针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明的目的是提供一种例如免疫原性组合物或疫苗形式的组合物，用于保护诸 如It形目（Siluriformes)、f卢形目（Perciformes)和趣形目（Cypriniformes)的鱼免受嗜 水气单胞菌（Aeromonashydrophila)的感染。更具体地，发明人惊讶地发现嗜水气单胞菌 的两种不同的生物型，生物型A和B能够在诸如鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼中造成毒性。 另外，发明人惊讶地发现将免疫原性含量的两种高毒性嗜水气单胞菌菌株（一种属于生物 型A，一种属于生物型B)例如在免疫原性组合物或疫苗中组合，所述组合惊讶地证实能为 诸如鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼提供对嗜水气单胞菌造成的感染的有效的预防性保护。
【背景技术】
[0002] 在SantosY.etal. 1987中，通过分析分离自鱼养殖系统的几种不同的气单胞菌 属（Aeromonas)菌株的生化、酶及细胞表面性能，研究某些气单胞菌种（包括嗜水气单胞 菌）的表型特征与在虹鳟鱼（Salmogairdneri)中的毒性之间的关系。然而，其并未公开 或教导本发明特定的病原性嗜水气单胞菌生物型A和B，或基于所述生物型的任意鱼疫苗。
[0003] 在EsteveC.etal. 1993中，通过腹膜内和水性暴露于某些嗜水气单胞菌菌株，对 欧洲鳗麵进行攻击。基于攻击实验，作者得出结论，嗜水气单胞菌作为欧洲鳗麵的原发性病 原体。然而，其并未公开或教导本发明特定的病原性嗜水气单胞菌生物型A和B，或基于所 述生物型的任意鱼疫苗。
[0004] 在Phanetal. 2009中，在越南的湄公河三角洲研究了条纹鲶鱼（Pangasianodon hypophthalamus)密集水产养殖的各个方面。据报道密集渔业养殖的后果是在生产周期的 早期至月中期间，死亡率高达30%。作者还报道了鲶鱼养殖的健康管理主要涉及化学处理， 经常用抗生素并使用饲料添加剂（维生素C)。然而，其并未公开或教导本发明的特定病原 性嗜水气单胞菌生物型A和B，或基于所述生物型的任意鱼疫苗。
[0005] 在M.E.Martinoetal. 2011中，公开了其试图本领域中建立气单胞菌属和发病机 制之间明确的联系，其因例如气单胞菌高度复杂的分类学而极为复杂。文章还公开了仅含 有潜在毒性因子基因的一小亚类菌株似乎造成感染。还公开了本领域中其试图准确区分气 单胞菌种类。还设想经分析的气单胞菌菌株之间的微生物多样性（例如系统发生和分类学 的相互关系）能基于多位点序列分型（MLST)和表型特征确定。测试的气单胞菌菌株特别 是收集自例如虹鳟鱼、海鲤和鲤鱼的皮肤和肾的嗜水气单胞菌。基于所述方法，作者能够建 立经分析的气单胞菌菌株和表型之间的分类学关系，并基本表明了，嗜水气单胞菌符合相 同的表型群，描述为嗜水气单胞菌复合物。然而，其并未公开本发明的特定病原性嗜水气单 胞菌生物型A和B，或基于所述生物型的任意鱼疫苗。
[0006] 在PridgeonJ.W?和KlesiusP.H.，2011中，公开了基于毒性和抗生素抗性的嗜 水气单胞菌的"2009年西阿拉巴马分离物"的减毒疫苗，其用于沟鲶（Ictaluruspuncatus) 和尼罗罗非鱼（Orechromisniloticus)。文章还公开了众所周知嗜水气单胞菌是生化和血 清型非常异质的，这被认为是开发针对嗜水气单胞菌的有效的商业化疫苗的最大障碍。另 外，文章公开了抗生素抗性的嗜水气单胞菌是减毒的，因此被认为适用于鱼疫苗。腹膜内注 射和浸浴均作为疫苗施用的可能途径公开。然而，其并未公开包括两种或更多种特定生物 型的嗜水气单胞菌的联合疫苗。
[0007]在ZhengW.et.al, 2012 中，研究了草鱼（Ctenopharyngodonidellus)中嗜水气 单胞菌的四种不同毒性和抗生素抗性菌株的细菌感染。根据该文章，使用ATB32GN系统、系 统发生分析、肠道菌重复性基因一致性序列-聚合酶链式反应（ERIC-PCR)将所述四种菌株 鉴定为不同的嗜水气单胞菌分离物。文章还公开了嗜水气单胞菌的多重感染可能是草鱼养 殖中新兴的威胁。然而，尽管大体涉及草鱼和现代渔业中多种嗜水气单胞菌菌株的感染，该 文章并未公开或教导适用于预防性治疗所述感染的基于嗜水气单胞菌的组合鱼疫苗。事 实上，该文章设想嗜水气单胞菌多重感染的治疗可以通过使用常用渔业药物例如诺氟沙星 (诺氟沙星是广谱抗生素，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有活性）来进行。
[0008] 中国专利申请CN101642567公开了一种基于非限定的嗜水气单胞菌病原菌株的 灭活鱼疫苗，以及所述疫苗的制备，其用于预防和治疗鲤鱼中的细菌性败血症。该疫苗通过 该方法限定，其中病原性（但未限定）嗜水气单胞菌菌株提取自感染的鲤鱼并随后用于制 备用在疫苗中的细菌悬液。然而，其并未公开或教导本发明的特定病原性嗜水气单胞菌生 物型A和B，或基于所述生物型组合的任意鱼疫苗。
[0009] 现有技术-整体考虑
[0010] 嗜水气单胞菌是一种广泛分布于水生环境的革兰氏阴性能动的芽孢杆菌，通常被 认为是二级病原体，但也能是气单胞菌属败血症的致病物。受影响的鱼种类有罗非鱼、鲶 鱼、金鱼、普通鲤鱼和鳗鱼（Priodegonetal2009)。近年来，一些嗜水气单胞菌菌株也被 鉴定为对鲤鱼（Zhengetal2012)和鲶鱼（Priodegonetal2009)高毒性的。
[0011] 在越南的巨鲶（pangasius)养殖中，鲶鱼爱德华氏菌（Edwardsiellaictaluri) 已是主要死因，根据Phanetal. (2009)，越南南部湄公河三角洲98%的养殖受到影响。 Phametal.还提到61%的养殖受到红斑影响。红斑病群体中的死亡率最有可能是由嗜水 气单胞菌造成的。最近在越南鉴定为出血、造成红斑的疾病（由嗜水气单胞菌造成）已经 增加，给渔民造成严重的经济损失。
[0012] 嗜水气单胞菌在自然界普遍存在，并且甚至发现于鱼肠道。在自然环境中，野生鱼 中的嗜水气单胞菌感染通常不会造成严重问题。然而，对于密集的渔业养殖系统，不论这些 系统是室外敞池还是室内养鱼池或水槽，必需考虑其他因素。该疾病的普遍发生与鱼的应 力状态或类似因素有关。水产养殖领域普遍认同鱼在被错误地对待、过度拥挤、恶劣条件下 运输、营养水平较差、水质较差等时易于受到压力。这是本领域周知的。
[0013] 在所有形式的密集水产养殖中，其中如果一种或多种以高密度饲养，则感染性病 原易于在个体之间传播。由于水中病原体传播的有效性及用于商业化大规模渔业养殖的高 密度动物，病原体在养殖鱼群体中快速传播。
[0014] 本领域周知感染嗜水气单胞菌的鱼具有许多不同的症状，从健康鱼的猝死到食欲 不振、游动异常、鳃苍白、外观臃肿、皮肤溃疡和突眼症。皮肤溃疡可发生在鱼的任意部位， 并且经常被红色组织的亮边围绕。通常受该疾病影响的其他器官包括鳃、肾、肝、脾、胰腺和 骨骼肌。症状有变化，因为它们基于各种因素，尤其是与包括生物毒性的细菌群体的多样性 相关的因素，以及和鱼相关的因素，如鱼对感染的抗性，菌血症或败血症的存在或缺失，以 及环境因素。实际上，嗜水气单胞菌的临床爆发对渔民是潜在的经济灾难。
[0015] 因此，传统上，养殖鱼中的传染病已通过使用抗生素得到防止。然而，抗生素的使 用涉及多种潜在问题。
[0016]在针对问题疾病使用相同抗微生物剂的密集、反复药物处理后，一段时间后经常 观察到效力降低。作为抗性出现的结果，必需重复治疗或使用新药剂。然而，抗生素抗性并 不仅是鱼健康的问题。沉积物和水中的其他细菌能产生抗性，由此在水生环境中传播至其 他生物。人们受到的抗性细菌的总体负担在增加，并且会产生新的人类健康问题。
[0017] 更具体地，迄今为止，对鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼的抗嗜水气单胞菌感染的治疗 限于两种抗生素，土霉素和增强的磺胺类药物。如上所述，与任意抗生素治疗相关的潜在问 题包括剂量水平不足、药量过多、细菌的抗药性和在土霉素用于浸泡和浸浴的情况下钙螯 合至硬水。
[0018] 因此期望减少或优选消除鱼养殖业中的抗生素使用。在这一点上，特别期望在地 理区域例如东南亚关注该问题，在那里疫苗开发和通常的预防保健工作并不到位，并且仍 持续在使用大量的抗生素。
[0019]现有技术-整体考虑_鱼疫苗
[0020] 20世纪70年代已证实基于福尔马林灭活的肉汤培养物的鱼浸没式疫苗能有效防 止某些细菌性鱼感染。这些疫苗的效力随即导致抗生素使用的下降。然而，浸没式疫苗证 实具有对某些其他鱼病原体并不令人满意的效果。事实上，在20世纪90年代早期，开发了 含有佐剂通常是油佐剂的注射疫苗。
[0021] 具有良好卫生和有限压力的适当的鱼管理是传染病预防中的主要因素，并且也是 疫苗最佳效果所必需的。理想地，疫苗产生针对多种传染病的长期保护，能简便地施用，能 安全地用于鱼和管理者，并且有利可图。另外，与抗生素相比，疫苗是环境友好的。
[0022] 在本领域中已知有几种不同类型的鱼疫苗，包括灭活的、活的、重组的和DNA疫 苗。总体上有三种主要的疫苗应用模式：口服、浸没和注射。口服疫苗通常引发短期保护， 浸没式疫苗产生更好的保护，而注射疫苗产生最好且最持久的保护且最划算。
[0023]然而，疫苗接种如今是大多数现代渔业的组成部分，而且抗生素的使用在过去 二十年已大为减少，尤其是在北欧和北美。然而，在南美和东南亚的大部分地区，商业化养 鱼场中仍在大量使用抗生素，由此造成上述副作用，例如抗性。因此，期望开发针对由例如 养鱼场（例如在东南亚）中的抗生素抗性细菌造成的传染病的特异性和有效的疫苗。
[0024] 发明概述
[0025] 本发明涉及嗜水气单胞菌生物型A和B细菌，其有代表性的分离物根据" 1977年 4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约"进行保藏。本发 明另外涉及所述生物型的基因型、表型和血清型特征。在另一方面，本发明涉及免疫原性组 合物，例如疫苗，其包含免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌生物型A和/或B细菌，涉及所 述细菌在医学中的用途，以及制备该组合物的方法。
【附图说明】
[0026] 图1示出24种气单胞菌菌株的最大似然系统发生树，使用gltA和metG中所用的 遗传信息。仅显示自展值（bootstrapvalue)高于50的情况。两个保守的系统发生群标 记为A和B。对所有参照菌株显示序列类型（ST)。
[0027] 图2示出巨鲶的累积死亡率％ (y轴）并相对于时间（x轴）曲线化。巨鲶经腹膜 内注射生物型A、生物型B或其他嗜水气单胞菌菌株（PQ100155)。持续监测死亡率。
[0028] 本发明后续将更详细描述。
[0029] 发明描述
[0030] 生物型A
[0031] 发明人发现在鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼中的攻击研究中，基于生物型A嗜水气 单胞菌的免疫组合物完全防护生物型A，并提供令人满意的针对生物型A的抗体应答。
[0032]因此，作为第一个主要方面，本发明涉及分离的嗜水气单胞菌生物型A细菌，所述 菌株选自以下组：
[0033] (i)根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心 (HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire, SP40JG，UK)的保藏号为12082901的细菌；
[0034] (ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
[0035] 发明人还能够确立上述生物型A菌株的基因型和表型特征。因此，本发明还涉及 具有基因型和/或表型特征的分离细菌，所述特征与以上限定的保藏的生物型A细菌的特 征相关。
[0036] 另外，已经证实以上限定的生物型A细菌能够在感染鱼中诱导特定的临床 症状。因此，本发明还涉及细菌，其中表型特征包括当在重10 - 2 0g的鱼中经腹膜内 注射100-2000cfu/鱼的量以及0.Iml的注射体积时，在巨鲶（pangasius)(巴丁鱼 (Pangasianodonhypophthalmus))中诱导败血病，并且任选地，诱导死亡的临床症状的能 力。
[0037] 因此，在其他实施方案中，本发明还涉及以上限定的生物型A的细菌，其中所述表 型特征包括在重10_20g的鱼中经腹膜内注射100-2000cfu/鱼的量以及0.Iml注射体积的 所述细菌后的2-5天内，在巨鲶（巴丁鱼）中诱导败血病，并且任选地，诱导至少50%死亡 的临床症状的能力。
[0038] 以上限定的生物型A细菌在巨鲶中诱导死亡的能力可以是造成至少50%、至少 60 %、至少70 %、至少80 %、或例如至少90 %或100 %死亡的能力。在具体实施方案中，诱 导死亡的能力在细菌分离自临床爆发后不久，即长期储藏之前确定。
[0039] 特别地，根据以上实施方案的鱼可以具有例如10_20g、12-19g、14-19g、16-19g、 17-18g或18g的重量。另外，以上实施方案可应用于初始重量为5g的鱼，并且可在生产周 期中进一步应用。
[0040] 另外，在以上实施方案中的注射细菌量可以是100_2000cfu/鱼、200-1500cfu/ 鱼、300-1000cfu/ 鱼、400-800cfu/ 鱼、500-700cfu/ 鱼或低于 500cfu/ 鱼。
[0041] 发明人还证实，根据本发明的具体实施方案，以上限定的用于本发明的感兴趣的 细菌可以与保藏的生物型A菌株的两种特定的经测序基因具有一定水平的相同性。因此， 在本发明的另一个方面，以上限定的生物型A细菌显示出以下基因型特征：其具有甲硫氨 酰-tRNA合成酶（metG)基因，该基因包含与SEQIDNO: 1所示序列至少99%相同的序列， 和/或柠檬酸合酶（gltA)基因，该基因包含与SEQIDN0:2所示序列至少99%相同的序 列。
[0042] 特别地，以上限定的生物型A细菌显示与SEQIDNO: 1所示序列99. 1% -99. 2%、 99. 2%-99. 3%,99.3%-99. 4%,99.4%-99. 5 %^99, 5%-99. 6 %^99, 6 % -99. 7 %^ 99. 7% -99. 8%、99. 8% -99. 9%、99. 9% -100%的相同性。
[0043] 另外，以上限定的生物型A细菌显示与SEQIDNO:2所示序列99. 1 %-99. 2%、 99. 2 % -99. 3 %^99, 3%-99. 4 %^99, 4%-99. 5 %^99, 5%-99. 6 %^99, 6 % -99. 7 %^ 99. 7% -99. 8%、99. 8% -99. 9%、99. 9% -100%的相同性。
[0044] 如上所述，发明人另外确立了以上限定的用于本发明的感兴趣的生物型A细菌的 血清型特征。因此，在其他方面，本发明涉及以上限定的细菌，其特征在于其与来自用以上 鉴定的保藏的生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力，由本文所述的直接凝集试验或 玻片凝集试验确定。
[0045] 在具体实施方案中，使用直接凝集试验：来自所述鱼的血清可以系列稀释添加在 适合的容器中，例如微量滴定板中的孔，并且等体积的细菌添加至每个容器或孔。细菌可以 通过将单菌落转移至TSB(胰蛋白酶大豆肉汤），随后在28°C孵育12小时制备。容器在适 合的温度例如4°C孵育并在例如8小时和24小时后记录结果。当细菌凝集形成肉眼易于观 察的结构时为阳性结果。当溶液保持浑浊且不形成聚集时为阴性结果。观察到凝集时的最 高血清稀释记录为结果。
[0046] 可选地，细菌与来自用保藏的细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力可使用本文所述 的玻片凝集试验确定。玻片凝集试验可通过将一滴无菌盐水置于洁净的玻片上进行。然后 将单细菌菌落与水混合。添加一滴鱼血清，30秒后记录结果。当细菌凝集形成肉眼易于观 察的结构时为阳性结果。当溶液保持浑浊且不形成聚集时为阴性结果。
[0047] 在任一测试中，血清优选以1:2的稀释使用，例如1:4、1:8、1 :16、1:32、1:64、 1:128、1:256、1:512、1:1024 或例如 1