。但安全性高，不会整合到宿主细胞基因组中，最终会被宿主免疫系统清除，因此是一种理想的病毒载体。
重组VSV感染动物一般是引起皮肤水疱样病变，2周内可自愈。人虽然也能感染VSV，但不会引起严重后果的疾病。
2.有效重组VSV病毒可以在宿主细胞内高效表达外源基因产物，往往一次接种即可引起强烈的免疫应答反应。尤其是能引起较强的粘膜免疫反应。
3.操作方便VSV载体易于进行分子操作和改造，并能恢复形成具有复制能力的重组VSV病毒。
重组VSV病毒易于培养，在多种细胞培养中滴度能达到109pfu/ml以上。
重组VSV病毒易于使用，可通过多种接种途径进行免疫。
具体实施例方式实施例1构建VSV载体及辅助质粒1.VSV印第安那株来源于北京大学生命科学学院2.重组VSV载体的构建参照PNAS(1995)Vol.92p4477-81所述方法。为方便遗传操作，通过定点突变，在G蛋白的3’端非翻译区引入NheI位点，并在G与L之间插入具有最小转录起始和终止单位的一段Linker及XhoI位点GCTAGGTATGAAAAAAACTAACAGAT ATCACGCTCGAGAATTAATTGCTAGStop/poly(A) 转录起始XhoI NheI通过类似方法，在G蛋白上游非翻译区引入MluI，便于将来替换不同毒株的G蛋白。这一质粒称为pVSV1，基本结构为T7启动子-N-P-M-G-L-HDV核酶序列-T7终止子3.构建辅助质粒从pET28a中PCR扩出T7终止子，插入pBluescriptSK II+中，得到pSK-Ter。再通过PCR，获得N、P、L片段，插入pSK-Ter，即得到这三种辅助表达质粒，命名位pSK-N，pSK-P，pSK-L。
实施例2转染和恢复重组VSV病毒1.10cm dish中BHK-21细胞长至70％满，用MOI为10的vTF7-3感染1小时，vTF7-3来源于PNAS(1986)Vol.83p8122-26；2.1小时后，脂质体法共转染pVSV1，pSK-N，pSK-P，pSK-L四种质粒，四种质粒比例为10μg∶3μg∶5μg∶2μg；3.37度培养48小时后，细胞反复冻融三次(-70度→37度)，收集裂解液，12,000转离心5分钟去除细胞碎片；4.一半裂解液感染新鲜BHK细胞，同时加入25μg/μl的AraC抑制痘病毒；5.48小时后，收集上清，12,000转离心10分钟，用0.22μm滤器(Millipore)过滤，以彻底除去痘病毒，即得到重组VSV病毒。
结果恢复时，重组病毒产生的几率非常低，相当于在107-108转染细胞中产生一个病毒粒子。所以需要扩增一代才能观察到细胞全部变圆，该现象不同于痘病毒产生的病变。
实施例3重组VSV病毒的扩增1.空斑实验测定病毒的滴度；2.MOI为0.1的病毒上清感染新鲜BHK细胞，16-24小时后收集上清，-70度保存。
4实施例4重组VSV病毒的鉴定1.收获的病毒上清加到10％的蔗糖溶液上，Beckman SW40转头35,000rpm超离1.5小时。病毒沉淀用0.1ml PBS重悬，得到纯化的病毒粒子。
2.取5μl跑10％SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染色。
3.Western检测P蛋白的表达，一抗使用本实验室制备的兔多抗血清。
结果1.VSV病毒的五种结构蛋白N、P、G、M、L大小正确。
2.Western检测到P蛋白的表达。
实施例5重组VSV病毒表达外源基因的检测将荧光素酶(luciferase)基因插入pVSV1的XhoI/NheI位点，按前述方法恢复，扩增病毒，并检测报告基因的表达情况。
结果扩增一代后收获细胞检测荧光素酶活性1号 28810893cps2号 21251296cps
结论重组VSV病毒载体能在宿主细胞中高效表达外源基因产物。
实施例6重组VSV病毒免疫小鼠，产生针对VSV的中和抗体已知滴度的纯化病毒用无血清DMEM稀释至25μl体积中含105病毒颗粒，通过鼻腔免疫BALB/c鼠，两周后取同批纯化病毒以106剂量加强免疫。一周后尾静脉取血。通过本实验室建立的假病毒系统检测中和抗体效价。
VeroE6检测鼠源免疫血清实验结果
¤对假病毒携带的荧光素酶表达的检测，单位为cps结论重组VSV病毒免疫能产生针对VSV的中和抗体。利用该重组病毒表达病原体(细菌、病毒)来源的抗原或肿瘤抗原，可能诱发机体产生预防性或治疗性的免疫反应。
实施例7缺陷病毒恢复及报告基因的表达实验目的证明经过缺失等改造的重组病毒仍具有复制、感染及表达外源基因的能力。为将来对VSV载体进一步减毒致弱打下基础。
实验方法1.把GFP基因插入pVSV1的MluI/NheI间，得到PVΔG-GFP；2.基本按照上述方法恢复和扩增病毒，同时转染4μg pCAG-G质粒，反式提供G蛋白；3.观察GFP基因的表达。
结果荧光下可见大量表达GFP的细胞。
结论缺陷病毒也具有复制及表达外源基因的能力。
权利要求
1.重组VSV病毒载体，特征是包含VSV病毒基因组、可携带外源基因，并能恢复出重组VSV病毒的质粒载体。
2.重组VSV病毒，特征是由重组VSV病毒载体恢复形成、具有复制功能及感染性、可在被感染的宿主细胞中增殖并表达基因组中所携带的外源基因的病毒颗粒。
3.权利要求1或2所述的重组VSV病毒载体或重组VSV病毒，所述VSV病毒基因组的部分可以来源于不同血清型的VSV、HIV、SARS、MulV、HTLV、SIV或其它病毒。
4.权利要求1或2所述的重组VSV病毒载体或重组VSV病毒，所述VSV病毒基因组中包含的一个或多个结构基因或结构基因的一部分可以去除或进行序列改造；或结构基因顺序及外源基因与报告基因位置可以改变。
5.权利要求1或2所述的重组VSV病毒载体或重组VSV病毒，所述外源基因是带有或不带有报告基因的一段或一段以上编码生物活性物质的外源序列；其中所述报告基因选自GFP、EGFP、YFP、RFP、BFP、AP、SEAP、Luc、LacZ、CFP或CAT其中之一。
6.权利要求1所述的重组VSV病毒载体的制备方法是1)将野生VSV病毒的RNA抽提出来，通过RT-PCR的方法获得其基因组各片段，同时通过PCR的方法把核酶序列引人L基因的下游，将这些片段插入中间载体中；2)选择带有RNA聚合酶启动子序列的真核细胞表达质粒载体，在多克隆位点下游插入聚合酶的转录终止序列；3)把中间载体中VSV病毒各片段与改造的真核细胞表达质粒载体顺序拼接起来，即得到VSV载体。
7.权利要求2所述的重组VSV病毒的制备方法是1)质粒一的制备将外源基因的DNA序列插入VSV载体质粒中；2)质粒二的制备将VSV N蛋白基因插入真核细胞表达质粒中；3)质粒三的制备将VSV P蛋白基因插入真核细胞表达质粒中；4)质粒四的制备将VSV L蛋白基因插入真核细胞表达质粒中；5)将上述四种质粒共转染到某一支持VSV复制的细胞系中，24～48小时后收集细胞上清，扩增一至两代后收获重组的VSV病毒。
8.权利要求7所述的重组VSV病毒的制备方法，所述外源序列是克隆的DNA序列、基因组DNA、由病原体或肿瘤RNA得到的cDNA，或化学合成的DNA序列；且所述外源序列既可与VSV病毒基因融合表达，也可以非融合形式表达。
9.权利要求1或2所述的重组VSV病毒载体或重组VSV病毒用于表达外源基因的用途。
10.权利要求1或2所述的重组VSV病毒载体或重组VSV病毒用于制备外源基因产物的抗体或中和抗体的用途。
11.权利要求1或2所述的重组VSV病毒载体或重组VSV病毒用于制备病毒或细菌性疾病的疫苗的用途。
全文摘要
本发明构建了包含VSV(水疱性口炎病毒)病毒基因组、可携带外源基因，能恢复出重组VSV病毒的重组VSV病毒载体，还制备了具有复制功能及感染性，可在被感染的宿主细胞中增殖并表达基因组中所携带的外源基因的重组VSV病毒颗粒。本发明将上述病毒载体及重组病毒用于高效表达外源基因，所表达的外源基因产物可被纯化，或直接将重组VSV病毒用于感染实验动物而获得外源基因产物的抗体或中和抗体，并可用于各种病毒或细菌性疾病的疫苗研制。
文档编号C12N15/11GK1590552SQ0315614
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月1日 优先权日2003年9月1日
发明者邓宏魁, 丁明孝, 聂玉春, 袁菲, 王在, 郭延平, 胡建军, 李锦全, 易凌 申请人:北京大学