专利名称：一种湿地嗜油假单胞菌株的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种湿地嗜油假单胞菌株的基因及其应用。
背景技术：
在油污染环境中存在着一定数量的微生物，这些微生物对受油污染环境有较好的 适应能力。经过研究发现，这些微生物并非都可以应用于含高浓度石油烃废水、污泥的处 理，只有对其经过严格的筛选和驯化后得到的嗜油菌株才有此作用。故嗜油微生物的首选 取样点就是所要处理的污染环境中，初筛选出的嗜油微生物经过驯化后，即可作为嗜油微 生物菌株应用到油污染废水与污泥的处理实践中。湿地环境与土壤环境的风化过程、温度、 可利用的氧浓度、可利用的营养基质浓度、PH以及盐度等环境因素的特点有所不同，因此探 索适合于湿地环境的微生物修复技术就变得非常重要。从黄浦江-长江口岸边湿地油污土 壤中筛选出嗜油微生物，结合这些微生物的最宜生长条件与特性，将其应用于柴油的降解 并研究其降解特性。微生物的分类方法常用的有经典分类方法和分子生物学方法。经典分类方法主要 指依据形态特征、培养特征及生理生化特征等分类方法。分子生物学分类法，又称分子分类 方法，是指在分子水平上对生物个体的核酸及蛋白质进行研究，并据此对生物个体进行分 类的方法。由于16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分类方法采用。目前， 16S rDNA序列分析的方法主要有两种一种是16S rDNA提纯后用反转录酶和保守引物进 行测序，另一种是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，然后将PCR产物回收后直接测序。更 进一步的可靠方法是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，将该序列做成感受态细胞，质粒 扩增，然后对质粒进行测序。这是一种研究rDNA同源性最直接可靠的方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种湿地嗜油假单胞菌株的基因。本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供该基因在降解高浓度柴油污水中的应用。—种湿地嗜油假单胞菌株的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；2)与SEQ ID NO 1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生物学 功能蛋白质的DNA序列。一种上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有 下列氨基酸序列之一1)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2)通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO :2的蛋白具有相 同的生物学功能。
一种重组载体，其特征在于该重组载体含有上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基 因。一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有上述的重组载体。上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因在降解高浓度柴油污水中的应用。一种克隆上述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因的方法，其特征在于该方法的具 体步骤为i.湿地产碱杆菌；ii.对提取出的16S rDNA基因进行PCR扩增，扩增条件为98°C预变性5min，95°C 变性35s，55°C退火35s，72°C延伸Imin 30s，35个循环，72°C延伸8min，扩增的引物是=Pl 正向引物为5 ’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 ’，P2 反向引物为5，GGTTACCTTGTTACGACTT 3，19bp ；iii. PCR产物的回收；iv.对回收产物的片断TA克隆；v.质粒提取，得到16S rDNA全序列。采用BLAST分析法，将假单胞菌M3的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该 菌株与假单胞菌有很高的同源性。将其应用于柴油污水的处理中，考察其对油污的降解率 特征。油污降解率计算公式如下菌株对油污降解率=(空白含油率-接菌含油率)/空白含油率X 100%菌株在一周内对柴油的去除率为54. 74%，降解率为15. 89%。经气相色谱测定各 组分特征，可见其对于C15 C26间的正构烷烃均具有较好的降解效果。表明本发明的湿地 嗜油假单胞菌株的基因对柴油污染具有较好的降解效果。
图1菌株M3的生长曲线图2菌株M3的适宜生长温度图3菌株M3的适宜生长pH值图4菌株M3的适宜生长盐度图5菌株M3降解柴油各组分特征
具体实施例方式一、嗜油菌的基因全序列测定采用BLAST分析法，将嗜油菌M3的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌 株与假单胞菌有很高的同源性。由此可以从分子水平确定该菌株是假单胞菌。同明，结合 经典分类方法所获得的形态及生理生化特征，最终确定该菌株是假单胞菌O^eudomonas)。本发明采用了从一种黄浦江油污湿地筛选的湿地嗜油假单胞菌株的菌落中提取 该细菌的核16S rDNA基因，将该16S rDNA基因PCR扩增、PCR产物的回收，将DNA片断进 行TA克隆，制备感受态细胞，提取质粒进行16S rDNA的全序列测定和分析，来获取菌株M3 的16S rDNA基因全序列。上述步骤具体如下
1)采用生工SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒从黄浦江油污湿地 筛选的湿地嗜油假单胞菌株的菌落中提取该细菌的核16S rDNA基因。2)在16S rDNA基因的PCR扩增过程中，采用了如下的扩增条件和扩增的引物PCR 扩增条件为98°C预变性 5min，95°C变性 35s，55°C退火 35s，72°C延伸 Imin 30s, 35 个循环，72°C延伸 8min,PCR扩增的引物是:P1正向引物为5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，20bp, P2反向引物为5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3， 19bp,
3) PCR产物的回收采用SK1131-UNIQ-10DNA胶回收试剂盒纯化回收DNA片断。
4)采用SK2211-T-载体PCR产物克隆试剂盒目的片断TA克隆。
①连接反应
1 μ 110 X Ligation Buffer
1 μ 150% PEG
50ngpUCm-T Vector
0. 2pmolPCR Product
χ μ 1H2O
2. 5UT4DNA Ligase
FinalVolume 10 μ 1
注意一般最后加入T4 DNA Ligase，16 23°C连接1 2小时。
②连接产物转化
使用生工SSCS快速一步法试剂制备感受态细胞，产品编号SK2301。转化步骤如
下将100 μ 1感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均勻悬浮；加入10 μ 1连接 液，轻轻混勻。冰上放置30分钟；42 °C水浴热激90秒。冰上放置15 20分钟；加400 μ 1 SOC培养基，370C 200 250rpm振荡培养1小时；室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉 400 μ 1上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20 μ 1 IOOmM IPTG和 100 μ 1 20mg/ml X_gal涂布的氨苄青霉素平板上；平板在37°C下正向放置1小时以吸收过 多的液体，然后倒置培养过夜。③蓝白斑筛选当外源DNA片段插入到pUCm-T中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了 LacZ基 因的编码，从而影响了其产物β -半乳糖苷酶α -片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG 平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用 牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37 °C培养过夜。5)质粒提取使用生工质粒提取试剂盒SK1191的UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取DNA。6)在Applied Biosystem 3730测序仪上测序，然后用BLAST软件，将测得的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较分析，最终确定其为假单胞菌的基因全序列。二、嗜油菌株筛选方法及其应用(一 )材料与方法1、菌源和菌采集环境(1)菌源黄浦江-长江口湿地(Ν3Γ 23，5.4”Ε12Γ 30，28.3")受石油类污染沉积物； (2)沉积物基本理化性质见表1所列。表1黄浦江-长江口湿地沉积物性质分析
权利要求
1.一种湿地嗜油假单胞菌株的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQID NO 1所示的碱基序列；2)与SEQID NO :1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生物学功能 蛋白质的DNA序列。
2.一种根据权利要求所述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因编码的蛋白，其特征在于 该蛋白具有下列氨基酸序列之一1)具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列；2)通过将SEQID NO :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO :2的蛋白具有相同的 生物学功能。
3.—种重组载体，其特征在于该重组载体含有权利要求1所述的一种湿地嗜油假单胞 菌株的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因在降解高浓度柴油污水中的应用。
6.一种克隆根据权利要求1所述的一种湿地嗜油假单胞菌株的基因的方法，其特征在 于该方法的具体步骤为a.从油污湿地筛选的湿地嗜油假单胞菌株的菌落中提取该细菌的核16SrDNA基因；b.对提取出的16SrDNA基因进行PCR扩增，扩增条件为98°C预变性5min，95°C变性 35s，55°C退火35s，72°C延伸Imin 30s，35个循环，72°C延伸8min，扩增的引物是Pl 正向引物为5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3，， P2 反向引物为5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3，19bp ；c.PCR产物的回收；d.对回收产物的片断TA克隆；e.质粒提取，得到16SrDNA全序列。
全文摘要
本发明涉及一种湿地嗜油假单胞菌株的基因及其应用。本发明分离、筛选出的嗜油菌的基因表明其为假单胞菌，具有较好降解高浓度柴油污水的功能。这就拓宽了人们对假单胞菌属在其功能方面应用研究思路，并为降解高浓度柴油污水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。可再进一步研究其应用于石油类污染的处理中。
文档编号C12N15/10GK102086458SQ20101029092
公开日2011年6月8日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者刘婷婷, 刘晓艳, 张新颖, 王君, 王珍珍, 苏鹏程, 钟成林, 陈艳, 顾蓓莉 申请人:上海大学