一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐 药基因的引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 氨基糖苷类抗生素是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，包括 链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素等，按化学结构可把氨基糖苷类抗生素分为链霉胺类 和2-脱氧链霉胺类。
[0003] 氨基糖苷类抗生素抗菌谱较广，对许多革兰阴性菌、革兰阳性菌及结核分枝杆菌 有抗菌作用，可以作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成的多个环节并破坏细菌 细胞膜的完整性。此外，氨基糖苷类抗生素还可通过离子吸附作用附着于细菌菌体表面，造 成细胞膜缺损，使膜通透性增加；氨基糖苷类抗生素导致翻译错误所形成的异常蛋白质也 可能插入细胞膜，增加膜的通透性。
[0004] 氨基糖苷类抗生素是广谱、高效抗生素，适合治疗由革兰阴性菌引起的严重感染， 对肠杆菌科细菌有较强的抗菌活性，同时对假单胞菌属、气单胞菌属、产碱杆菌属等细菌也 有一定作用，但对肠球菌属和链球菌属无效。
[0005] 随着氨基糖苷类抗生素广泛而大量的使用，细菌对该类抗生素逐渐产生了抗药 性，耐药菌的出现较大的限制了该类药物的应用，从而导致治疗失去效果。抗生素耐药性是 由抗生素药物的不当使用造成的，细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药主要由氨基糖苷修饰酶 引起，其耐药机制主要由靶位改变、通透性降低或转运能力丧失、钝化酶的产生等。临床上 细菌对氨基糖苷类产生耐药的最重要原因是钝化酶的产生，即抗生素的氨基或羟基被酶修 饰后与核糖体结合不紧密而不能进入下一阶段发挥抗菌作用，使得细菌在抗生素存在的情 况下仍能存活。在细菌胞质内对抗生素进行修饰的氨基糖苷类钝化酶主要有氨基糖苷乙酰 转移酶（aac)、氨基糖苷磷酸转移酶（aph)、氨基糖苷核苷转移酶（ant)等，而在嗜水气单胞 菌中存在的钝化酶主要是aac(6'）_Iz和aph。
[0006] 细菌耐药性检测可以分为常规表型检测（即药敏试验）和耐药基因检测，其中，前 者首先需要从临床样品中分离纯化菌株，而有许多生长缓慢或对营养有特殊需求的菌株无 法通过常规药敏试验检测其耐药性。近年来，聚合酶链式反应（PCR)已广泛应用于细菌耐 药基因检测中并取得了很大进展，其操作相对简单，可在实验室内实现快速、准确检测。但 是，针对嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因还没有开发出成熟的PCR试剂盒，目前的检测 方法效率比较低、检测精度差、特异性不强。为了克服上述缺陷，本发明设计了用于嗜水气 单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测的引物组合物，能够快速、准确地对耐药基因进行检测。
【发明内容】
[0007] 本发明需要解决的技术问题是提供一种快速、准确、操作简便的检测试剂盒，实现 对嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因aac(6'）_Iz、aph的快速检测。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下引物对：
[0009] (1)扩增aac(6'）-Iz耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDN0:1和SEQID NO:2所示；
[0010] (2)扩增aph耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO: 3和SEQIDNO: 4所 示；
[0011] 上述2对引物对在一次检测中共同使用。
[0012] 上述检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物在制备嗜水气单胞菌氨基糖 苷类耐药基因的检测试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0013] -种嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒，试剂盒包括如下试剂：
[0014] (1)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶1U、10XPCR反应缓冲液、 Mg2+1. 5mM、dNTP200μΜ;
[0015] (2)引物混合液：将SEQIDNO: 1-4所示的4种引物混合，用ddH20溶解，每条引物 的浓度为2. 5μΜ;
[0016] (3)阳性对照：分别含有aac(6'）-Iz、aph耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA的 水溶液；
[0017] (4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液。
[0018] 本发明的一个方面是提供了一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物 组合物，其特征在于，包括如下引物对：
[0019] ⑴扩增aac(6'）_Iz耐药基因的引物对，其核苷酸序列为
[0020] FI：5, -CCCATCTCAACGCCTTTC-3r(SEQIDN0:1)；
[0021] R1 ：5, -AAGAAGACGACCCGCTCC-3r(SEQIDNO:2)；
[0022] 和 / 或
[0023] (2)扩增aph耐药基因的引物对，其核苷酸序列为
[0024] F2 ：5, -GCGATTCCCTCTTGTTG-3r(SEQIDNO:3)；
[0025] R2 :5'-GCAGGCGAAGGTCTCA-3'(SEQIDN0:4);上述 2 对引物对在一次检测中单 独或共同使用。
[0026] 本发明的另一个方面是提供了一种上述检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因 的引物组合物在制备检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的试剂中的应用。
[0027] 本发明的再一个方面是提供了一种嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂 盒，其特征在于，所述是试剂盒包含如上所述的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的 引物组合物。
[0028] 进一步地，该试剂盒还包括如下试剂：
[0029] (1)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP;
[0030] (2)阳性对照：分别含有aac(6'）-Iz、aph耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA的 水溶液；
[0031] (3)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液；
[0032] 所述引物组合物中的引物以ddH20溶解，每种引物的浓度为2. 5μΜ。
[0033] 进一步地，阳性对照中含耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA浓度为10ng/μL， 阴性对照中大肠杆菌基因组DNA的浓度为20ng/μL。
[0034] 本发明的再一个方面是提供了一种上述嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测 试剂盒在检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因中的应用
[0035] 本发明的再一个方面是提供了一种非诊断和治疗目的的检测嗜水气单胞菌氨基 糖苷类耐药性的方法，将样品进行PCR扩增，以上述的引物组合物对样品进行扩增，所得 PCR样品进行检测，具有扩增结果的即为样品具有耐药性，否则测对氨基糖苷类敏感。
[0036] 本发明的再一个方面是提供了一种非诊断和治疗目的的检测嗜水气单胞菌氨基 糖苷类耐药性的方法，将样品进行PCR扩增，包括如下步骤：
[0037] (a)PCR反应液的制备：从_20°C冰箱中取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上 备用。加样前10分钟内，按检测样本数（η)配置PCR反应液XμL;
[0038] (b)X= (9μLPCR反应液+4μL引物组合物混合液+5μLddH20)X(样本数η+1 份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）；
[0039] 振荡混匀后，3000rpm离心10s，按每份18uL分装到0. 2mLPCR反应管中备用；
[0040] (c)加样：向分装好试剂的反应管中，分别加入细菌样本DNA模板2yL，阳性对照 孔加入2μL阳性对照品，阴性对照孔加入2μL阴性对照品，空白对照孔加入2μLddH20,加 样过程要求冰上操作，3000rpm离心10s，放入PCR仪进样槽；
[0041] (d)PCR扩增：进行嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测，反应条件如下：94°C 预变性3111丨11;941€3〇8,581€3〇8,72 1€3〇8,30个循环；72°(：1〇111丨11;4°(：1〇111丨11 ;反应体积设 为20μL，设定后运行；
[0042] (e)凝胶电泳检测：采用常规方法制备1. 2%琼脂糖凝胶后放入加有ΤΑΕ缓冲液的 电泳槽中待用；将PCR样品取出后加入3μL上样缓冲液后混匀，取5μL样品加入胶孔中于 90V电压下电泳30min，电泳完成后取出凝胶置于凝胶成像仪中拍照并记录结果；结果中具 有条带说明样品对氨基糖苷类药物耐药，不具有条带则表明对氨基糖苷类药物敏感；
[0043] 所述引物组合物如上所示。
[0044] 上述嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒在检测嗜水气单胞菌氨基糖 苷类耐药基因中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0045] 有益效果：
[0046] (1)通过在NCBI的嗜水气单胞菌ATCC7966株基因序列库中检索氨基糖苷类耐药 基因序列并设计特异性引物，能够对嗜水气单胞菌aac(6'）_Iz、aph等氨基糖苷类耐药基 因进行快速检测。
[0047] (2)本发明所述的引物序列和试剂盒具有操作简便、快速、准确、成本低廉等优点， 可用于辅助临床快速诊断嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素的耐药情况，为临床治疗提供参 考依据。
【附图说明】
[0048] 图1为阳性对照品和空白对照品检测结果图，其中，M:DL2000分子量标准；泳道 1 :阳性对照品；泳道2 :空白对照品。
[0049] 图2为阴性对照品检测结果图，其中，M:DL2000分子量标准；泳道1-5分别以杀鲑 气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、大肠杆菌基因组DNA为模板进行 PCR扩增。
[0050] 图3为2例嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药基因检测结果图，其中M:DL2000 分子量标准；泳道1、2分别以2株嗜水气单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。
【具体实施方式】
[0051] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发 明，不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0052] 实施例1 :合成引物对
[0053] 检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类2种耐药基因aac(6'）_Iz、aph的核苷酸序列。2 对特异性引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成：
[0054] 扩增aac(6'）_Iz耐