用于细胞动静态交替培养的生物反应器系统及其方法
【专利说明】用于细胞动静态交替培养的生物反应器系统及其方法
[0001]发明人:张永新
[0002]这个专利的优先权要求基于于2012年10月18日在美国提出的申请号为61/715555的临时申请，部分优先权基于2012年3月29日提出的申请号为PCT/US2012/000182的PCT申请，该PCT申请的优先权基于2011年3月29日提交的美国专利N0.PCT/US2012/000182的专利临时申请。
[0003]相关专利
[0004]这个专利是2012年3月29日的PCT/US2012/000182的部分扩展，优先权日为申请临时专利61/468573的2011年3月29日，也是2012年3月30日申请的专利13435250的部分，这个专利也是2012年10月18日美国临时申请61/715555的扩展。
发明领域
[0005]细胞培养可能在三种状态下进行，即静态、动态和动静交替，本发明涉及一种可以在同一细胞培养容器中进行这三种状态细胞培养的生物反应器。
[0006]发明背景
[0007]大体来说，本申请生物反应器有关，具体地说是可以在同一个细胞培养容器中使细胞在静态、动态和动静态交替三种状态中生长的生物反应器。
[0008]许多种类的细胞，特别是造血干细胞和免疫细胞，在培养时对剪切力十分敏感。比如，剪切力可以在干细胞培养中导致非特异性分化，增加细胞凋亡，从而极大地降低干细胞扩增和定向分化的效率。较高的剪切力还可能在蛋白表达中释放出更多的非特异性蛋白，需要的特异性蛋白在培养中比例减小，蛋白纯化难度大大增加。静置培养的剪切力虽然最小，但静置培养的细胞通常在培养容器的底部，那么如果细胞密度较大，一些细胞无法获得足够的营养，因此不适合用于大规模的细胞扩增。一些生物反应器，比如NASA的室壁旋转生物反应器(RWV)，就是为降低剪切力而设计的。但是，这些生物反应器，必须通过不断地运动、搅拌和/或搅动细胞使细胞保持悬浮。一旦生物反应器停止运转，细胞将累积在底部某个位置或者培养容器的某个部位，而且是不均匀地分布，这对于绝大多数细胞生长是有害的，至少不利于细胞有效增长。因此，虽然这样的生物反应器的剪切力有所减少，但是当生物反应器运转时，仍有剪切力持续作用于培养的细胞上。毫无疑问，一个间歇性的搅拌，或者适当的动静态交替培养，不仅会使剪切力最小化，而且能为细胞提供一个理想的代谢环境。然而，因为运动的细胞的惯性作用，在动态培养转变为静态培养细胞时通常很难使细胞均匀分布。当细胞分布不均匀时(例如细胞局部堆积或者聚集)将对细胞生长很有害。我们现在发明提供了能使细胞在动态培养转变为静态培养细胞后仍能均匀分布的方法，以致所有的三种细胞培养状态都可以在目前公开的生物反应器系统中应用。
[0009]一些其他生物反应器，比如由Felder及其同事发明的，其中动态和静态培养是在不同的两个或者多个细胞培养容器中进行的，由传递细胞从一个培养状态传递到另一个培养容器的另一种状态，在培养容器的传递过程中，不可避免造成细胞损失和损伤。在我们现在的发明中，动静两态都在同一个细胞培养容器中进行，在状态转变的过程中不需要转换培养容器，当细胞从动态转换成静态时，细胞可以均匀分布在细胞腔的底部或者吸附在搅拌材料的表面。因此，我们的发明为细胞在悬浮状态和静置状态生长都提供了最佳的条件，并且两种状态可以反复转换。
[0010]一些生物反应器使用由磁性叶轮控制的磁性元件(尤其叶片或翼片)，用于搅拌培养基，保持细胞在悬浮状态。这种生物反应器专门增加剪切力，用于满足某些细胞的培养要求，细胞的分布随着培养基搅拌停止时叶轮的方向而定。较大的剪切力和静态时不均匀的分布与我们发明的生物反应器有明显的不同。除了应用差别以外，我们发明的生物反应器，不使用叶片或翼片作为磁性元件，我们发明中的磁珠如果不在磁场中实际上没有磁性，只有将它们放入磁场，它们才有磁性。我们发明中的磁珠不由叶轮控制，而是由磁场强度变化控制磁珠运动。
[0011]在我们的生物反应器的一个实例中，为了在搅拌时减小剪切力，以及在使细胞均匀分布，我们的生物反应器系统中的搅拌器在细胞培养容器内部两端的运动是与反应容器与之协调的的倒转结合形成的。相比而言，其他生物反应器通过搅拌或者培养容器运动使细胞悬浮，这两者都不能使细胞在搅拌过程中均匀分布，这都会在培养过程中产生较大的剪切力。这儿需要强调的是我们的系统中，培养容器的翻转不是为了细胞悬浮，相反，在我们的设计中希望最小化细胞培养容器翻转对细胞分散的影响，因为容器的运动会引起细胞在静止状态的分布不均匀。细胞培养容器的翻转主要是为搅拌器从容器的一端运动到另一端提供一个适宜的条件。
[0012]在另一个实施例中，细胞的静态培养和动态培养的转变是在垂直培养以及水平培养之间转变，细胞培养容器的旋转速度以及从旋转到静止的减速是影响细胞在静态时分布的两个主要因素。更高或者更低的转速以及减速速率将引起细胞接下来转动过程中不均匀分布。我们已经研究出合适的转动以及减速速率。
[0013]在我们的研究中，我们发现静态及动态的时长和动静态转换的频率显著影响细胞生长，并且不同细胞都不一样，由细胞种类、培养基、细胞密度(细胞浓度)、和细胞倍增速率(细胞增长速率)决定。
[0014]在我们以前的专利中，有些内容已被提及但没有在权力要求中清楚列出。在本专利中，这些都在权利要求中清楚的列出了。
[0015]摘要
[0016]本发明涉及一种生物反应器系统，其特征是所有三种状态的培养，即静态、动态、和动静态交替培养可以在同一个细胞培养容器中进行，而且强调动态培养之后的静态培养中的细胞的均匀分布。本发明中的生物反应器系统，联合应用磁控搅拌和培养容器翻转以及联合应用垂直旋转培养和水平静止培养为两个建造理想生物反应器的策略，它们使动静态交替培养在同一细胞培养容器的反应器中进行，并可以尽可能减小剪切力以及为细胞培养提供一个理想的代谢环境。
[0017]现在发明的生物反应系统可以是细胞在三种状态生长，特别是动静交替的状态，但是这个系统也可以单独用于动态或者静态细胞培养。在动态培养细胞时，细胞可以用任意方式再悬浮，包括但不限于磁力搅拌和培养容器翻转。
[0018]权利要求2中所说的细胞在静态时均匀分布可以在细胞培养容器的底部或者在任何材料上分布在培养容器的底部，或者培养容器内部的任意部位。
[0019]我们发明的生物反应器可以培养所有种类的细胞，包括悬浮细胞、粘附细胞和部分粘附细胞。培养粘附细胞时，可以在吸附在载体上生长。
[0020]根据权利要求1所述的生物反应器的运动状态包括细胞在载体上运动，载体围绕细胞运动、培养容器运动或者以上的任意组合。当细胞在培养基中运动，粘附细胞吸附在搅拌器或者载体上运动。为了使在细胞再悬浮或者搅拌产生更小的剪切力，应用程序有搅拌器垂直运动和细胞培养容器垂直旋转两个选项，其他方法也可以用于这个生物反应器的间歇性悬浮培养。
[0021]生物反应器的静止状态包括细胞相对于培养容器、培养基、生物反应器或者细胞生长的环境都相对静止。在有些案例中，细胞吸附在载体上，载体有可能在培养容器壁上，相对于培养容器不运动，虽然不是通常所说的在容器底部的静止状态但也可以认为是静止培养。
[0022]细胞培养时，生物反应器系统中的各种细胞培养状态可以在权利要求4所述的运动状态和权利要求5所述的静止状态间通过程序调控自由的任意转换，这种转换包括了在时间、速度以及频率方面的转换。我们发现了下述因素之间的相互关系:动态或静态的时期，动静态交替的频率，细胞密度，细胞生长速率(细胞倍增速率)，细胞产量和由细胞死亡和凋亡率，细胞非特异性分化，干细胞移植潜能来评价的细胞质量。
[0023]现在发明的生物反应器系统包含细胞培养容器翻转系统和磁性搅拌系统。在一个实施例中，细胞通过由电磁铁控制的搅拌器达到悬浮状态。当搅拌器上浮，细胞跟着搅拌器上浮。当搅拌器到达培养容器顶部时，他们被电磁铁吸附在顶端，随后培养容器翻转180°，使搅拌器随着培养容器变位于培养容器的最低处(底部)。