一种重组病毒载体及其应用的制作方法

专利名称：一种重组病毒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种用编码骨保护素和成纤维生长因子 的核苷酸序列和病毒载体序列构建的重组病毒载体。
背景技术：
牙周病(periodontitis)在世界范围内均有较高的患病率，在我国更居于龋病之 上。牙周病的患病率和严重性随年龄增长而增高，50 60岁时达到高峰。随着我国进入 老龄化社会，牙周病更将成为突出的影响人类健康和生存质量的问题。牙周病特征性表 现为附着丧失、牙槽骨吸收，在病变牙周组织中各种刺激因素导致的破骨细胞活化，抑 制了牙周组织的成骨能力，造成牙周支持组织不可逆性损害，而牙槽骨的渐进性吸收、 破坏是造成牙齿脱落的主要原因之一。所以，一些学者认为缺损牙槽骨的再修复是一项 全球性的社会和医学问题。而传统的治疗方法对再生组织成分缺乏主动的诱导分化和加 速生长作用，不能使牙周组织完全修复。当前临床治疗重症牙周病的过程中，往往由于手术中患牙位置、患病部位、现 有器械和技术水平等因素，无法根除病变坏死牙周组织、细菌毒素及其代谢产物；其 次，由于口腔是个开放的、多种细菌共生的生态环境，无法避免术后手术部位重新被细 菌所侵袭；同时牙周组织中成骨细胞、牙周膜细胞等在细菌作用下可产生内源性的前列 腺素(PGE)、白细胞介素l(IL-l)、肿瘤坏死因子(TNF)和基质金属蛋白酶等细胞因子， 这些细胞因子可引起牙槽骨吸收及软组织破坏。人体骨骼是动态的不断变化的组织，循环重复着骨吸收-重建，开始于破骨细 胞的分化、成熟、迁移、附着于骨表面并完成骨吸收，随后是成骨细胞形成新骨，这个 过程受成骨细胞调控。成骨细胞/骨髓基质细胞表达破骨细胞分化因子(RANKL)，促进 破骨细胞的分化及骨吸收；同时分泌骨保护素(OPG)，以防止过度骨吸收。在由骨髓基 质细胞向成骨细胞分化过程中成骨细胞分泌RANKL和OPG的比率不同未成熟的成骨 细胞/骨髓基质细胞分泌更多的RANKL，而成熟的成骨细胞分泌更多0PG，以确保骨吸 收和骨形成两个过程紧密相连并达到平衡。OPG属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是RANKL的天然抑制剂，可竞争性 地抑制RANKL与RANK的结合，抑制前体破骨细胞的增殖、分化及存活，抑制成熟 破骨细胞的骨吸收活性，从而抑制骨吸收[6]。Mogi M等(J Dent Res，2004，83(2) 166-169)研究发现，慢性牙周炎患者龈沟液中RANKL浓度增高，OPG浓度明显下降， 牙周炎病人骨吸收病变区黏附的病变肉芽组织中RANKL表达明显高于非牙周炎组织， OPG在非牙周炎组织中表达高于牙周炎组织[7]，提示OPG可促进牙周组织生长。姜新朋等(吉林大学学报，2008，34(4) 633-635)研究发现人牙髓细胞在 不同浓度碱性成纤维生长因子(bFGF)作用下可促进细胞增殖，赵征等(临床口腔医学杂 志2005，21(4) 203-206)经过大量实验也证明FGF-2在成人牙周炎病损组织中表达阳 性率显著高于正常组织，提示FGF-2是牙周病损组织修复的重要细胞因子，可能通过调节人牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性和合成纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)的水平，发挥PDL细胞在牙周组织的再 生中的作用，同时FGF-2能显著地抑制人PDLCs胶原酶II、IV的表达，进而促进牙周组
织再生。因此，从骨吸收-重建分子机理入手，应用基因治疗技术增加牙周组织中OPG 分泌，从而抑制RANKL的功能，阻断破骨细胞增殖、分化与成熟，辅以促进组织增殖 FGF-2的应用，来探讨治疗重症牙周病牙周组织缺损的方法。腺病毒载体在自然界分布广泛，具有许多独特的优点病毒基因不与宿主细胞 基因组整合，安全性较好；感染的宿主细胞范围广泛，而且可感染非分裂期细胞；插 入外源基因容量大，制备和操作简便；病毒繁殖滴度高且易于纯化；细胞及动物实验表 明，腺病毒载体很容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活 性蛋白。上述优点，使腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能促进牙周组织生长的重组病毒载体。为达到上述目的，本发明的技术方案为一种重组病毒载体，该载体包括一 个病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因 子。所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载 体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。所述腺病毒载体是缺失性腺病毒载体。所述腺病毒载体是人腺病毒载体或动物腺病毒载体。所述腺病毒载体是人5型腺病毒载体、35型腺病毒载体、2型腺病毒载体或6型 腺病毒载体。所述编码骨保护素的核苷酸序列见SEQ ID NO 1所示。所述编码成纤维生长因子的核苷酸序列见SEQ ID NO 2所示。所述外源目的基因序列可通过内部核糖体进入位点序列连接，从启动子双顺反 子地表达。本发明的重组腺病毒，两个外源基因可同时表达，相互独立，OPG采用CMV 启动子，而FGF的表达则依赖于IRES。所述内部核糖体进入位点序列见SEQ IDNO 3所示。所述外源目的基因序列可融合表达于载体。上述重组病毒载体在制备用于治疗牙周病药物中的应用。本发明的重组病毒载体是通过如下方法获得的，利用PCR技术分别扩增出具有 抑制破骨细胞功能的OPG和促进组织增值的FGF-2基因，通过多次克隆构建出含OPG和 FGF-2基因双顺反子穿梭载体，再进一步和骨架质粒pAdeasy-Ι同源重组获得含上述两种 基因的双顺反子重组腺病毒。根据上述方案，首先通过PCR扩增得到所需要的基因，分别插入T载体，将带 OPG的T载体酶切后与同样酶切的带IRES的T载体连接成带OPGI的T载体。再将带 OPGI的T载体酶切，与同样酶切的带FGF的T载体连接成带0PGIFGF的T载体，再将该三个基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV载体，成pSC-OPGIFGF。该载体经过PmeI线 性化，与骨架载体pAdEasy-Ι共同转化BJ5183，得到pFGAd/OPGIFGF重组载体。将该 重组载体经过PacI线性化，然后转染293细胞，得到重组腺病毒载体rAd_OPGIFGF。本发明还对得到的重组腺病毒载体进行了药效的动物试验验证试验分为四 组，试验组为翻瓣+胶原膜+局部重组腺病毒，对照分为三组分别为翻瓣+胶原膜； 翻瓣+局部重组腺病毒；翻瓣。其中翻瓣为实验牙部位翻开联骨膜瓣，胶原膜为瑞士盖 特公司生产的胶原纤维编织而成的生物膜。每组的处理过程如下实验组a:将滴有重组腺病毒的胶原膜置于骨质缺损处，缝合固定，冠方平齐龈 缘，轻压组织瓣，使其与骨面贴合，然后轻压龈瓣的冠方，静置8min，缝合龈瓣，术后 两天实验牙部位局部注射重组病毒Iml ；对照组b:翻瓣去骨后，置入未滴加重组腺病毒的胶原膜，缝合龈瓣。对照组c 翻瓣去骨后缝合，实验牙部位局部注射重组病毒1ml。对照组d:翻瓣去骨后缝合通过试验发现注射重组病毒载体对于造牙周缺损的牙的骨高度、丰满度和骨 密度具有促进作用，即具有促进牙周组织生长的作用。利用基因工程和基因治疗技术，在治疗牙周病时既通过手术去除致病因素，又 利用基因治疗技术促使细胞在分化增殖的同时起到生物发生器的作用，持续表达破骨细 胞抑制因子和碱性成纤维生长因子，并分泌到细胞外，从而阻断破骨细胞的分化、成熟 与激活，同时促进牙周细胞增殖，创造出一个利于牙周组织缺损修复的环境，达到修复 牙槽骨缺损、形成新附着的目的。


图1是重组腺病毒构建流程图。图2是PGEM载体图谱。图3是PIRES载体图谱。图4 是 pShuttle-CMV 载体图谱。图5是骨架载体pAdEasy-Ι载体图谱。图6是构建的PSC-OPGIFGF载体的酶切鉴定图谱图7是重组腺病毒rAd-OPGIFGF的酶切鉴定图谱。图8是RT-PCR分析重组腺病毒rAd-OPGIFGF目的基因的转录结果图9A、B是Western blot检测两种目的蛋白的表达图10是家犬牙的造牙周缺损的照片。图11是家犬注射本发明重组腺病毒载体后满1月，四组家犬牙的照片和X光照 片。图12是是家犬注射本发明重组腺病毒载体后满3月，四组家犬牙的照片和X光 照片。
具体实施例方式实施例1、重组腺病毒rAd-OPGIFGF载体的构建
下面结合图1对重组腺病毒rAd-OPGIFGF载体的构建做进一步详细描述。以下所述5型腺病毒还可以是2型腺病毒、6型腺病毒、35型腺病毒或者动物腺病毒。以下试验所用的限 制型核酸内切酶、PacI酶、PmeI酶均购自Promega或sigma公司。1、OPG> FGF-2基因片段的获得OPG基因片段的获得提取293细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院生 物化学与细胞生物学研究所)总RNA，将该总RNA做模板进行RT-PCR。设计引物 OPG 的上游引物(Beg) 5' -AAGGATCCAACAACTTGCTGTGCTGCGCGCTCG-3'， 下游弓丨物(End) 5' -CCGAATTCTTATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTG-3'；(上海
生工生物工程技术有限公司合成)，反转录条件为预变性95°C 3分钟，变性94°C 1分 钟，退火55°C 2分钟，延伸72°C 1分钟，30个循环，再延伸72°C 10分钟。电泳回收 约1206bp条带，将回收产物与pGEM-T easy克隆载体(购自Promega公司)连接，鉴定 正确，命名为重组载体pGEM-T-OPG，送上海生工公司测序，测序结果见SEQ IDNO
IoFGF-2基因片段的获得提取293细胞总RNA，将该总RNA做模板进行 RT-PCR。设计引物上游引物(Beg) 5' -TCTAGACACCATGGCAGCCGGGAGCA T-3'，下游弓丨物(End) 5' -GTCGACTCAGCTCTTAGCAGACATTGG-3 ‘。(上海
生工生物工程技术有限公司合成)，反转录条件为预变性95°C3分钟，变性94°C1分 钟，退火55°C 2分钟，延伸72°C 1分钟，30个循环，再延伸72°C 10分钟。电泳回收 约465bp条带，将回收产物与pGEM-T easy克隆载体连接，鉴定正确，命名为重组载体 pGEM-T-FGF2,送上海生工公司测序，测序结果见SEQ ID NO 2。2、IRES基因片段的获得设计弓I 物IRES-I TAG AGA TCT ACT GGG CAG GTA AGT ATC AA ； IRES-2 TAG CTC GAG CCT CAC TAAAGG GAA GCG (上海博亚公司合成)两条引物的 5，端分别引入限制性内切酶BglII和SalI酶切位点。以pIRES载体(购自BD Bioscience
Clontech公司)为模板，进行PCR。预变性94°C 2分钟，变性94°C 1分钟，退火55°C 1 分钟，延伸72°C1分钟，30个循环，再延伸72 °C 7分钟。电泳回收约900bp条带，将回 收产物与pGEM-T easy克隆载体连接，鉴定正确，命名为重组载体pGEM-T_IRES，送上 海生工公司测序，测序结果见SEQ IDNO 3。3、腺病毒穿梭载体pSC-OPGIFGF的获得1)将 OPG 基因克隆入 pGEM-T-IRES 取质粒 pGEM-T-OPG 禾口 pGEM-T-IRES,同时用Nhe I和Xho I进行双酶切，同上述方法回收OPG基因片段和 pGEM-T-IRES载体片段，连接，转化E.coli DH5 α感受态(购自中国科学院上海生命科 学研究院生物化学与细胞生物学研究所)细胞，得到重组载体pGEM-T-OPGI。2)将 FGF-2 基因克隆入 pGEM-T-IOPG 取质粒 pGEM-T-FGF 禾口 pGEM-T-IOPG,同时用Nhe I和Xho I进行双酶切，同上述方法回收OPG基因片 段，pGEM-T-IRES载体片段，连接，转化E.coli DH5 α感受态细胞，得到重组载体 pGEM-T-OPGIFGF。
用BglΠ和SalI双酶切pGEM-T-OPGIFGF，回收OPGIFGF 片段。用 Bgl II 和 SalI双酶切pShuttle-CMV(购自Promega公司)，回收载体片段，14度连接过 夜，转化， 用Nhe I和Sal I双酶切和BamHI单酶切鉴定，正确插入目的基因OPGIFGF的穿梭质粒命 名为PSC-OPGIFGF。检测结果见图6 用Nhe I和Sal I双酶切和BamHI单酶切鉴定图 谱，第一泳道为DL15000Marker，第二泳道为Nhe I和Sal I双酶切pSC-OPGIFGF载体， 第三泳道为BamH I单酶切pSC-OPGIFGF载体。4、重组腺病毒rAd-OPGIFG的获得将步骤3所得重组载体PSC-OPGIFGF进行Pme I酶切线性化，回收，与腺 病毒骨架质粒pAdEasy-Ι (购自Promega公司)共转化E.coli BJ5183感受态细胞(武 汉大学中国典型培养物保藏中心)，kana抗性挑取阳性菌落，将所得的重组质粒转化 ExoliDHlOB (武汉大学中国典型培养物保藏中心)，获得腺病毒pAd/OPGIFGF。PacI酶切重组腺病毒pAd/OPGIFGF，完全消化以去除Ori和Kana抗性基因等 质粒构建，并暴露其反转重复序列(ITR)，用无水乙醇回收纯化。培养293细胞，待细 胞丰度约90%时，将上述Pac I消化获得的重组腺病毒DNA用Lipofectamine 2000 (购自 Invitrogen公司)转染，获得双顺反子非复制型重组腺病毒rAd_OPGIFGF。酶切鉴定图 谱见图7:泳道一为DL15000Marker ；泳道为BamH I酶切；泳道三为EcoR I酶切；泳道 四为Pac I ；泳道五为λ -DNA EcoR I和Hind III双切Marker。结果表明，同源重组发生 在两者的ori与右臂同源序列之间。实施例二重组腺病毒rAd-OPGIFGF的鉴定1、RT-PCR分析重组腺病毒rAd-OPGIFGF目的基因的转录接种非复制型重组腺病毒rAd-OPGIFGF于细胞丰度达到90% 95%的Vero细 胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心)，三、四天后，常规提取感染细胞的总RNA。取上述RNA为模板，目的基因的下游引物OPG的下游引物(end) ； FGF-2的 下游引物(end)混勻，于70°C变性5分钟，迅速冷至4°C 5分钟，加入逆转录酶等，于 250C 5 分钟，42°C 60 分钟，70°C 15 分钟，获得 cDNA。取上述cDNA为模板，目的基因上、下游引物OPG的上游引物(Beg)，下游 引物(end) ； FGF-2的上游引物(Beg)，下游引物(end)分别为引物，充分混勻。反应条 件为95 °C 3分钟；三步循环94°C 1分钟、55 °C 1分钟、72 °C 2分钟，共30个循环；72 °C 延伸10分。取PCR产物上样电泳，观察OPG和FGF-2的转录结果，并用细胞总RNA 样品为模板进行PCR作为阴性对照。结果见图8 泳道一为总RNA模板阴性对照；泳 道二为DL 2000Marker ；泳道三为重组病毒感染Vero细胞的RT-PCR产物。从图中泳道 三可看出，得到了 1206bp，465bp的两条片段，而以总RNA为模板的PCR结果无相应条 带，说明两种基因可有效转录。2、Western blot检测两种目的蛋白的表达接种非复制型重组腺病毒rAd-OPGIFGF于细胞丰度达到90% 95%的Vero细 胞，三至四天后，收获感染的细胞于IOml离心管中，3000rpm离心5分钟。加3ml 4°C 预冷的PBS洗三次，细胞沉淀按Iml细胞裂解液加10 μ 1 PMSF (IOOmM)混勻，冰上裂解 30分钟，期间为使细胞充分裂解经常摇动，于4°C 12000rpm离心30分钟，取上清加蛋白 上样缓冲液煮沸5分钟，取ΙΟμΙ行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，加入一抗兔抗OPG抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗FGF-2(SC_79)(购自武汉博士德生物工 程有限公司)孵育2h，用TBST洗涤3次，每次10分钟；HRP标记的羊抗兔二抗(购自 Santa-craz生物公司)孵育lh，TBST洗涤3次，每次10分钟，再用TBS洗10分钟；在 暗室中按每平方厘米0.125ml的用量标准及膜的大小，等体积混合用于ECL检测的鲁米诺 试剂(购自Prerce公司)和氧化剂(购自Prerce公司)，可见到膜上出现绿色荧光条带。 曝光适当时间，经显影定影处理后晾干保存，见图9。图9A为抗人OPG，图9B为抗人 FGF-2，两图中泳道1均为重组病毒感染Vero细胞，泳道二为正常Vero细胞。说明有 OPG和FGF-2大小片段的蛋白条带表达。实施例三重组腺病毒rAd-OPGIFGF的动物 药效学试验分组选用周龄10-11岁的家犬10只(安徽省动物实验中心)，取每只犬下颂 两侧的第1、2前磨牙为实验牙，共40颗。实验组与对照组的选择遵从随机原则，每组 10颗牙。1月3月后处死实验犬，取实验牙部位的下颂骨。A组将胶原膜置于骨质缺损处，缝合固定，冠方平齐龈缘，轻压组织瓣，使 其与骨面贴合，然后轻压龈瓣的冠方，静置8min，缝合龈瓣，术后两天实验牙部位局部 牙龈注射重组病毒载体IO5VP。B组置入原膜，缝合龈瓣。C组翻瓣去骨后缝合并于实验牙部位局部注射重组腺病毒。 D组翻瓣去骨后缝合制备根分叉区牙周组织缺损以速眠新846合剂(0.1-0.15ml/kg)肌肉注射麻醉 实验犬、固定、消毒、铺巾后以手术牙为中心，前后延长1-2个牙位，切开牙龈乳头， 翻开龈瓣，充分显露手术牙的牙槽骨。用高速裂钻磨除手术牙颊侧根分叉部位的牙槽 骨，暴露根分叉区，再水平向舌侧磨去根分叉区内的牙槽骨4mm，垂直向磨去根分叉区 牙槽骨约5mm，制备根分叉区人工牙周组织缺损，用细裂钻在缺损区根面上作平齐于牙 槽骨嵴的切迹，作为组织学观察的标志点。在去骨过程中用无菌生理盐水冲洗并冷却去 骨区。刮除切迹以上暴露根面的牙周膜和牙骨质，并做根面平整。清理、冲洗去骨区。试验结果通过附图可以看出，注射了重组病毒载体，覆盖胶原膜，缝合龈瓣 的A组与没有注射重组病毒载体，覆盖胶原膜，缝合龈瓣的B组比较，注射了重组病毒 载体，缝合龈瓣的C组与没有注射重组病毒载体，缝合龈瓣的D组比较一月观察发现 在骨高度和丰满度上A组略高于B组，C组略高于D组；骨密度没有差别；三个月观察 发现在骨高度和丰满度上A组明显高于B组，C组明显高于D组；在骨密度上，也是A 组高于B组，C组高于D组。说明注射重组病毒载体对于造牙周缺损的牙的骨高度、丰 满度和骨密度具有促进作用，即具有促进牙周组织生长的作用。上述相关试剂配方PBS 称取 8gNaCl、0.2g KC1、1.44g Na2HP04 和 0.24g KH2P04，溶于 800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至IL即可。TBS Tris-HCI 缓冲液(0.5M pH7.6) 100ml，NaCI 8.5_9g (0.15mol/L)，双蒸水 加至1000mlTBS配制方法先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双 蒸水至1000ml，充分摇勻
TBST 20 % Tween201.65mL TBS 700mL 混匀即可，现用现配。细胞裂解液的配置方法见《分子克隆实验指南》第三版萨姆布鲁克。蛋白上样缓冲液的配置方法见《分子克隆实验指南》第三版萨姆布鲁克。
权利要求
1.一种重组病毒载体，其特征在于该重组病毒载体包括一个病毒载体和至少两条 核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因子，该重组病毒载体能 促进牙周组织生长。
2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于所述病毒载体是腺病毒载 体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒 载体。
3.根据权利要求2所述的重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是缺失性腺 病毒载体。
4.根据权利要求3所述的重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是人腺病毒 载体或动物腺病毒载体。
5.根据权利要求4所述的重组病毒载体，其特征在于所述人腺病毒载体是人5型、 35型、2型或6型腺病毒载体。
6.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于所述编码骨保护素的核苷酸 序列如SEQ ID NO 1所示。
7.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于所述编码成纤维生长因子的 核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
8.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于所述两个核苷酸序列通过内 部核糖体进入位点序列连接，从启动子双顺反子表达。
9.根据权利要求8所述的重组病毒载体，其特征在于所述内部核糖体进入位点序 列如SEQ ID NO: 3所示。
10.权利要求1-9中任一项所述的重组病毒载体在制备用于治疗牙周病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组病毒载体及其应用，该重组病毒载体包括一个病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因子，该重组病毒载体能促进牙周组织生长，可用于制备作为治疗牙周病的药物。
文档编号C12N15/86GK102021200SQ20101029136
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月16日 优先权日2009年9月17日
发明者何金生, 张梅, 曹寅 申请人:常州市口腔医院, 曹寅