一种嗜水气单胞菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌氟喹诺酮类药物耐 药基因检测方法。
【背景技术】
[0002] 1979年合成第三代喹诺酮药诺氟沙星。它是4-Quinolone结构改造衍生物，在6 位上加上一个氟（F)后，增加了脂溶性，增强了对组织细胞的穿透力，因而吸收好，组织浓 度高，半衰期长，更大大增加了抗菌谱和杀菌效果。氟喹诺酮类对G-杆菌，包括绿脓杆菌均 有良好抗菌作用，对G+球菌也具一定抗菌活性，尤其对耐药G-杆菌，仍可呈现敏感。在氟 喹诺酮类较广泛使用的品种中，对绿脓杆菌作用较强的为环丙氟哌酸，其次为氟嗪酸。氟嗪 酸对一般阴性杆菌的作用与环丙氟哌酸相仿或稍弱，90年代后开发的新品种多氟哌酸类某 些品种，不仅抗G-杆菌活性与环丙氟哌酸相似，而且抗G+球菌作用加强，对MRSA有效，对 衣原体、支原体、厌氧菌亦有一定作用，明显优于环丙沙星。
[0003] 国内外的大量研宄表明，由于氟喹诺酮药物长期和大量使用，嗜水气单胞 菌对氟喹诺酮类药物的耐药性十分严重。常见的氟喹诺酮耐药基因已经发现的有： GyrA，GyrB，ParC，ParE等。耐药性产生的直接后果是严重影响了临床疗效，尤其在人畜同药 的情况下，耐药性通过水产产品等途径引起的交叉传播，直接对人体健康构成威胁。
[0004] 目前我国水产产品耐药性检测控制中，传统方法是通过测定嗜水气单胞菌的最低 抑菌浓度或抑菌圈大小测定嗜水气单胞菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的嗜水 气单胞菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于临床上及时 的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验嗜水气单胞菌的表型耐药特性， 不能检测嗜水气单胞菌的隐型耐药性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种嗜水气单胞菌氟喹诺酮类药物耐 药基因检测方法。
[0006] 本发明的具体技术方案如下：
[0007] 一种嗜水气单胞菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，包括如下步骤：
[0008] (1)收集嗜水气单胞菌活菌体0. 5~0. 7g，用5~7mL去离子水重悬，反复冻融破 碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；
[0009] (2)将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、 GyrB-R、ParC-F和ParC-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯 水、PCR 缓冲液、终浓度均为 0. 25 ~0. 35mmol/L 的 dNTPs (dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP)、终浓 度为0. 5~0. Bmmol /T,的GyrA-F、终浓度为0. 5~0. Bmmol /T,的GyrA-R、终浓度为0. 8~ 0. 9mmol/L 的 GyrB-F、终浓度为 0. 8 ~0. 9mmol/L 的 GyrB-R、终浓度为 0. 4 ~0. 5mmol/L 的 ParC-F、终浓度为 0· 4 ~0· 5mmol/L 的 ParC-R 和终浓度为 0· 01 ~0· 02U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParC-F 和 ParC-R 分别如 SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6,上述PCR缓冲液的10倍母液中包括30~ 35禮氯化钾、？!18.3的1011111'1^8-!1(：1和0.01~0.02%硫酸钠，25~3011111%(：1 2;
[0010] (3)步骤（2)的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。
[0011] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1)为：收集嗜水气单胞菌活菌体 0. 5~0. 6g，用5~6mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~ 15min后收集上清液，得到模板。
[0012] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓 冲液、终浓度均为0. 3mmol/L的dNTPs、终浓度为0. 5mmol/L的GyrA-F、终浓度为0. 5mmol/ L的GyrA-R、终浓度为0· 8mmol/L的GyrB-F、终浓度为0· 8mmol/L的GyrB-R、终浓度为 0. 4mmol/L 的 ParC-F、终浓度为 0. 4mmol/L 的 ParC-R 和终浓度为 0.0 lU/uL 的 TaqDNA 聚合 酶。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR缓冲液的10倍母液中包括30mM氯化 钾邛!18.3的1〇11111'1^8-!1(：1和0.01%硫酸钠，2511111%(：1 2。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应条件如下：94~95°C预变 性10~12min，然后进入如下循环：94~95°C变性50s~lmin、54~55°C退火45~50s、 72~74°C延伸50s~lmin，共30~35个循环，循环结束后于72°C延伸7~8min，2~4°C 保存。
[0015] 进一步优选的，所述PCR扩增的反应条件如下：94°C预变性lOmin，然后进入如下 循环：94°C变性lmin、54°C退火50s、72°C延伸lmin，共30个循环，循环结束后于72°C延伸 8min，4°C 保存。
[0016] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（3)的电泳条件为：2%琼脂糖凝胶， 80V电压，时间40min。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 1、本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因进行检测，而 不需要经过费时的嗜水气单胞菌培养阶段；
[0019] 2、本发明的检测方法在同一反应体系中加入多对引物对多个氟喹诺酮耐药基因 同时进行扩增，在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量；可同时扩增几 个目的基因：消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率；可大量地进行样品和目的基 因的检测；
[0020] 3本发明的检测方法可指示许多耐药菌中的某一个，或区分同意属中的种或株。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1的电泳检测结果图。
【具体实施方式】
[0022] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0023] 实施例1
[0024] (I) LB培养基摇瓶培养增殖嗜水气单胞菌，摇瓶培养条件为30°C，18h，120rpm，摇 瓶培养结束后离心收集嗜水气单胞菌活菌体0. 5g，用5mL去离子水重悬，反复冻融5次破碎 细胞，10000pm离心10min后收集上清液，得到模板；
[0025] (2)将该5uL模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物GyrA-