专利名称：降解高浓度甲苯的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种能够降解高浓度甲苯，并利用甲苯作为唯一碳源和能源生长的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用。
背景技术：
甲苯是一种重要的有机溶剂和应用广泛的基础化工原料，工业上被大量生产和使用。由于泄漏和处置不当，甲苯成为许多工业点源广泛排放的重要污染物，并成为空气、水体等环境中存在的主要污染物之一。甲苯具有挥发性，但甲苯很难从水环境中完全除去，并可能长时间存在。甲苯具有很强的毒性，暴露于一定浓度的甲苯会对人体健康产生严重的影响，甲苯的主要毒害作用是对人体的中枢神经系统造成损害，中毒严重可致死。例如，甲苯浓度达到或超过lmg/L可能损害神经系统、肾和肝脏。由于其对人体的毒性，甲苯已经被美国和中国等很多国家列入优先控制污染物黑名单。有些国家还制定了人体接触甲苯等苯系物的极限容许浓度。甲苯的毒害主要是由于其所具有的辛醇_水分配系数和较高的水溶性。有机溶剂的毒性与其在辛醇和水中分配系数的对数值(log Pow)相关，log 介于1.5-4.0之间的有机溶剂对生物体细胞具有极强的毒性，因为它们会选择性地分配到细胞质膜中，破坏其结构和功能。甲苯的log P。W(2.73，25°C )恰在此范围内。同时，甲苯的溶解度(532mg/L， 25°C )较高，在污染水体中具有较大的扩散倾向。甲苯污染治理包括采用物理、化学和生物等方法，其中，生物方法利用微生物对甲苯的降解和代谢能力，可以完全去除甲苯。生物方法设备简单，运行费用低，二次污染小，具有经济、节能、环境友好等潜在优势，是治理甲苯等苯系物污染的重要技术之一。目前，已报道的能够好氧降解甲苯的微生物主要包括Pseudomonas (假单胞菌) 属、Alcaligenes 属、Acinetobacter 属、Rhodococcus 属禾口 Nocardia 属的某些种的细菌。其中，某些 Pseudomonas 属细菌，如 Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa 禾口 Pseudomonas fluorescens,因其在多种芳香族化合物降解方面的出色表现而成为广为研究的菌种。不过，这些Pseudomonas属细菌能够降解的甲苯液相浓度往往低于200_300mg/ L。用于甲苯污染治理的生物方法，对高污染物浓度是十分敏感的，高甲苯浓度可能导致污染处理系统因微生物降解和耐受能力的局限而完全失效。因此，分离对高浓度甲苯具有强降解和强耐受能力的微生物菌株对污染环境的生物修复具有重要的意义。嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一种严格的非发酵型需氧的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于水、土壤、植物根系、人和动物的体表与消化道中。关于嗜麦芽寡养单胞菌降解甲苯的报道仅见一例。Lee等(J. Air & Waste Manage. Assoc. 2002， 52 400-406)从生物滤床中分离得到1株S. maltophilia T3_c，这株菌能够降解甲苯，但其降解和耐受甲苯的能力十分有限，报道中加入甲苯总量的最大值仅为70μπιΟ1，根据其采用的培养条件进行计算，其培养初始时最大甲苯液相浓度仅为30. lmg/L。这远不能满足高浓度甲苯污染条件下生物修复的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一株能够降解高浓度甲苯和利用甲苯作为唯一碳源和能源生长的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用。该菌株是利用无机盐培养基，以0. (ν/ν)甲苯作为选择压力，从北京市高碑店污水处理厂活性污泥样品中，经多周期驯化、富集和分离得到的。根据其16S rRNA基因序列测定数据，以及细胞形态和生理生化实验数据，经中国科学院微生物研究所鉴定，该菌种为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。将该菌株命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，已于 2011 年 5 月 10 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院)，保藏编号为CGMCC No. 4839。本发明的嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839可用来降解甲苯。本发明的另一个目的是提供一种降解甲苯的方法。本发明所提供的降解甲苯的方法，是利用嗜麦芽寡养单胞菌CGMCCNo. 4839降解甲苯。其中，具体包括如下步骤，将嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839接种到含有甲苯浓度为182. 4-401. 3mg/L的无机盐培养基中30_37°C振荡培养降解甲苯。该方法还可包括预培养步骤。所述预培养为在浓度182. 4-401. 3mg/L含甲苯的丰富培养基或无机盐培养基中 30-37°C振荡预培养。所述振荡培养的转速为150_200rpm。所述接种后嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839的OD6tltl为0. 15-0. 50。所述无机盐培养基组成可包括Na2HPO4 5. 65g/L, KH2PO4 5. 44g/L, (NH4)2SO4 1. 00g/L,氨三乙酸 0. 2g/L, MgSO4O. 29g/L, CaCl2 · 2H20 0. 07g/L, (NH4) 6Mo7024 · 4H20 0. 19g/ L, FeSO4 · 7H20 8. 3mg/L,乙二胺四乙酸二钠 3. lmg/L, ZnSO4 · 7H20 13. 7mg/L, MnSO4 · 7H20 1. 9mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 5mg/L, Co(NO3)2 · 6H20 0. 3mg/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 2mg/L。本发明的嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839能够在高甲苯浓度下降解甲苯，并利用甲苯作为唯一碳源和能源生长，嗜麦芽寡养单胞菌CGMCCNo. 4839对甲苯具有极强的降解、利用和耐受能力，这使其在甲苯污染环境的生物修复以及生物监测等领域具有重要的优势和潜在的应用前景。
图1嗜麦芽寡养单胞菌在LB琼脂平板上的菌落；图2嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839在无机盐培养基中在不同甲苯浓度下生长的特征；图3嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839在无机盐培养基中在不同甲苯浓度下生长的比生长速率；图4嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839在不同温度条件下生长的特征；图5嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839在不同pH条件下生长的特征；
图6嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839在不同供氧条件下生长的特征；图7嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839在不同预培养条件下生长的特征；图8嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839在LB培养基中对甲苯的耐受性；图9嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839分别以苯、乙苯和二甲苯为唯一碳源的生长。
具体实施例方式下面结合附图和优选实施例对本发明的技术方案做详细描述。实施例1、嗜麦芽寡养单胞菌的分离在250ml血清瓶中，加入50ml无机盐培养基，培养基组成包括Na2HP045. 65g/L， ΚΗ2Ρ045· 44g/L, (NH4)2SO4L OOg/L,氨三乙酸 0. 2g/L, MgSO4O. 29g/L, CaCl2 · 2H20 0. 07g/ L，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 19g/L，FeSO4 · 7H20 8. 3mg/L，乙二胺四乙酸二钠 3. lmg/L， ZnSO4 · 7H20 13. 7mg/L, MnSO4 · 7H20 1. 9mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 5mg/L, Co (NO3)2 · 6H20 0. 3mg/ L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 2mg/L。在121°C条件下将培养基灭菌20分钟。通过无菌操作，向血清瓶中加入0. 1% (ν/ν)甲苯。取高碑店污水处理厂好氧活性污泥2ml，无菌加入到上述250ml血清瓶中。用含胶垫的瓶盖封闭血清瓶，并进一步用Parafilm薄膜密闭培养系统。将血清瓶置于培养箱中培养，培养条件为30°C和150rpm。培养5d后，从中取2ml培养液，无菌加入到内含0. 1 % (ν/ ν)甲苯和50ml无机盐培养基的250ml血清瓶中，在30°C和150rpm条件下培养5d。然后， 重复此过程，共5-6个周期。培养结束后，取培养液在LB琼脂平板(蛋白胨10g/L，酵母膏 5g/L, NaCl 10g/L，琼脂15g/L)上稀释涂布，分离得到可以降解甲苯的菌株。该菌株在LB琼脂平板上菌落呈黄色，圆形，中央隆起(图1)。菌株的生理生化特征参见表1。表1嗜麦芽寡养单胞菌生理生化特征
权利要求
1.一种嗜麦芽寡养单胞菌，其保藏编号为CGMCC No. 4839。
2.如权利要求1所述的嗜麦芽寡养单胞菌在降解甲苯中的应用。
3.一种降解甲苯的方法，是利用嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839降解甲苯。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步骤，将嗜麦芽寡养单胞菌 CGMCC No. 4839接种到含有甲苯浓度为182. 4-401. 3mg/L的无机盐培养基中30_37°C振荡培养降解甲苯。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于还包括预培养步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述预培养为在含甲苯浓度 182. 4-401. 3mg/L的丰富培养基或无机盐培养基中30_37°C振荡预培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述振荡培养的转速为150-200rpm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述接种后嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No. 4839 的 0D_ 为 0. 15-0. 50。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述培养基组成包括Na2HPO45. 65g/ L, KH2PO4 5. 44g/L, (NH4)2SO4 1. 00g/L,氨三乙酸 0. 2g/L, MgSO4 0. 29g/L, CaCl2 · 2H20 0. 07g/L，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 19g/L，FeSO4 · 7H20 8. 3mg/L，乙二胺四乙酸二钠 3. lmg/L， ZnSO4 · 7H20 13. 7mg/L, MnSO4 · 7H20 1. 9mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 5mg/L, Co (NO3)2 · 6H20 0. 3mg/ L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 2mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种降解高浓度甲苯的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用。嗜麦芽寡养单胞菌命名为，其保藏编号为CGMCC No.4839。本发明还公开了一种降解甲苯的方法，是利用嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No.4839降解甲苯。本发明的嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No.4839能够在高甲苯浓度下降解甲苯，并利用甲苯作为唯一碳源和能源生长，嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC No.4839对甲苯具有极强的降解、利用和耐受能力。
文档编号A62D101/20GK102250788SQ20111014139
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者喻国策, 王建龙 申请人:清华大学