专利名称：抗嗜水气单胞菌免疫球蛋白制备技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及免疫球蛋白的制备技术，具体涉及水产生物疾病嗜水气单胞菌的免疫球蛋白的制备技术。
背景技术：
嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性短杆菌，有运动力。在自然界中分布广泛。越来越多的证据表明，嗜水气单胞菌可引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物的全身性败血症或局部感染，常致动物大量死亡。20世纪80年代术在中国、菲律宾、泰国、印度等传统池塘养殖大国的鱼类爆发性疾病中，该菌被认为是重要的病原。人类因嗜水气单胞菌感染所致急性胃肠炎、食物中毒、败血症及伤口感染亦时有报道。其致病性日益为医学界、水产学界及兽医学界所关注。
为了预防和控制在养殖过程中的鱼、虾、鳗、蟹、鳖等水生动物疾病的发生，往往采用疫苗、抗菌素和其他化合物等。但是，利用疫苗控制水生动物传染性疾病免疫途径和免疫效率尚待考证。研究发现爬行动物虽有较强的细胞免疫，但从其移植物排斥反应观察到孵出的鳄龟只能在90天之后才有排斥反应，由于T细胞的免疫成熟期需要三个月，因而认为鳄龟在孵化后有一个免疫未熟期。中华鳖血清中不存在小分子量的抗体，只有高分子量的抗体(IgM)，这种高分子量的抗体比小分子量的抗体更难通过卵巢的卵泡上皮转移到卵黄中，因此中华鳖卵黄中抗体的浓度很低。水产养殖动物生活水中，给疾病的诊治带来一定的困难，给药途径和用药效率也是一个难题。因此，水产养殖动物疾病的防治，日渐由从传统的看病-开药-治病转变到预防-管理上。由于抗生素的长期使用，动物肠道内及环境中病原微生物的耐药性增强，使其对动物的抗病促生长效果逐渐降低，在增加养殖成本的同时也造成了药物在动物体内残留和病原菌抗药性的传播，对人体健康造成严重威胁。
研究显示，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrphila)具有天然的R质粒，与磺胺、四环素、链霉素以及氯霉素的抗药性有关，此外，还对氨苄青霉素有一定的耐受性(＜20mg/每升培养基)。因此，对嗜水气单胞菌的防治，必须寻找无毒，无残留、低成本、高效的材料。
用抗体球蛋白来治疗、预防各种感染及替代或减少抗生素的使用已有相当长的历史。由于免疫球蛋白的生产制备过程复杂，来源有限，价格昂贵，使得免疫球蛋白的应用受到极大的限制。
本发明的目的就是提供一种工艺简单、来源广泛、价格低廉的特异性抗体用于防治水生动物的嗜水气单胞菌疾病。
发明内容
本发明利用灭活的嗜水气单胞菌为抗原，以一定的程序免疫蛋鸡，待血清中的特异性抗体转移至蛋黄中，经ELISA测定卵黄中抗体效价滴度达到1∶600以上，收集鸡蛋。将收集的鸡蛋用一定的方法制成添加剂，以口服途径应用于鱼、虾、鳗、蟹、鳖等水产动物饲料，用于水生动物疾病的预防和控制。
本发明的抗嗜水气单胞菌免疫球蛋白制备技术包括下述步骤将嗜水气单胞菌接种于营养肉汤，经18小时、35℃静止培养，将细菌浓度调整到2×109CFU/ml，按体积比加入0.4％的甲醛，37℃条件灭活36小时，经无活菌、无杂菌检验合格后，分别按体积比加入等量弗氏完全佐剂乳化后制成抗原A，按体积比加入等量弗氏不完全佐剂乳化后制成抗原B；选择25周龄的依莎蛋鸡作为生物反应器，首免用抗原A免疫蛋鸡，两周后用抗原B免疫蛋鸡连续三次，每次间隔两周，免疫方法为两侧胸肌和腿肌的肌肉注射，每点0.25ml；首免后第63～133天之间，用ELISA方法检测免疫蛋鸡所生鸡蛋卵黄中的抗体效价，收集效价滴度为1∶600以上的鸡蛋，4℃保存。
将上述效价滴度为1∶600以上的鸡蛋用作饲料添加剂，口服途径应用于鱼、虾、鳗、蟹、鳖等水产动物。
卵黄作为特异抗体IgY的来源，具有经济、快速、抗体含量高、易于诱导抗体等许多优点，适合特异性抗体的产业化生产，按本发明的技术方案制备的抗嗜水气单胞菌免疫球蛋白制成的饲料添加剂，经口服途径饲喂，对鲫鱼、基尾虾、中华鳖起到了良好的保护作用。
具体实施例方式
1)抗原制备将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila HZD111菌株本室保存)接种于营养肉汤，经18h、35℃静止培养，将细菌浓度调整到2×109CFU/ml，加入0.4％(v/v)甲醛，37℃灭活36h，经无菌检验合格后，分别按1∶1与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化后制成抗原，备用。
2)免疫方法和鸡蛋收集选择25周龄的依莎蛋鸡，首次用弗氏完全佐剂制成的抗原免疫，以后每次间隔2周用弗氏不完全佐剂制成的抗原免疫，连续免疫3次。每次于两侧胸肌和腿肌免疫，0.25mL/点。经ELISA检测后，首免后第63d至第133d鸡蛋中抗体效价为1∶600，收集该阶段的鸡蛋，于4℃保存备用。
3)使用方法将收集的鸡蛋在抗体效价得到有效保护的前提下用一定的方法制成添加剂，以口服的方式添加于鱼、虾、鳗、蟹、鳖等水产动物饲料，用于水生动物对嗜水气单胞菌疾病的预防和控制。
4)使用效果用以上收集鸡蛋中的IgY粗提物做使用效果试验。
1、体外抑菌试验。结果表明抗嗜水气单胞菌IgY浓度达1.0mg/ml时，18小时内108CFU/ml的抗嗜水气单胞菌无增殖，表明IgY具有显著的抑制细菌生长作用；当IgY浓度为0.5mg/ml时，约9.5小时后细菌出现增殖，但生长速度较慢；阴性对照组7小时后均出现细菌增殖。
2、用异育银鲫做预防试验结果表明预先注射抗嗜水气单胞菌IgY 7.5mg/尾然后攻毒，可以显著降低鱼的死亡率。通过对全部试验鱼脏器中细菌的分离，PBS对照组中机体各器官(鳃、肠、肾、肝)均有细菌存在，而试验组中存活鱼的鳃和肝已检测不到抗嗜水气单胞菌。同时，发现试验组死鱼肾脏中的细菌平均数明显下降。
3、规模化中华鳖养殖场养殖试验养鳖场流行所谓“甲鱼红脖子病”，其病原已确定为嗜水气单胞菌。其中以嗜水气单胞菌引起的中华鳖出血性败血症尤为严重。传统上主要依靠抗菌素、含氯剂等药物防止该病，虽能在一定程度上起到防治作用，但随着药物大量、长期的使用会造成环境污染、细菌耐药性和药物残留的产生。
用含有本发明制备的抗嗜水气单胞菌免疫球蛋白的饲料添加剂，对中华鳖做喂养试验，结果显示试验组与对照组相比不仅可以提高其平均日增重21.38％，缩短平均采食时间24.15％，而且亦可以提高其成活率4％。同时攻毒试验表明含抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的饲料对该病具有一定的预防作用，与对照组相比死亡率可降低80.8％，尸体解剖发现肾脏中细菌总数大大减少。
本发明提供的抗嗜水气单胞菌特异性IgY抗体的制备方法是一条高产、便利的途径，按本发明方法制备的免疫球蛋白可以作为替代或部分替代抗生素用于水生动物疾病的预防和控制，具有较大的潜力和广阔的前景。
权利要求
一、抗嗜水气单胞菌免疫球蛋白制备技术，其特征在于下述步骤1、嗜水气单胞菌接种于营养肉汤，经18小时、35℃静止培养，将细菌浓度调整到2×109CFU/ml，按体积比加入0.4％的甲醛，37℃条件灭活36小时，经无活菌、无杂菌检验合格后，分别按体积比加入等量弗氏完全佐剂乳化后制成抗原A，按体积比加入等量弗氏不完全佐剂乳化后制成抗原B；2、选择25周龄的依莎蛋鸡作为生物反应器，首免用抗原A免疫蛋鸡，两周后用抗原B免疫蛋鸡连续三次，每次间隔两周，免疫方法为两侧胸肌和腿肌的肌肉注射，每点0.25ml；3、首免后第63～133天之间，用ELISA方法检测免疫蛋鸡所生鸡蛋卵黄中的抗体效价，收集效价滴度为1∶600以上的鸡蛋，4℃保存。二、按权利要求一所述抗嗜水气单胞菌免疫球蛋白制备技术，其特征在于将上述效价滴度为1∶600以上的鸡蛋用作饲料添加剂，口服途径应用于鱼、虾、鳗、蟹、鳖等水产动物。
全文摘要
本发明为抗嗜水气单胞菌免疫球蛋白制备技术，涉及用免疫学方法防治水生动物疾病的技术。本发明利用灭活的嗜水气单胞菌作为抗原，以一定的程序免疫蛋鸡，待血清中的特异性抗体转移至蛋黄中，经ELISA测定卵黄中抗体效价滴度达到1∶600以上，收集鸡蛋。将收集的鸡蛋用一定的方法制成添加剂，添加于鱼、虾、鳗、蟹、鳖等水产动物饲料，用于水生动物嗜水气单胞菌病的预防和控制。
文档编号A23K1/16GK1733805SQ20051006032
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月8日 优先权日2005年8月8日
发明者李肖梁, 方维焕 申请人:浙江大学