专利名称：Fq-pcr检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，属化 学中包含酶或微生物的测定或检验技术领域。
背景技术：
嗜水气单胞菌Ueroffloaas hydrophila )在自然界中有广泛分布，普遍存在于淡 水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物，人 也可感染该菌而发生食物中毒、腹泻，影响食品安全，并且是免疫抑制患者和肝功能疾病患 者的机会致病菌，是一种典型人、兽、鱼共患病病原菌，除了对水产养殖业带来巨大经济损 失外，其公共卫生学意义，尤其是在临床疾病和食品安全方面，日益受到相关部门重视。温和气单胞菌Ueroffloaas sobria)又称威隆气单胞菌温和生物型(A veronii Zmw力ria)，属常见的腐物寄生菌，广泛存在于水域、土壤及水生动物体内，是一种条件性 致病菌，其主要致病因子是温和气单胞菌产生的多种溶血素和肠毒素，这些毒素具有多种 生物活性可引起动物体发生复杂的病理变化。它能单独引起鱼类、爬行类、两栖类等冷血动 物发病或与嗜水气单胞菌共同引起鱼类的败血病，是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之 一；同时，该菌也是重要的人、畜、鱼共患病病原菌，能引发腹泻、伤口感染和败血症等症状。 基于此，它与嗜水气单胞菌UeroMWM hydrophila) 一样也在水产养殖、临床疾病和食品 安全等诸方面日益受到相关部门重视。目前，嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的检测方法多为传统的生理生化鉴定和免疫 学诊断，由于它们的许多生化特征不稳定，血清型也较复杂，故采用以上方法鉴定时易产生 误判。也有针对细菌的种特异性基因采用PCR技术进行快速检测的手段，但都只能单一地 对其中一种进行检测。由于在评判致病可能性的大小时是需要一个总的致病菌含量的，所 以对于同一样品要使用两种不同的试剂盒、经过两次PCR检测才能得到该两种菌的总量数 据，在疫情预报、预防、控制等方面显得不够快速。
发明内容
针对上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是从嗜水气单胞菌与温和气单胞菌中 选择一个共有基因为靶，提出针对该基因靶的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌 的试剂盒。本发明提供的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，内有DNA序列 为 5，-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3，的上游引物、DNA 序列为 5，-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3，的下游引物、DNA 序列为 5，- (FAM)-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT- (TAMRA)-3，的iTaqMan探针，各试剂分别密封包装。本发明提供的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，针对嗜水气 单胞菌与温和气单胞菌中共有的16S rDNA而设计，通过FQ-PCR可以检测样品中是否含有 嗜水气单胞菌与温和气单胞菌及其所含的总量。与现有技术相比，本发明仅采用1对通用引物，即可同时定性、定量检测温和气单胞菌和嗜水气单胞菌2种致病菌，至少单一致病菌 的检测时间缩短一半，实现应急预警和突发疾病处理方面实时、快速的效果。16S rDNA中既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域， 其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物 演变的时间钟，非常适合用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。嗜水气单胞菌与 温和气单胞菌亲缘关系很近，均属嗜温、有运动力的气单胞菌，故具有对它们设计通用引物 和探针序列的可能性。所说试剂盒内还有密封包装的内含buffer、ExTagHS, dNTP Mixture、Mg2+的2X Premix EX Taq反应液；还有密封包装的无菌双蒸水；还有密封包装的DNA快速提取剂，DNA 快速提取剂由重量体积百分比为0. 9%的NaCl、重量体积百分比为0. 01%的SDS、体积百分 比为0. 1%的β -巯基乙醇、其余为水构成。所说试剂盒内的上游引物浓度为4 μ Μ、下游引物浓度为4 μ M、TaqMan探针浓度为 2 μ M0所说试剂盒内包装的试剂量是各试剂一次试验量的倍数，各试剂的一次试验量 为
4μ M上游引物0.4 μ L ； 4μΜ下游引物0. 4μ L ； 2 μ M TaqMan 探针 0. 4 μ L ； 2Χ Premix EX Taq 反应液 IOyL; 无菌双蒸水6. 8 μ L ； DNA快速提取剂50 μ L。
具体实施例方式1、一种FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，由包装盒和所包装 的试剂构成，每种试剂都由试剂瓶密封包装。其中所包装的试剂清单为
4 μ M上游引物4 μ L—支，上游引物的DNA序列为5，-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3，；
4 μ M下游引物4 μ L —支，下游引物的DNA序列为5，-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3，；
2 μ M TaqMan 探针 4 μ L 一支，TaqMan 探针的 DNA 序列为 5，- (FAM)-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT- (TAMRA)-3，。2、除上例试剂外，本例试剂盒内还包装有 2Χ Premix EX Taq 反应液 100 μ L 一支； 无菌双蒸水68 μ L—支。3、除上两例试剂外，本例试剂盒内还包装有 DNA快速提取剂0. ImL 一支。本发明提供的试剂盒，其使用方法同通常FQ-PCR方法一致，过程是 一、样品DNA提取
①取样品清液Iml加入到1. 5ml无菌印pendorf管中，在15000r/min下高速离心anin后，吸弃上清，保留沉淀；
在沉淀中加入DNA提取剂50 μ 1，将沉淀混勻后100°C加热处理^iiin ； 15000r/min下高速离心2min，取上清为模板(样品DNA)。二、PCR
1、扩增反应液准备
①从冰箱中取出试剂盒；
②根据每个PCR反应管内所需的2XPremix EX Taq反应液10 μ 1 (内含Taq酶、 buffer,dNTP Mixture、Mg2+等)、4 μ M上游引物、4 μ M 下游引物、2 μ M TaciMan 探针各 0. 4 μ L、无菌双蒸水6. 8 μ L，按实验所需的反应管数，计算出所需的试剂量依次加入，涡旋混 勻，按每管ISyL分装到PCR玻璃毛细管中。2.加样
①分别取2μL模板，加入到分装好扩增反应液的PCR玻璃毛细管中；
②盖好PCR玻璃毛细管盖，然后在2000r/m下低速离心30s。3、上机
①开机，并进行仪器性能自检；
②将准备好的PCR玻璃毛细管，放置在仪器样本孔相应位置；
③在荧光PCR仪器上设置好以下参数预变性95°C30秒一个循环；扩增变性 950C 5秒、退火延伸63 V 20秒共35个循环；在63°C收集荧光信号，收集方式设为“单点 收集(SINGLE)；仪器检测通道选择“F1” ；温度变化速率选择20°C /秒。④选择运行(RUN)后，开始进行PCR扩增。4、阈值设定与检测结果判定
①阈值设定原则为超过阴性对照扩增线(无规则噪音线)的最高点。②ct值< 30时提示样本中含有嗜水气单胞菌和温和气单胞菌，ct值在3广35之 间提示为不确定样本需重新增菌后再次测定。③无Ct值显示则提示样本中不含有嗜水气单胞菌和温和气单胞菌或数量极少 低于检测限。④若需定量检测时，要加入4飞个不同浓度的标准品与样本同时检测，荧光定量 PCR仪会根据各个标准品测得的Ct值绘制成标准曲线后仪器自动计算阳性标本的定量数 据，并在电脑界面上显示浓度。阴性与阳性对照不能正确显示Ct值则判定检测失败。使用本发明提供的试剂盒、用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌还有如 下特点
检测速度
模板DNA制备与扩增反应所需时间分别为5分钟与25分钟，从样本接收到结果报告仅 需30分钟左右。检测灵敏度
检出限为5.0父10、伪/1111，在5.0\10、伪/1111一5· 4X107cfu/ml的范围内标准曲线呈 良好的线性关系。批内重复性分别取5份不同浓度的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌DNA样本，每个浓度分成3份进 行测试，通过用测定值的均值I计
算ct值的标准差(S)和变异系数(cv)来验证批内重复性见下表
权利要求
1.一种FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，其特征是内有DNA序列为 5，-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3，的上游引物、DNA 序列为 5，-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3，的下游引物、DNA 序列为 5，- (FAM)-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT- (TAMRA)-3，的iTaqMan探针，各试剂分别密封包装。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是还有密封包装的内含buffer、ExTagHS、dNTP Mixture、Mg2+的2X Premix EX Taq反应液和/或无菌双蒸水和/或DNA快速提取剂，DNA 快速提取剂由重量体积百分比为0. 9%的NaCl、重量体积百分比为0. 01%的SDS、体积百分 比为0. 1%的β -巯基乙醇、其余为水构成。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征是所说试剂盒内的上游引物浓度为μ Μ、 下游引物浓度为4 μ M、TaqMan探针浓度为2 μ Μ。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征是所说所说试剂盒内包装的试剂量是各试 剂一次试验量的倍数，各试剂的一次试验量为-4μ M上游引物0.4 μ L ；-4μΜ下游引物0. 4μ L ；-2 μ M TaqMan 探针 0. 4 μ L ；-2Χ Premix EX Taq 反应液 IOyL;无菌双蒸水6. 8 μ L ；DNA快速提取剂50 μ L。
全文摘要
本发明提供的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，内有DNA序列为5’-TGGCCTTGACATGTCTGGAATCCT-3’的上游引物、DNA序列为5’-ACCATTACGTGCTGGCAACAAAGG-3’的下游引物、DNA序列为5’-(FAM)-AATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCT-(TAMRA)-3’的TaqMan探针，各试剂分别密封包装。本发明所说两种菌中共有的16SrDNA而设计，与现有技术相比，本发明仅采用1对通用引物，即可同时检测该2种致病菌，实现应急预警和突发疾病处理方面实时、快速的效果。
文档编号C12Q1/68GK102134597SQ201010608690
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者吕敢堂, 王志铮, 王忠发 申请人:浙江海洋学院, 舟山市疾病预防控制中心