专利名称：含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于RNA干扰技术领域，涉及SiRNA及其应用，具体涉及含自由三磷酸基团 的TGF- β特异性siRNA及其应用。
背景技术：
由于早期的转移、高度耐受化疗和放疗等原因，使胰腺癌的预后极差。在胰腺癌的 进程中，生长转化因子β (TGF-β)的异常表达起到了关键性的作用。高表达的TGF-β能 促进肿瘤的生长、侵润、转移及血管生成，另外，肿瘤来源的TGF-β具有很强的抑制机体免 疫的作用，能帮助肿瘤建立免疫逃逸机制。如何抑制肿瘤介导的免疫抑制，是今后治疗胰 腺癌的一大挑战。针对这个与肿瘤生长、浸润、转移及免疫逃逸相关的重要分子，目前最有 效的方法之一是使用小干扰核糖核酸技术(siRNA)直接沉默，以阻断其促进肿瘤生长的通 路。这种含21-23个碱基对的特异双链RNA序列，其反义链能靶向识别这些分子相应的信 使RNA(mRNA)，并在相关酶的协同作用下，剪切mRNA从而干预TGF-β的蛋白合成。但前期 临床肿瘤治疗效果并不理想，原因可能与其作用靶点单一、不能有效激活机体对肿瘤的免 疫监视/杀伤功能、缺乏直接促进肿瘤细胞凋亡作用等有关。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供含自由三磷酸基团的TGF- β特 异性siRNA，该ppp-siRNA分子同时具备TGF- β特异性基因沉默、激活机体免疫应答和直接 促进肿瘤细胞凋亡的三重功能，从而能很好的抑制肿瘤。本发明的另一目的是提供该siRNA的应用。本发明的技术方案如下含自由三磷酸基团的TGF- β特异性siRNA (简称为ppp-TGF- β )，其反义链和正义 链序列5’端均为一鸟嘌呤核苷，该鸟嘌呤核苷戊糖3’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。所述的TGF- β特异性siRNA序列选自ppp-TGF- β 1，其正义链序列为SEQ IDN0. 1，反义链序列为SEQ ID NO. 2 ;ppp-TGF-β 2，其正义链序列为SEQ ID NO. 3，反义链序 列为 SEQ ID NO. 4。本发明所述的含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA在制备治疗肿瘤的药物 中的应用。本发明所述的含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA在制备治疗胰腺癌的药 物中的应用。本发明的有益效果发明人通过大量实验设计并筛选出具有良好基因沉默功能的小鼠和人TGF-β特 异性siRNA，通过设计5’ 一 3’端依次含有TGF-β特异性siRNA的eDNA序列、胞嘧啶核苷 及T7RNA聚合酶启动子序列的DNA模板，在体外利用T7RNA聚合酶转录合成得到5’端含自 由三磷酸基团的TGF- β特异性siRNA (以下简称ppp-TGF- β )。该ppp-TGF- β通过如下三种机制抑制肿瘤(1)本发明PPP-TGF- β能有效地特异性沉默TGF- β基因，抑制TGF- β蛋白的表 达。(2)本发明ppp-TGF-β能被细胞胞浆内的特异性识别受体_视磺酸诱导基 因-I (RIG-I，一种真核细胞胞浆螺旋酶，参与机体抗病毒的固有免疫)识别，并激活其下游 I-型干扰素信号转导通路，能诱导细胞产生IFN-β和干扰素诱导蛋白ΙΟ(ΙΡ-ΙΟ)、显著提 高肿瘤细胞免疫递呈分子MHC-I的表达(能提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别、攻击)， 从而激活细胞及机体对肿瘤的免疫应答。(3)本发明PPP-TGF- β还能激活内源性凋亡通路中caspase-9而促进肿瘤细胞凋亡。本发明将TGF-β特异性基因沉默作用机制和诱导真核细胞抗病毒的固有免疫 作用机制，引入到抗肿瘤的治疗中，不仅能抑制介导肿瘤免疫逃逸的重要分子TGF-β， 还能有效激活机体的抗肿瘤免疫，能显著性地提高治疗肿瘤的效果。有效地解决了传 统SiRNA(OH-RNA)仅有单一基因沉默功能，而治疗肿瘤疗效不佳的问题。故本发明 PPP-TGF- β可在制备治疗肿瘤特别是胰腺癌的药物中应用。
图1实施例2中定量RT-PCR检测ppp-TGF- β特异性基因沉默及免疫诱导功能结 果图。其中，图IA为PPP-TGF- β体外转染人胰腺癌细胞，对TGF- β mRNA表达量的影响； 图IB为ppp-TGF-β体外转染人胰腺癌细胞，对I-型干扰素mRNA的表达量的影响；图IC为 ppp-TGF- β体外转染鼠胰腺癌细胞，对TGF- β mRNA表达量的影响；图ID为ppp-TGF- β体 外转染人胰腺癌细胞，对I-型干扰素mRNA的表达量的影响；图IE为鼠ppp-TGF- β经静脉 注射胰腺癌小鼠，对其肿瘤实体中TGF- β的mRNA表达水平的影响；图IF为鼠ppp-TGF- β 经静脉注射胰腺癌小鼠，对其肿瘤实体中I-型干扰素的mRNA表达水平的影响；图IG为鼠 ppp-TGF-β经静脉注射胰腺癌小鼠，对其肿瘤实体中干扰素诱导蛋白(ΙΡ-10)的mRNA表达 水平的影响。图2实施例3中ELISA检测ppp-TGF-β基因沉默及免疫诱导功能结果图。其中图2Α 2Β依次为ppp-TGF-β体外转染小鼠胰腺癌细胞，24h后对TGF-β蛋 白水平和干扰素诱导蛋白水平的影响；图2C 图2F为鼠ppp-TGF-β治疗的荷瘤小鼠，对 血浆TGF-β水平的抑制情况；图2G 21为鼠ppp-TGF-β静脉注射荷瘤小鼠6小时后，对 血浆IFN- α、ΙΡ-10和TNF- α蛋白水平的影响。图3ppp-TGF_i3转染胰腺癌细胞，肿瘤细胞表面1_型抗原呈递分子表达情况。其中见图3A为人ppp-TGF-β转染不同人胰腺癌细胞，肿瘤细胞表面1_型抗原呈 递分子表达情况；图3Β为鼠ppp-TGF-β转染鼠胰腺癌细胞，肿瘤细胞表面I-型抗原呈递 分子表达情况。图4ppp-TGF-3静脉注射小鼠后12小时，B淋巴细胞、CD4、CD8淋巴细胞、NK细胞 及NKT细胞的活化情况。图5ppp-TGF- β处理鼠及人胰腺癌细胞后48小时，细胞凋亡情况。
图6实施例4中PPP-TGF- β转染人及鼠的胰腺癌细胞48小时后，活化caspase-9 在细胞中表达情况。图7ppp-TGF_i3转染小鼠胰腺癌细胞后48小时，肿瘤细胞活性情况。图Sppp-TGF-β转染人胰腺癌细胞后48小时，肿瘤细胞活性情况。图9实施例6中ppp-TGF-β转染小鼠胰腺癌细胞后24小时，胞内活化的 caspase-9荧光免疫染色照片。图lOppp-TGF- β治疗原位胰腺癌小鼠组，肿瘤TUNEL染色结果。图11小鼠生存曲线图。本发明各幅附图横坐标Α均为空白组，即未给予RNA治疗组；B均为OH-RNA组，即 给予无意义siRNA治疗组；C均为ppp-RNA组，即给予含自由三磷酸基团的无意义siRNA治 疗组；D均为OH-TGF- β组，即给予TGF- β特异性siRNA治疗组；E均为ppp-TGF- β组，即 给予5’端含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA治疗组。
具体实施例方式实施例1本发明ppp-TGF-β的合成1. 1人及小鼠TGF- β特异小干扰RNA的设计和筛选根据PUBMED基因库中，人及小鼠的TGF_i3mRNA完整编码序列，使用siRNA设计软 件(Dharmacon RNAi Technologies)，筛选出数条相应匹配的反义短序列，各含19核糖核 苷。在体外合成相应的siRNA (Metabion，Germany)，并于每条单链3’端链接2个游离尿嘧 啶核苷，用作体外筛选及抑瘤实验的OH-TGF-β组。将合成的siRNA序列(OH-TGF-β)，在体外用脂质体(Lipofectamine 2000)按 0. 5微克/微升在OptiMEM培养基中混合包被，体外转染胰腺癌细胞，在不同的时间24h、 48h及72h提取细胞RNA，用定量RT-PCR方法检测TGF- β 1的mRNA表达量，根据对TGF- β 的抑制作用效果而选择抑制效果最佳的siRNA，从而得到两条TGF-β特异性siRNA。其中一 条为人TGF-β特异性siRNA，其正义链序列为SEQ ID NO. 5，反义链序列为SEQID N0. 6 ；另 一条为鼠TGF-β特异性siRNA，其正义链序列为SEQ ID N0. 7，反义链序列为SEQ ID N0. 8。同时，设计并合成对人及小鼠均无意义siRNA，其正义链序列为SEQ ID N0. 9，反义 链序列为SEQ ID N0. 10，该序列通过与PUBMED基因库中相关mRNA进行匹配分析，证实无任 何干扰作用。合成时为增强其稳定性，于每条单链3’端链接2个游离尿嘧啶核苷。该3’ 端链接2个UU的无意义siRNA，在考察抑瘤效果时作为OH-RNA对照。1. 2 合成 ppp-TGF- β 的 DNA 模板设计根据1. 1筛选得到的序列，在相应的正义链或反义链的cDNA序列的3’端依次 链接一个胞嘧啶核苷和一段T7RNA聚合酶启动子序列SEQ ID N0. 11，作为编码相应的 ppp-TGF-β正义链或反义链的DNA模板，序列见表1，送交基因公司(Metabion，Germany) 合成。其中胞嘧啶的加入是为了增强转录效率，T7RNA聚合酶启动子序列的加入是使T7RNA 聚合酶能特异识别并启动从5’端向3’端的转录，从而得到在5’端核糖核苷的戊糖3’位 点上修饰有一自由三磷酸基团转录的产物，即ppp-TGF- β。表1.在体外利用T7RNA聚合酶合成ppp-TGF- β的DNA模板
权利要求
含自由三磷酸基团的TGF β特异性siRNA，其特征在于该TGF β特异性siRNA的反义链和正义链序列5’端均为鸟嘌呤核苷，该鸟嘌呤核苷的戊糖3’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。
2.根据权利要求1所述的含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA，其特征在于所述 的TGF-β特异性siRNA序列选自ppp-TGF-i3 1，其正义链序列为SEQ ID NO. 1，反义链序列 为SEQ ID NO. 2 ；或PPP-TGF-β 2，其正义链序列为SEQ ID NO. 3，反义链序列为SEQ IDN0. 4。
3.权利要求1所述的含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA在制备治疗肿瘤的药 物中的应用。
4 .权利要求1所述的含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA在制备治疗胰腺癌的 药物中的应用。
全文摘要
本发明属于RNA干扰技术领域，公开了含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用。该含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA的反义链和正义链序列5’端均为鸟嘌呤核苷，该鸟嘌呤核苷的戊糖3’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。本发明siRNA结合了TGF-β特异性基因沉默作用机制和诱导真核细胞抗病毒的固有免疫作用机制，不仅能抑制介导肿瘤免疫逃逸的重要分子TGF-β，还能有效激活机体的抗肿瘤免疫，能显著性地提高治疗肿瘤的效果。有效地解决了传统siRNA(OH-RNA)仅有单一基因沉默功能，而治疗肿瘤疗效不佳的问题。本发明ppp-TGF-β可在制备治疗肿瘤特别是胰腺癌的药物中应用。
文档编号C12N15/113GK101974529SQ20101029108
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者马柯思·斯诺, 魏继武 申请人:魏继武