添加和/或除去了连接基团的多肽－聚合物偶联物的制作方法

专利名称：添加和/或除去了连接基团的多肽－聚合物偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及添加和/或除去了一个或多个连接基团的多肽-聚合物偶联物，所述基团可用于将聚合分子偶联至该多肽3D结构表面上，制备本发明多肽-聚合物偶联物的方法，所述偶联物在降低免疫原性和变应原性方面的用途，以及含有所述偶联物的组合物。
背景技术：
医学领域中，熟知多肽(包括酶)可用于循环系统中，以达到特定的生理学效果。此外，在工业应用领域内，如衣物洗涤、纺织品漂白、个人护理、接触性镜片的清洁、食品和饲料制备中，酶被用作功能性成分。药物和工业应用中的重大差异之一在于，后一类型的应用(即工业应用)中，并不打算使多肽(常常是酶)进入体内的循环系统。
某些多肽和酶的稳定性不能令人满意，而且在某些情况下(取决于接触的方式)可能会引起免疫应答，通常是IgG和/或IgE应答。
今天一般都认识到，当多肽(如酶)与聚合分子偶联时，多肽的稳定性会得到提高，免疫应答会减少。人们确信，免疫应答的降低是由于所偶联的聚合分子遮蔽了多肽表面上负责免疫应答、导致抗体形成的表位所致。
用于偶联多肽和聚合分子的技术在本领域是熟知的。
最合适的商业技术之一早在20世纪70年代早期就已描述(如美国专利no.4,179,337)。所说的专利涉及非免疫原性多肽，如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶联的酶和肽激素。其中至少15％的多肽生理活性得到保持。
英国专利no.1,183,257(Crook等)描述了通过三嗪环将酶与多糖偶联的化学。
另外，用于保持酶-聚合物偶联物之酶促活性的技术在本领域也是已知的。
WO 93/15189(Veronese等)涉及一种通过将蛋白水解酶连接到大分子化的抑制剂上来保持经聚乙二醇修饰的蛋白水解酶活性的方法。该偶联物旨在于医疗应用。
已经发现将聚合分子连接到多肤上通常会通过干扰多肽与其底物相互作用而降低多肽活性。EP 183 503(Beecham Group PLC)公开了上述概念的一种发展，即提供了结合物，所述结合物含有借助于可逆的连接基团而连接到至少一种水溶性聚合物上的药学上有用的蛋白质。
EP471,125(Kanebo)公开了包含通过三嗪环偶联到多糖上以提高耐热性和保存稳定性的亲本蛋白酶(芽孢杆菌蛋白酶，商品名Esperase)的皮肤护理产品。所利用的偶联技术在上述的英国专利no.1,183,257(Crook等)中有描述。
JP 3083908描述了一种皮肤化妆品材料，该材料中含有来自豚鼠肝脏的、用一种或多种水溶性物质(如PEG、淀粉、纤维素等)修饰过的转谷氨酰胺酶。这种修饰是通过激活聚合分子并将其偶联到所说的酶上而进行的。据称该组合物对皮肤比较温和。
然而，不太可能总是能够很容易地将聚合分子偶联到多肽和酶上。此外，仍然需要有免疫原性和/或变应原性进一步降低的多肽-聚合物偶联物。
发明简述本发明的目的是提供适于工业和药物应用的改良的多肽-聚合物偶联物。
在本

发明内容
中，术语“改良的多肽-聚合物偶联物”意指在人体和动物体内的免疫应答有所降低、稳定性有所改善的偶联物。免疫应答取决于激发的方式，下面将进一步描述。
本发明人已经发现，通过在亲本多肽表面上添加和/或除去一个或多个连接基团，以使多肽与聚合分子偶联，即有可能使多肽(如酶)的免疫原性和/或变应原性降低。
药用多肽被直接导入循环系统(即血流)中时，其潜在的危害在于可能会引发免疫应答，主要是IgG、IgA和/或IgM抗体形式的应答。与此相对照，工业用多肽，例如在诸如洗涤剂中用作活性成分的酶，并不欲进入循环系统，与工业用多肽有关的潜在危险在于被吸入后会导致主要是IgE抗体形成形式的变应原性应答。
因此，有关工业用多肽，其潜在危险在于通过吸入、气管内和鼻内呈递多肽引发的呼吸性变应原性。
药用多肽的潜在危险主要在于皮内、静脉内或皮下呈递多肽所导致的免疫原性。
应当明白，降低“免疫原性”和降低“呼吸性变应原性”是两个极其不同的问题，即它们的接触途径不同，两种免疫机理也极其不同本发明中所用的术语“免疫原性”可以是指临床试验中的变应性接触皮炎，这是对接触和渗入皮肤的化学物质产生的一种细胞介导的迟发型免疫应答。这种细胞介导的反应也称作迟发型接触性过敏反应(根据Gell和Combs的组织损伤中免疫机制的分类，为第IV型反应)。
术语“变应原性”或“呼吸性变应原性”是在吸入诸如多肽后立即发生的过敏反应(根据Gell和Combs，为抗体介导的I型反应)。
根据本发明，可以提供免疫应答有所降低和/或稳定性有所改善的多肽，其基本上保留了剩余活性。
至少在本发明文中，变应性应答和免疫原性应答用一个术语表示，称为“免疫应答”。
在第一方面，本发明涉及一种多肽-聚合物偶联物，其具有a)一个或多个额外的聚合分子偶联至多肽上，所述多肽已被修饰，使得与相应亲本多肽上的可用连接基团数相比，该多肽表面上的连接基团数增加了，和/或b)少一个或多个聚合分子偶联至多肽上，所述多肽已被修饰，使得与相应亲本多肽上的可用连接基团数相比，该多肽的功能性位点处或附近的连接基团数减少了。
术语“亲本多肽”指的是欲通过偶联聚合分子而进行修饰的多肽。亲本多肽可以是天然存在的(或野生型)多肽，或者是通过任何适当方法制得的其变体。例如，亲本多肽可以是通过在天然存在多肽的氨基酸序列中取代、删除或截短一个或多个氨基酸残基或者添加或插入一个或多个氨基酸残基而进行修饰的天然存在多肽的变体。
在本发明上下文中，“合适的连接基团”指的是多肽表面上能够与目的聚合分子偶联的任何氨基酸残基基团。
优选的连接基团是赖氨酸残基的氨基和N-末端氨基。也可以将聚合分子偶联到多肽链上位于表面的氨基酸残基的羧酸基(-COOH)上。羧酸连接基团可以是天冬氨酸或谷氨酸的羧酸基，以及C-末端羧酸基。
“功能性位点”意指对多肽的性能，如催化活性很重要的任何氨基酸残基和/或辅因子，如丝氨酸蛋白酶内的催化性三联体残基-组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，或者例如过氧化物酶(如Arthromyces ramosus过氧化物酶)内的血红素基团和远端及近端组氨酸。
第二方面，本发明涉及制备改良的多肽-聚合物偶联物的方法，包括以下步骤a)鉴定出位于所述亲本多肽3D结构表面上的氨基酸残基，b)选择出所述待突变的亲本多肽所述3D结构表面上的目标氨基酸残基。c)i)用具有合适连接基团的氨基酸残基取代步骤b)中选定的一个或多个氨基酸残基或者在所选位点插入所述氨基酸残基，和/或ii)取代或者删除步骤b)中选定的、功能性位点处或者附近的一个或多个氨基酸残基，d)将聚合分子偶联到突变多肽上。
本发明还涉及本发明偶联物的用途，以及降低药物免疫原性和降低工业产品变应原性的本发明方法。
最后，本发明涉及含有本发明偶联物以及工业产品或药物中使用的其它成分的组合物。
附图简述

图1显示用i)对照，ii)未修饰的脂肪酶变体，iii)脂肪酶变体-SPEG免疫接种5次、每周1次后，抗脂肪酶的血清抗体水平。(Xlog(血清稀释度)；Y光密度(490/620))。
发明详述本发明的目的是提供适于工业用和药用的改良的多肽-聚合物偶联物。
尽管药用和工业用多肽可以很不相同，然而，本发明的原理可以根据亲本多肽的具体类型(即酶、激素肽等)稍作改动。
本发明人提供了改良的多肤-聚合物偶联物，所述偶联物与由相应的亲本多肽制得的偶联物相比，其免疫应答有所降低。
本发明人发现，在亲本多肽表面上添加一个或者多个连接基团，会使多肽(如酶)的免疫原性降低和/或变应原性降低。除此之外，本发明人还发现，除去功能性位点处或者附近的连接基团，有可能保持更高百分比的剩余功能活性。
在第一方面，本发明涉及一种改良的多肽-聚合物偶联物，其具有a)一个或多个额外的聚合分子偶联至多肽上，所述多肽已被修饰，使得与相应亲本多肽上的可用连接基团数相比，该多肽表面上的连接基团数增加了，和/或b)少一个或多个聚合分子偶联至多肽上，所述多肽已被修饰，使得与相应亲本多肽上的可用连接基团数相比，该多肽的功能性位点处或附近的连接基团数减少了。
连接基团的添加和/或除去与否取决于特定的亲本多肽。a)添加连接基团如果亲本多肽表面上的可用连接基团很少，就有可能需要多肽上有更多的连接基团。通过取代或插入一个或多个氨基酸残基而在亲本多肽表面上添加一个或多个连接基团，使得可连接的聚合分子数比相应的亲本多肽要多一些。与其上偶联了更少量聚合分子的相应偶联物相比，含有更多聚合分子连接于其上的偶联物通常具有更弱的免疫应答。
原则上，可以对多肽表面上、优选不位于功能性位点(如酶的活性位点)处或附近的任何可用氨基酸残基进行取代和/或插入，以提供额外的连接基团。
正如下面将会详细描述的那样，对于免疫应答的降低和多肽本身保持的剩余功能活性百分比而言，额外偶联的聚合分子的位置可能比较重要。
与在相应的亲本多肽基础上制得的偶联物的聚合分子数相比，本发明的偶联物通常有1-25个、优选1-10个或更多个额外的聚合分子偶联至多肽的表面。
然而，添加的连接基团的最佳数目(至少部分)取决于欲被偶联聚合分子遮蔽的亲本多肽表面面积(即分子量)，当然还取决于亲本多肽上已有的可用连接基团数。b)除去连接基团在通过与底物或类似物相互作用而行使其功能的酶或者其它多肽的情况下，如果聚合分子偶联至多肤的功能性位点(即酶的活性位点)处或附近，则聚合分子有可能会阻碍多肽与其底物或类似物之间的相互作用。这很有可能会导致活性降低。
若酶有一个或多个聚合分子偶联至其活性位点处或者附近，则预计会使剩余酶促活性显著丧失。因此，根据本发明，可以将偶联物构建成与在目的亲本酶基础上制备的相应偶联物相比具有更高剩余酶促活性百分比的形式。通过取代和/或删除活性位点处或者附近的连接基团、由此改善催化裂隙内底物的可达性而提高底物亲和性，即可达到这点。
与在相应亲本多肽基础上制备的偶联物的聚合分子数相比，本发明的酶-聚合物偶联物在其活性位点处或者附近偶联的聚合分子可少1-25个、优选少1-10个。
正如下面解释的那样，功能性位点处或者附近是指应无聚合分子偶联至距离功能性位点5范围内、优选8范围内、特别是10范围内。
可以将多肽功能性位点处或者附近的连接基团的除去与在多肽表面其它部分添加连接基团有利地组合起来。
这样，连接基团总数可以不发生变化、增加或者减少。然而，连接基团总数的分布已被改良，这可以通过免疫应答的降低和/或保持的剩余活性百分比得到证实。这样也可提高稳定性。连接基团数一般说来，连接基团数应与多肽分子量和/或表面积平衡。多肽越大，就应有越多的聚合分子偶联至多肽上，以充分遮蔽负责抗体形成的表位。
因此，若亲本多肽分子相对较小(如1-35kDa)，则将偶联的聚合分子(功能性位点之外)总数增加到总数4-20个比较有利。
若亲本多肽分子更大一些，例如35-60kDa，则将偶联的聚合分子(功能性位点之外)数增加到7-40等等比较有利。
在下面表1中列出了所述多肽分子量(Mw)与偶联聚合分子数之间认为比较合适的比率。
表1

降低的免疫应答与保持的剩余酶促活性相比于其它类型的多肽来说，尤其是对于酶，由于酶的活性和底物与酶结构中常以裂缝形式存在的活性位点之间的相互作用有关，因此，在降低免疫应答方面与保持显著的剩余酶促活性之间存在冲突。
不受任何理论的限制，可以想见，酶-聚合物偶联物的酶促活性损失可能是由于特别大和/或重的聚合分子以空间阻隔底物到达催化性裂缝的形式阻碍底物到达活性位点所造成的结果。也有可能(至少部分上)是由于因偶联聚合分子引起的张力而使酶的3D结构发生了不利的微小结构变化所致。保持的剩余活性本发明的多肽-聚合物偶联物显著保持了功能活性。
在本发明上下文中，“显著”保持的功能活性定义为，与在相应亲本多肽的基础上制备的偶联物活性相比，活性至少为20％-30％，优选30％-40％，更优选40％-60％，更好是从60％直至80％，还要更好是从80％直至100％。
在无聚合分子偶联至功能性位点处或者附近的本发明多肽-聚合物偶联物的情况下，剩余活性甚至可达100％或接近于此。若除去了功能性位点处的亲本肽连接基团，则其活性与修饰的(即偶联了聚合物的)亲本多肽偶联物相比，甚至可以超过100％。偶联的聚合分子的位置为了使免疫应答(即免疫原性和变应原性应答)最佳地减小，偶联至所述多肽表面的聚合分子之间应间隔适当的距离。
在本发明的优选实施方案中，对亲本多肽进行修饰的方式能使得聚合分子广泛分布于多肽的表面上。若所述多肽具有酶促活性，则以在活性位点区域处或者附近偶联尽量少的聚合分子、尤其是不偶联聚合分子为佳。
在本发明的上下文中，“广泛分布于多肽表面”是指可用的连接基团所处的位置能使得聚合分子遮蔽表面的不同部分(优选地是远离功能性位点的整个表面或接近于整个表面)，以确保表位受到遮蔽，从而不被免疫系统或其抗体所识别。
如Sheriff等(1987，美国国家科学院院报，84，p8075-8079)所述，抗体-多肽相互作用区域通常覆盖一个5002的区域。5002相当于一个25×20的长方形区或者一个半径为12.6的环形区。因此，为避免抗体与所述多肽的表位结合，以两个连接基团之间最大距离大约10为佳。
这样，所处位置距离已有的可用连接基团10以上的氨基酸残基就是合适的目标残基。如果多肽上两个或多个连接基团相距非常近，则绝大多数情形下会导致只偶联一个聚合分子。为确保功能活性损失最小，以在功能性位点处或者附近不偶联聚合分子为佳。这一距离至少部分取决于待偶联的聚合分子的庞大程度，因为并不希望由于大的聚合分子而阻碍进入功能性位点。因此，聚合分子越庞大，所偶联的聚合分子离功能性位点的距离就应越远。
为了保持目的多肽的显著功能活性，对位于距离这种功能活性位点5范围内、优选8内、特别是10范围内的连接基团应不进行偶联，因此，通过突变除去或者改变这些连接基团是有好处的。尽管功能性残基可能会是偶联聚合分子的目标，但通常不应将它们突变/除掉。因此，在这种情况下，选择涉及不同连接基团的偶联化学可能要比较好一些。
此外，按照本发明，为了提供在免疫系统可识别的已知表位或者所述表位附近偶联了聚合分子的一种多肽，在这种位点进行特定突变也被视为是有好处的。若表位的位置未知，则将数个或者许多聚合分子偶联至多肽上比较好。
正如以上所述，优选所述连接基团广泛分布于表面上。连接基团实际上，所有的离子化基团，如赖氨酸残基的氨基，均位于多肽分子的表面上(参见例如Thomas E.Creighton，1993，“蛋白质”，W.H.Freeman and Company，New York)。
因此，修饰过的或者亲本多肽上易于达到的连接基团(如氨基)数一般等于该多肽一级结构中的赖氨酸残基数加上N-末端氨基。
将聚合分子偶联至氨基的化学比较简单，并且在本领域内已很好地建立起来了。因此，优选将赖氨酸残基(即连接基团)添加至所述亲本多肽上，和/或从所述亲本多肽上除去赖氨酸残基，以获得免疫原性和/或变应原性有所降低、并且/或者稳定性有所改善并且/或者保持的功能活性百分比比较高的改良偶联物。
也可以将聚合分子偶联至多肽表面上的氨基酸残基的羧基(-COOH)上。因此，若使用羧基(包括C-末端羧基)作为连接基团，那么，按照本发明，添加和/或除去天冬氨酸和谷氨酸残基可能也比较合适。
若使用其它的连接基团，如-SH基，则可以类似地添加和/或除去这种基团。
氨基酸残基取代优于插入，因为这样对多肽3D结构的影响通常没有那么显著。
优选的取代是保守性取代。在提高连接基团数的情形下，在距离功能性位点(酶的活性位点)5、优选8、特别是10的位置处进行取代比较有利。
旨在获得额外氨基连接基团的一个合适保守性取代的例子是精氨酸至赖氨酸的取代。旨在获得额外羧基连接基团的保守性取代的例子有天冬酰胺至天冬氨酸/谷氨酸的取代或者谷氨酰胺至天冬氨酸/谷氨酸的取代。为了除去连接基团，可以用精氨酸等等取代赖氨酸残基。亲本多肽在本发明上下文中，术语“多肽”包括用于医药或工业应用中的蛋白质、肽和/或酶。通常所讨论的多肽分子量约为1-100kDa，常常是15kDa-100kDa。
药用多肽术语“药用多肽”定义为导入人体和/或动物体内的循环系统中时具有生理学活性的多肽，包括肽(如肽激素)、蛋白质和/或酶。
导入至循环系统中时，药用多肽具有潜在免疫原性。
本发明所称的“药用多肤”的例子包括胰岛素、ACTH、胰高血糖素、促生长素抑制素、促生长素、胸腺素、甲状旁腺素、色素激素(pigmentary hormones)、生长调节素、红细胞生成素、黄体生成素、绒毛膜促性腺激素、下丘脑释放因子、抗利尿素、促甲状腺素、松弛素、干扰素、血小板生成素(TPO)和催乳素。工业用多肽工业应用中所用多肽常常具有酶促活性。工业用多肽(如酶)并不打算引入到体内的循环系统中(正好与药用多肽形成对照)。
工业用多肽，例如用作工业组合物和/或产品(如洗涤剂和个人护理产品，包括化妆品)中成分的酶，一般不太可能与人体或动物体的循环系统直接接触，因为这类酶(或包含这类酶的产品)不会被注射(或经类似方法)到血流中。
因此，在工业用多肽的情形下，潜在危险在于因通过呼吸通道吸入多肽而引发呼吸性变态反应(即IgE应答)。
在本发明上下文中，“工业用多肽”指的是并不打算导入到人体和/或动物体内循环系统中的多肽，包括肽、蛋白质和/或酶。
这类多肽的例子有诸如下述的产品中所用的多肽，特别是酶洗涤剂、生活用产品、农业化学物质、个人护理产品(如皮肤护理产品，包括化妆品和洗涤用品)、口腔和皮肤药物、用于加工纺织品的组合物、用于硬表面清洁的组合物，以及用于生产食品和饲料的组合物，等等。酶促活性具有酶促活性的药用或者工业用多肽常常属于包括下述的酶类之一氧化还原酶(E.C.1，“酶命名法，(1992)，学院出版公司)，如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；转移酶，(E.C.2)，如转谷氨酰胺酶(TG酶)；水解酶(E.C.3)，包括蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶，以及脂解酶；异构酶(E.C.5)，如蛋白质二硫键异构酶(PDI)。
水解酶蛋白水解酶所涉及的蛋白水解酶包括选自下列组的蛋白酶天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)、半胱氨酸蛋白酶(如木瓜蛋白酶)、丝氨酸蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶)，或金属蛋白酶(如Neutrase)。
亲本蛋白酶的一些具体例子包括PD498(WO 93/24623，SEQ.IDNO.2)，Savinase(von der Osten等，(1993)，生物技术杂志，28，p.55+，SEQ ID NO3)，蛋白酶K(Gunkel等，(1989)，欧洲生物化学杂志，179，p.185-194)，蛋白酶R(Samal等，(1990)，分子微生物学，4，p.1789-1792)，蛋白酶T(Samal等，(1989)，基因，85，P.329-333)，枯草杆菌蛋白酶DY(Betzel等，(1993)，Arch.Biophys，302，no.2，P.499-50)，Lion Y(JP 04197182-A)，Rennilase(可从Novo NordiskA/S得到)，JA16(WO 92/17576)，Alcalase(天然枯草杆菌蛋白酶Carlberg变体)(von der Osten等，(1993)，生物技术杂志，28，P.55+)脂解酶所涉及的脂解酶包括柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(如在EP 258 068和EP 305 216中描述的那一种，参见下述SEQ IDNO6)，Humicola insolens、Rhizomucor miehei脂肪酶(如EP 238023所述)，犁头霉属之种的脂解酶(WO 96/13578)，假丝酵母属脂肪酶(如C.antarctica脂肪酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂肪酶A或B)，假单胞菌属脂肪酶(例如产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌脂肪酶，如EP 218 272中所述；洋葱假单孢菌脂肪酶，如EP 331376中所述；WO95/14783中所公开的假单孢菌脂肪酶)，芽孢杆菌脂肪酶[例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等，(1993)Biochemica etBiophysica acta，1131，253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP64/744992)和短小芽孢杆菌脂肪酶(WO 91/16422)]。其它类型的脂解酶包括角质酶，例如在WO 88/09367中描述的源自门多萨假单胞菌的角质酶，或源自Fusarium solani pisi的角质酶(如在WO 90/09446中所述)。
氧化还原酶漆酶所涉及的漆酶包括Polyporus pinisitus漆酶(WO 96/00290)，毁丝霉属漆酶(WO 95/33836)，Schytalidium属漆酶(WO95/338337)，以及Pyricularia oryzae漆酶(可得自Sigma)。
过氧化物酶所涉及的过氧化物酶包括短小芽孢杆菌过氧化物酶(WO91/05858)，粘球菌科过氧化物酶(WO95/11964)，灰盖鬼伞过氧化物酶(WO95/10602)，以及Arrthromyces ramosus过氧化物酶[Kunishima等(1994)，分子生物学杂志，235，331-344]。
转移酶转谷氨酰胺酶合适的转移酶包括在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中所公开的任何转谷氨酰胺酶。
异构酶蛋白质二硫键异构酶合适的蛋白质二硫键异构酶包括在WO 95/01425(Novo NordiskA/S)中描述的那些PDI，但并不限于此。
聚合分子偶联到多肽上的聚合分子可以是任何合适的聚合分子，包括天然和合成的同聚物[如多元醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)以及聚羧酸(即poly-COOH)]以及杂聚物，即包含一种或多种不同偶联基团(如羟基与胺基)的聚合物。
合适的聚合分子的例子包括选自含有下述各类分子的组中的聚合分子聚烯化氧(PAO)，如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)以及聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚D，L-氨基酸、乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源的白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素以及羟丙基纤维素，聚氨基葡糖的水解产物、淀粉(如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉)、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、支链淀粉、菊粉、合成生物聚合胶(xanthan gum)、角叉菜胶、果胶、藻酸水解产物和生物聚合物。
优选的聚合分子是无毒性的聚合分子，如(m)聚乙二醇((m)PEG)，还要求这些分子共价偶联到酶表面连接基团上的化学方法相对比较简单。
一般看来，聚烯化氧(PAO)(如聚氧化乙烯，如PEG，特别是mPEG)是优选的聚合分子，因为这些聚合分子与多糖(如葡聚糖、支链淀粉等)相比，它们所具有的能交联的活性基团很少。
按照本发明，尽管可以使用所有上述的聚合分子，但优选地使用甲氧基聚乙二醇(mPEG)。这是因为这样的事实甲氧基乙二醇仅具有一个可与酶偶联的活性末端。因而，交联的可能性相对较不明显。而且，这将使产物更均一，聚合分子与酶的反应更容易控制。制备酶变体可以通过任何适当方法构建待偶联的酶变体。本领域内已成功建立了一些方法。例如，可以利用下述文献中的相同材料和方法制备本发明的酶变体WO89/06279(Novo Nordisk A/S)，EP130，756(Genentech)，EP479，870(Novo Nordisk A/S)，EP214，435(Henkel)，WO87/04461(Amgen)，WO87/05050(Genex)，EP申请号87303761(Genentech)，EP260，105(Genencor)，WO88/06624(Gist-Brocades NV)，WO88/07578(Genentech)，WO88/08028(Genex)，WO88/08033(Amgen)，WO88/08164(Genex)，Thomas等(1985)自然，318，375-376；Thomas等(1987)分子生物学杂志，193，803-813；Russel和Fersht(1987)自然，328，496-500。产生定点突变诱变前，必须将编码目的多肤的基因克隆到合适的载体中。下面将介绍在特定位点产生突变的方法。
一旦克隆到了多肽编码基因、鉴定出了进行突变的理想位点，并且决定了用何种残基取代原残基，则可以利用合成寡核苷酸导入这些突变。这些寡核苷酸含有目的突变位点旁侧的核苷酸序列，并且在寡核苷酸合成中插入了突变核苷酸。在一种优选方法中，定点诱变是通过Kammann等[(1989)核酸研究，17(13)，5404]和Sarkar G.和Sommer，S.S.[(1990)，生物技术，8，404-407]所述的SOE-PCR诱变技术进行的。
聚合物的活化如果将与多肽偶联的聚合分子没有活性，就必须使用合适方法使其活化。根据本发明，可以想见，可通过接头将聚合分子与多肽偶联。合适的接头对熟练技术人员是熟知的。
用于活化聚合分子以及用于偶联多肽的方法和化学在文献中有详细描述。一般用于活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能团溴化氰、高碘酸、戊二醛、biepoxides、表氯醇、二乙烯基砜、碳二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等(参见R.F.Taylor，(1991)，“蛋白质固定，基础和应用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白质结合和交联的化学”，CRC出版社，BocaRaton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定的亲和性配体技术”，学院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也适用于可溶性聚合物的活化，如高碘酸，三氯三嗪、磺酰基卤化物、二乙烯基砜、碳二亚胺等。在选择活化与偶联化学方法时，必须考虑聚合物上的官能团是氨基、羟基、巯基、羧基、醛还是硫氢基以及蛋白质上选定的连接基团，活化与偶联化学通常包括i)聚合物的活化，ii)偶联，iii)剩余活性基团的封闭。
下面简要描述许多合适的聚合物活化方法。然而，应该理解也可以使用其它方法。
将聚合分子偶联到多肽的游离酸基团上可以借助于二酰亚胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或重氮基乙酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白质结合和交联化学”，CRC出版社)进行。
将聚合分子偶联到羟基通常是非常困难的，因为这必须在水中进行。而通常水解反应比与羟基的反应更占优势。
将聚合分子偶联到游离硫氢基可以用特定基团(如马来酰亚胺或正吡啶基二硫化物)达到。乙烯基砜(美国专利no.5,414,135，(1995)，Snow等)对于硫氢基也有偏好，但是不象提到的其它化合物那样有选择性。
可以通过包含两个邻近羰基的基团靶向多肽链中的可及精氨酸残基。
涉及将亲电子性地活化的PEG偶联到赖氨酸的氨基上的技术也有用。醇的许多常规离去基团能形成胺键。例如，可以使用烷基磺酸盐，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶学方法，104卷，Jacoby W.B.编，学院出版社Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.65-79；Scouten等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.79-84；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)、甲磺酸盐(Harris，1985，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp 341-352)、芳基磺酸盐(如甲苯磺酸盐)以及对硝基苯磺酸盐。
有机磺酰氯(例如Tresyl Chloride)可有效地将许多聚合物(例如PEG)中的羟基转化成良好的离去基团(磺酸盐)，当与多肽中的亲核基团(如氨基)进行反应时，该离去基团使得可以在聚合物和多肽之间形成稳定的键。除了要有高偶联产率之外，反应条件通常还要求比较温和(中性或微碱性pH值，以避免变性，且活性极少或没有破坏)，并且满足多肽需要的非破坏性条件。
甲苯磺酸盐比甲磺酸盐反应性更强，而且更不稳定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物结合物化学，6，150-165)。环氧衍生物也可以用于产生胺键，但是活性比上述基团弱得多。
用碳酰氯将PEG转化成氯甲酸酯将产生与赖氨酸的氨基甲酸酯键。这一转变可以多种变化形式进行，如用N-羟基琥珀酰亚胺(美国专利no.5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技术应用和生物化学，15，P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物结合物化学，6，62-69)、用咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，pp 309-319)、用对硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1，(1993)，Looze，Y.)等取代氯。通常通过使氯甲酸酯与所需的离去基团反应来制备衍生物。所有这些基团均产生与肽的氨基甲酸酯键。
此外，可以分别使用异氰酸盐和异硫氰酸盐来产生脲和硫脲。
使用如上所述的相同的离去基团和cyclic imid thrones，可以从PEG酸获得酰胺(美国专利no.5,349,001，(1994)，Greenwald等)。这些化合物的反应活性十分高，但是可能会使水解变快。
也可以使用从与琥珀酸酐反应制备的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使偶联物对水解更加敏感得多(美国专利no.5,122,614，(1992)，Zalipsky)。这一基团可以用N-羟基琥珀酰亚胺活化。
此外，可以引入一个特殊的接头。最古老的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化学杂志，252，3578-3581；美国专利no.4,179,337，(1979)，Davis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
将PEG偶联到芳香族胺上，随后重氮化，将产生非常活跃的重氮盐，其在原位即可与肽反应。通过使PEG的吖内酯衍生物(美国专利no.5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)反应，也可以形成酰胺键，这样即可引入一个额外的酰胺键。
由于一些肽不包含许多赖氨酸，因此，将一个以上的PEG连接到同一赖氨酸上可能会是有利的。这可以通过例如使用1，3-二氨基-2-丙醇进行。
也可以通过氨基甲酸酯键将PEG连接到酶的氨基上(WO 95/11924，Greenwald等)。赖氨酸残基也可以用作主链。
实施例中所用的偶联技术是WO90/13590(Enzon)中所述的琥珀酰亚胺碳酸酯偶联技术。制备改良偶联物的方法本发明的又一目的是提供制备改良的多肽-聚合物偶联物的方法，包括以下步骤a)鉴定出位于所讨论的亲本多肽3D结构表面上的氨基酸残基，b)选择出所述亲本多肽的所述3D结构表面上欲进行突变的目标氨基酸残基，c)i)用具有合适连接基团的氨基酸残基取代步骤b)中选定的一个或多个氨基酸残基或者在所选位点插入所述氨基酸残基，和/或
ii)取代或者删除步骤b)中选定的、功能性位点处或者附近的一个或多个氨基酸残基，d)将聚合分子偶联到已突变的多肽上。步骤a)鉴定出位于亲本多肽表面上的氨基酸残基三维结构(3D-结构)为了进行本发明方法，需要有所述亲本多肽的三维结构。这一结构例如可以是X-射线结构、核磁共振结构或建立的模型结构。Brookhaven数据库可以作为X-射线结构和核磁共振结构的来源。
如果与所说的多肽有至少30％序列等同的一种或多种同源多肽的一个或多个3D结构已知，则可由本领域技术人员建立模型结构。有几个软件包可以用来构建模型结构，一个例子是Biosym的Homology95.0软件包。
构建模型结构所需要的典型工作是对已知3D结构的同源序列进行序列对比、确定结构保守区域(SCR)、确定SCR的等同序列、在结构数据库中搜索结构片段/环以取代变异区、确定这些区域的等同序列、通过能量最低化使结构精确化。已知相对于已知的3D结构含有大插入物(≥3个残基)的区域相当难以模拟，必须小心地预测其结构。
获得所说多肽的3D-结构或基于与已知结构的同源性建立的结构模型后，这种结构即可作为必要先决条件用于完成下述方法。步骤b)选出用于突变的目标氨基酸残基根据本发明，选出欲进行突变的目标氨基酸残基，以在多肽表面获得额外或者更少的连接基团，如游离氨基(-NH2)或游离羧酸基团(-COOH)，和/或使多肽表面上的表位更为完全和广泛地受到遮蔽。保守性取代优选在多肽内进行保守性取代，因为保守性取代比较安全，突变对多肽结构的影响有限。
为了提供额外氨基，可以用赖氨酸取代精氨酸，这两种残基都带正电，但仅赖氨酸具有适于用作连接基团的游离氨基。
为提供额外羧酸基团，保守性取代可以是天冬酰胺至天冬氨酸的取代或者谷氨酰胺至谷氨酸的取代。这些残基在大小、形状方面比较相象，只是这种羧酸基团只存在于酸性残基上。
为了减少诸如活性位点处或者附近的连接基团，可以用精氨酸残基取代赖氨酸，等等。
用何种氨基酸进行取代在原则上取决于将要应用的偶联化学。非保守性取代突变也可以对不太/不保守的目标氨基酸残基进行。为了对多肽表面进行比保守性取代所能达到的遮蔽程度更为完全和广泛的遮蔽，这种突变就比较合适。
先用普通术语描述本发明方法，然后再用具体实例进行描述。
注意以下术语的用法连接残基可结合聚合分子的残基，如赖氨酸(氨基)或天冬氨酸/谷氨酸(羧基)。也包括相关的N-或C-末端氨基/羧基。
突变残基待突变的残基，如精氨酸或者天冬酰胺/谷氨酰胺。
必需的催化性残基已知催化功能所必需的残基，如丝氨酸蛋白酶内的催化性三联体。
溶剂暴露型残基定义为，按照Homology 95.0模块内的BIOSYM/INSIGHT算法，至少暴露5％的残基。各指令的顺序如下HomologyProstatAccess_Surf＝＞Solv_Radins 1.4；Heavy atomsonly；Radii source VdW；O utputFractional Area；PolaritysourceDefaul。得到文件名为area.tab的文件。备注为使该程序适当地运行，必须首先将结构中的所有水分子完全除去。
例如，看起来可以是这样的# PD498FINALMODEL# 残基 面积TRP_1 136.275711SER_2 88.188095PRO_3 15.458788ASN_4 95.322319ASP_5 4.903404PRO_6 68.096909TYR_7 93.333252TYR_8 31.791576SER_9 95.983139-- 续1.鉴定出距离最近的连接残基10以上、所处位置距离必需的催化性残基至少8的诸残基。这一残基亚组称作REST，是进行由突变残基至连接残基保守性取代的主要区域。
2.鉴定出位于REST亚组周围0-5的壳内、但距离必需的催化性残基至少8的残基。这一残基亚组称作SUB5B。这是进行由突变残基至连接残基保守性取代的次要区域。因为结合至SUB5B内连接残基上的配体会延伸到REST区内，有可能会阻止表位识别。
3.鉴定出REST和SUB5B内的溶剂暴露型突变残基，作为导入连接残基的潜在突变位点。
4.利用BIOSYM/INSIGHT的生物聚合物模块，取代操作3中鉴定出的残基。
5.重复上述第1-2项操作，得到RESTX亚组。这一亚组包括距离最近的连接残基至少10、所处位置远离必需的催化性残基至少8的那些残基。
6.鉴定出RESTX内的溶剂暴露型残基。它们是进行不太/不保守的突变以导入连接残基的潜在位点。步骤c)取代、插入或删除氨基酸残基可以利用本领域众所周知的标准技术，如定点诱变(参见例如Sambrook等(1989)，Sambook等，分子克隆；实验手册，冷泉港，NY)，进行步骤c)中讨论的突变。
核苷酸取代的一般性描述可见于例如Ford等，1991，蛋白质表达和纯化，2，第95-107页。步骤d)将聚合分子偶联至经修饰的亲本酶上可以通过本领域已知的任何偶联方法，包括上述技术，制备本发明的多肽-聚合物偶联物。
将聚合分子偶联到所讨论的多肽上如果将与多肽偶联的聚合分子没有活性，就必须使用合适方法使其活化。聚合分子可通过接头与多肽偶联。合适的接头对熟练技术人员是熟知的。
用于活化聚合分子以及用于偶联多肽的方法和化学在文献中有详细描述。一般用于活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能团溴化氰、高碘酸、戊二醛、biepoxides、表氯醇、二乙烯基砜、碳二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等(参见R.F.Taylor，(1991)，“蛋白质固定，基础和应用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白质结合和交联的化学”，CRC出版社，BocaRaton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定的亲和性配体技术”，学院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也适用于可溶性聚合物的活化，如高碘酸、三氯三嗪、磺酰基卤化物、二乙烯基砜、碳二亚胺等。在选择活化与偶联化学方法时，必须考虑聚合物上的官能团是氨基、羟基、巯基、羧基、醛还是硫氢基以及蛋白质上选定的连接基团，活化与偶联化学通常包括i)聚合物的活化，ii)偶联，iii)剩余活性基团的封闭。
下面简要描述许多合适的聚合物活化方法。然而，应该理解也可以使用其它方法。
将聚合分子偶联到酶的游离酸基团上可以借助于二酰亚胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或重氮基乙酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白质结合和交联化学”，CRC出版社)进行。
将聚合分子偶联到羟基通常是非常困难的，因为这必须在水中进行。而通常水解反应比与羟基的反应更占优势。
将聚合分子偶联到游离硫氢基可以用特定基团(如马来酰亚胺或正吡啶基二硫化物)达到。乙烯基砜(美国专利no.5,414,135，(1995)，Snow等)对于硫氢基也有偏好，但是不象提到的其它化合物那样有选择性。
可以通过包含两个邻近羰基的基团靶向多肽链中的可及精氨酸残基。
涉及将亲电子性地活化的PEG偶联到赖氨酸的氨基上的技术也有用。醇的许多常规离去基团能形成胺键。例如，可以使用烷基磺酸盐，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶学方法，104卷，Jacoby W.B.编，学院出版社Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.65-79；Scouten等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.79-84；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)、甲磺酸盐(Harris，1985，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp 341-352)、芳基磺酸盐(如甲苯磺酸盐)以及对硝基苯磺酸盐。
有机磺酰氯(例如Tresyl Chloride)可有效地将许多聚合物(例如PEG)中的羟基转化成良好的离去基团(磺酸盐)，当与多肽中的亲核基团(如氨基)进行反应时，该离去基团使得可以在聚合物和多肽之间形成稳定的键。除了要有高偶联产率之外，反应条件通常还要求比较温和(中性或微碱性pH值，以避免变性，且活性极少或没有破坏)，并且满足多肽需要的非破坏性条件。
甲苯磺酸盐比甲磺酸盐反应性更强，而且更不稳定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物结合物化学，6，150-165)。环氧衍生物也可以用于产生胺键，但是活性比上述基团弱得多。
用碳酰氯将PEG转化成氯甲酸酯将产生与赖氨酸的氨基甲酸酯键。这一转变可以多种变化形式进行，如用N-羟基琥珀酰亚胺(美国专利no.5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技术应用和生物化学，15，P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物结合物化学，6，62-69)、用咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，pp 309-319)、用对硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1，(1993)，Looze，Y.)等取代氯。通常通过使氯甲酸酯与所需的离去基团反应来制备衍生物。所有这些基团均产生与肽的氨基甲酸酯键。
此外，可以分别使用异氰酸盐和异硫氰酸盐来产生脲和硫脲。
使用如上所述的相同的离去基团和cyclic imid thrones，可以从PEG酸获得酰胺(美国专利no.5,349,001，(1994)，Greenwald等)。这些化合物的反应活性十分高，但是可能会使水解变快。
也可以使用从与琥珀酸酐反应制备的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使偶联物对水解更加敏感得多(美国专利no.5,122,614，(1992)，Zalipsky)。这一基团可以用N-羟基琥珀酰亚胺活化。
此外，可以引入一个特殊的接头。最古老的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化学杂志，252，3578-3581；美国专利no.4,179,337，(1979)，Davis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
将PEG偶联到芳香族胺上，随后重氮化，将产生非常活跃的重氮盐，其在原位即可与肽反应。通过使PEG的吖内酯衍生物(美国专利no.5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)反应，也可以形成酰胺键，这样即可引入一个额外的酰胺键。
由于一些肽不包含许多赖氨酸，因此，将一个以上的PEG连接到同一赖氨酸上可能会是有利的。这可以通过例如使用1，3-二氨基-2-丙醇进行。
也可以通过氨基甲酸酯键将PEG连接到酶的氨基上(WO 95/11924，Greenwald等)。赖氨酸残基也可以用作主链。连接基团的添加PD498变体-SPEG偶联物的具体例子蛋白酶的一个具体例子是亲本PD498(WO 93/24623，SEQ ID NO.2)。亲本PD498分子量为29kDa。
赖氨酸和精氨酸位置如下所示
离活性位点的距离 精氨酸 赖氨酸0-5 15-1010-15 5 615-20 2 320-25 1 3总共 912发明者观察了亲本PD498表面上的哪些位点适于导入额外的连接基团。
A.亲本PD498中合适的精氨酸至赖氨酸保守性取代可以是R51K，R62K，R121K，R169K，R250K，R28K，R190K中的任一种。
B.亲本PD498中合适的非保守性取代可以是以下取代中的任一种P6K，Y7K，S9K，A10K，Y11K，Q12K，D43K，Y44K，N45K，N65K，G87K，I88K，N209K，A211K，N216K，N217K，G218K，Y219K，S220K，Y221K，G262K。
因为没有赖氨酸残基位于活性位点处或附近，所以无需去除任何连接基团。
可通过本领域已知的将聚合分子偶联到酶上氨基基团的任何偶联技术，用前面提到的任一种PD498变体作为起始材料制备PD498变体-SPEG偶联物。下面介绍一个具体例子。连接基团的去除BPN’变体-SPEG偶联物的具体例子在活性位点有连接基团的蛋白酶的一个具体例子是BPN’，BPN’有11个连接基团(加上一个N-末端氨基基团)，它的分子量为28kDa。赖氨酸和精氨酸残基位置如下距活性位点的距离 精氨酸 赖氨酸0-5 15-10
10-15 1415-20 1420-25 2总共 2 11按照本发明，除去位于距活性位点0-5之内的赖氨酸残基比较有利。具体地说，这可通过K94R取代来完成。
用上述BPN’变体作为起始材料，使用本领域已知的将聚合分子偶联至酶上氨基基团的任何偶联技术，可制备BPN’变体-SPEG偶联物。连接基团的添加和去除Savinase-SPEG偶联物的具体例子如实施例2中所说，按照本发明，可以在亲本Savinase(Von derOsten等人.，(1993)，生物技术杂志，28，p.55+，SEQ ID NO.3)表面上添加数个氨基连接基团，并去除靠近其活性位点的氨基连接基团。
亲本Savinase内的下述取代中的任一种都是诱变的位点R10K，R19K，R45K，R145K，R170K，R186K和R247K。
K94R取代被验明为一适于阻止聚合物连接至活性位点附近的突变。
用任何上述Savinase变体作为起始材料，通过使用本领域中已知的用于偶联聚合分子至酶上氨基基团的任何偶联技术，可制备Savinase变体-SEPG偶联物。连接基团的添加Humicola lanuginosa脂肪酶变体-SPEG偶联物的具体例子将亲本Humicola lanuginosa DSM 4109脂肪酶(见SEQ ID NO.6)作为主链进行取代、免疫原性有所降低的脂肪酶变体具体例子列举如下。
未修饰的亲本Humicola lanuginosa脂肪酶有8个连接基团，包括N-末端NH2基团，它的分子量约为29kDa。A.亲本脂肪酶中，合适的精氨酸到赖氨酸保守性取代可以是以下的任一种R133K、R139K、R160K、R179K、R209K、R118K及R125K。
亲本脂肪酶中合适的非保守性取代可为以下任一种A18K、G31K、T32K、N33K、G38K、A40K、D48K、T50K、E56K、D57K、S58K、G59K、V60K、G61K、D62K、T64K、L78K、N88K、G91K、N92K、L93K、S105K、G106K、V120K、P136K、G225K、L227K、V228K、P229K、P250K、F262K。
Humicola lanuginosa脂肪酶中合适的其它非保守性取代包括E87K或D254K。
以上述脂肪酶变体中任一种作为起始材料，用本领域已知用于偶联聚合分子至酶上氨基基团的任何偶联技术，可制备脂肪酶变体-SPEG偶联物。下面介绍一个具体例子。
下面的实施例12显示，与相应的未修饰亲本酶相比，具有E87K+D254K取代并偶联了S-PEG15,000的Humicola lanuginosa脂肪酶变体偶联物在Balb/c小鼠中的免疫应答有所降低。免疫原性和变应原性免疫原性是一个比“抗原性”和“变应原性”含义更广的词，表示免疫系统对外来物质出现产生的应答。根据诱发的免疫应答的类型，将所说的外来物质称为免疫原、抗原和变应原。
“免疫原”可定义为，当导入动物和人的循环系统时，能激发免疫应答、导致免疫球蛋白形成的物质。
“抗原”一词指，当被识别为异已分子时，其本身即能产生抗体的物质。
另外，“变应原”则可定义为，能通过IgE抗体(人类中，以及动物中具相似效果的分子)引起变应性致敏或变应性应答的抗原。免疫原性的评估皮下注射动物，使免疫原进入循环系统，将其应答与对相应亲本多肽的应答进行比较，即可对免疫原性进行评估。
在本发明的上下文中，人体和动物体的“循环系统”指主要包括心脏和血管的系统。心脏运送必需的能量以保持血管系统中的血液循环。循环系统起着生物体传送系统的功能，血液运送O2、营养物质、激素及对细胞调控比较重要的其它物质至组织中。此外，血液将二氧化碳从组织中排出至肺，将残留物质排出至例如肾中。而且，血液对温度调节及身体的防卫机制(包括免疫系统)具重要作用。
有许多体外动物模型可用于评估多肽的免疫原性潜能。其中一些模型为人体中的危害评估提供了合适的基础。合适的模型包括小鼠模型。
这一模型力求鉴别皮下注射了被修饰和未修饰多肽的Balb/c小鼠中以IgG应答形式表现的免疫原性应答。
还有其它的动物模型可用于免疫原性潜能的评估。
按照本发明，具有“降低的免疫原性”的多肽即指与相应的亲本多肽相比，所述多肽在导入循环系统时，产生的可引起免疫应答的抗体量明显降低，所说的抗体例如是人类的免疫球蛋白及特定动物中具类似作用的分子。
对Balb/c小鼠来说，IgG应答是多肽免疫原性潜能的一个很好的指征。变应原性的评估变应原性的评估可通过吸入试验进行，即比较亲本酶和本发明相应的被修饰酶施用于气管内后产生的效果。
有一些体内动物模型可用于评估酶的变应原性。其中一些模型为人类中的危害评估提供了合适的基础。合适的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。这些模型力求将呼吸性变应原鉴定为在事先致敏的动物中引发刺激反应的函数。根据这些模型，将预计的变应原气管内导入动物中。
豚鼠的一合适品系，Dunkin Hartley品系，不象人类那样产生与变应性应答有关的IgE抗体。可是，它们产生其它类型的抗体-IgG1A和IgG1B(参见例如Prent，ATLA，19，p.8-14，1991)，这些抗体负责对包括酶在内的吸入多肽产生的变应原性应答。因此，在使用Dunkin Hartley动物模型的时候，IgG1A和IgG1B的相对量是变应原性水平的一个衡量尺度。
Balb/c品系小鼠适于进行气管内暴露。Balb/c小鼠产生IgE作为变应性应答。
有关豚鼠和小鼠中呼吸性变应原的评估的更多细节描述于Kimber等人(1996年)，《基础和应用毒理学》，33卷，第1-10页。
其它的动物，如大鼠、兔子等，也可用于类似的研究中。组合物本发明涉及包含本发明中的多肽-聚合物偶联物的组合物。
该组合物可以是药用或工业用组合物。
该组合物可进一步包含其它多肽、蛋白质或酶及/或常用于诸如洗涤剂中的成分，包括肥皂、家用物品、农业化肥，个人护理产品，包括皮肤护理组合物、清洁用组合物(如用于接触性镜片)、口腔和皮肤药用品，还有用于处理纺织品的组合物，用于生产食品(如烘烤)和饲料的组合物，等等。多肽-聚合物偶联物的用途本发明还涉及本发明方法用于降低多肽免疫应答的用途。
本发明的又一目的是利用本发明的多肽-聚合物偶联物来降低工业产品的变应原性，所述工业产品例如是洗涤剂(诸如洗衣、洗盘子及清洗硬表面所用的洗涤剂)，和食品或饲料产品。材料与方法材料酶PD498枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶，可见于WO 93/24623。PD498的序列可见于SEQ ID NO.1和2中。Savinase(来自Novo Nordisk A/S)Humicola lanuginosa脂肪酶可以Lipolase从Novo Nordisk获得，其进一步描述于EP 305,216。其DNA和蛋白质序列分别见于SEQ ID NO.5和6中。菌株枯草芽孢杆菌309和147是迟缓芽孢杆菌的变体，保藏于NCIB，保藏号为NCIB10309和10147，这两个菌株描述于美国专利号3723250中，其公开内容引入本文作为参考文献。
通过常规方法将大肠杆菌MC1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物学杂志，138卷，179-207页)制成r-、m+，该菌株还描述于美国专利申请系列号039,298中。载体pPD498包含编码PD498蛋白酶(SEQ ID NO.2)野生型基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(描述于美国专利号5621089中的6.2.1.6部分)。同一载体可用于在大肠杆菌中进行诱变及在枯草芽孢杆菌中进行表达。一般分子生物学方法除非另外指出，否则DNA操作和转化按分子生物学的标准方法进行(Sambrook等人，(1989)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等人(编)，“现代分子生物学方法”，JohnWiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编)《用于芽孢杆菌的分子生物学方法》，John Wiley和Sons，1990)。
DNA操作中的酶按照产品说明书使用。
材料、化学药品和溶液标记了辣根过氧化物酶的抗大鼠免疫球蛋白(Dako，DK，P162，# 031；稀释度1∶1000)。小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA 193；稀释度1∶200)。大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA 419；稀释度1∶100)。生物素标记的小鼠抗大鼠IgG1单克隆抗体(Zymed 039140；稀释度1∶1000)。生物素标记的大鼠抗小鼠IgG1单克隆抗体(Serotec MCA 336B；稀释度1∶1000)链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(Kirkegard和Perry14-30-00；稀释度1∶1000)Covalink NH2平板(Nunc，目录号459439)氰尿酰氯(Aldrich)丙酮(Merck)大鼠抗小鼠IgG1，生物素(SeroTec.目录号MCA 336B)链霉抗生物素、过氧化物酶(KPL)邻苯二胺(OPD)(Kem-en-Tec)过氧化氢，30％(Merck)吐温20(Merck)脱脂奶粉(Difco)硫酸(Merck)缓冲液和溶液碳酸盐缓冲液(0.1M，pH10(1升))碳酸钠10.60克PBS(pH7.2(1升))氯化钠8.00克氯化钾0.20克磷酸氢二钾1.04克磷酸二氢钾0.32g洗涤缓冲液PBS，0.05％(v/v)吐温20封闭缓冲液PBS，2％(wt/v)脱脂奶粉稀释缓冲液PBS，0.05％(v/v)吐温20，0.5％(wt/v)脱脂奶粉柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH5.0-5.2(1升))柠檬酸钠 20.60克柠檬酸6.30克Covalink平板的活化·配制每毫升丙酮含10mg氰尿酰氯的新鲜母液。·使用前，过搅拌边将氰尿酰氯母液稀释到PBS中至终浓度1mg/ml。·加100ml稀释液至Covalink氨基平板的每一孔中，室温温育5分钟。·用PBS洗3次。·在50℃烘干新制备的活化平板30分钟。·立即用封条将每一平板密封好。·预先活化的平板放在塑料袋中可于室温保存3周。硼酸钠、硼砂(Sigma)3，3-二甲基戊二酸(Sigma)氯化钙(Sigma)Tresyl Chloride(2，2，2-三氟乙磺酰氯)(Fluka)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(Fluka)N-羟基琥珀酰亚胺(Fluka art.56480)碳酰氯(Fluka art.79380)乳糖(Merck 7656)PMSF(苯基甲基磺酰氟)来自Sigma琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰基对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma号S-7388，分子量624.6克/摩尔。生色底物OPD邻苯二胺(Kementec目录号4260)试验动物Dunkin Hartley豚鼠(来自Charles River，DE)雌性Balb/c小鼠(约20克)购自Bomholdtgaard，Ry，丹麦。设备SCEL II(Novex)ELISA读数仪(UVmax，Molecular Devices)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75柱，Mono-Q，Mono S，来自Pharmacia，SW。SLTFotometer，来自SLT LabInstruments大小排阻层析(Spherogel TSK-G 2000 SW)大小排阻层析(Superdex 200，Pharmacia，SW)Amicon室DNA操作用酶除非另外提及，否则DNA操作中所用的所有酶均来自New EnglandsBiolabs.Inc.，如限制性内切酶、连接酶等。方法测定IgG1阳性豚鼠的ELISA步骤用以1∶8000稀释度稀释于碳酸盐缓冲液的兔抗PD498包被ELISA微量滴定板，4℃放置过夜。第二天这些板用2％ BSA封闭1小时，再用PBS吐温20洗3次。
将1μg/ml的PD498加入板中，保温1小时，然后用PBS吐温20洗3次。
所有的豚鼠血清样品及对照都以2μl血清加98μl PBS加到ELISA平板上，保温1小时，再用PBS吐温20洗3次。
然后将山羊抗豚鼠IgG1(1∶4000稀释于PBS缓冲液(NordicImmunology 44-682))加到平板上，保温1小时，用PBS吐温20洗涤。
将碱性磷酸酶标记的兔抗山羊抗体(Sigma A4187)1∶8000稀释度样品加入滴定板上并保温1小时，在PBS吐温20中洗两次，再用二乙醇胺缓冲液洗1次。
用对硝基苯基磷酸酯在37℃保温30分钟、或直至合适的颜色显现，从而对标记的碱性磷酸酶进行显色。
用终止液(含EDTA的K2HPO4/HaH3缓冲液，pH10)终止反应，并于ELISA读数仪上读取OD 405/650数值。
双盲法被用于所有的ELISA滴定板上。
阳性和阴性血清值计算成平均盲值加两倍标准误差。这样精确度为95％。分子量的测定用标准方法在4-20％的梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上进行蛋白质的电泳分离。蛋白质用银染法检测。以来自Novex的Mark-12大范围分子量标准的迁移率为参照估测分子量。蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa进行分析蛋白酶切开肽和对硝基苯胺之间的键，从而使其呈现可见的黄颜色，吸收值在405nm。
缓冲液如Britton和Robinson缓冲液pH8.3。
底物100mg的Suc-AAPF-pNa溶于1ml二甲亚砜(DMSO)中。用Britton和Robinson缓冲液将其中的100μl稀释至10ml。
将底物与蛋白酶溶液混和，并检测其在405nm处的吸收值，作为时间和ABS405nm/分钟的一个函数。要求控制温度(约20-50℃，具体取决于所用的蛋白酶)。这是对样品中蛋白酶活性的一个估计。蛋白水解活性在本发明的上下文中，蛋白水解活性用Kilo Novo蛋白酶单位(KNPU)表示。相对于酶标准(SAVINASE)测定活性，依据蛋白水解酶在标准条件(即50℃，pH8.3，9分钟的反应时间，3分钟的检测时间)对二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化程度进行测定。如果索要，可从丹麦的Novo NordiskA/S得到一有关的折迭式印刷品AF 220/1，此印刷品特此收录于文献中。
一个GU是一个甘氨酸单位，定义为标准条件下，以N-乙酰酪蛋白为底物，40℃保温15分钟后，产生的NH2(氨基)基团量相当于1mmole甘氨酸的蛋白酶活性。
也可用PNA检测方法，根据与可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基苯酚的反应估测酶活性，此法可见于《美国石油化学协会杂志》，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.，和Smith，L.A.，(1988)。PD498变体的发酵30℃下，于旋转式摇床上(300rpm)，在含有100ml BPX培养液的500ml带挡板锥形瓶中摇5天，对枯草芽孢杆菌中的PD498变体进行发酵。为了得到例如2升培养液，可用20个锥形瓶同时进行发酵。培养基BPX组成(每升)马铃薯淀粉 100克磨碎大麦50克大豆粉 20克Na2HPO4·12H2O 9克Pluronic 0.1克酪蛋白酸钠 10克培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，将此培养基在120℃加热45分钟进行灭菌。灭菌后，通过加入碳酸氢钠至0.1M而将培养基的pH调至9。PD498变体的提纯将近1.6升的PD498变体发酵液用1升离心杯于5000rpm离心35分钟。上清液用10％的乙酸将pH调至7.0，并用Seitz Supra S100滤板进行过滤。用配备了Amicon S1Y100 UF柱体的Amicon CH2A UF装置将滤液浓缩至约400ml。离心和过滤UF浓缩液后，使其在室温吸附于pH7的杆菌肽亲和柱上。用含25％2-丙醇和1M氯化钠的缓冲液室温下将PD498变体从杆菌肽柱上洗脱下来，此缓冲液还包含0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙，pH为7。
将杆菌肽纯化步骤中有蛋白酶活性的级分合并起来，加到用含0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙(pH6.0)的缓冲液平衡好的750ml Sephadex G25柱(直径5cm)内。
将收集自Sephadex G25柱的具蛋白水解活性的级分合并起来，加到用含0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙(pH6.0)的缓冲液平衡好的150ml CM Sepharose CL6B阳离子交换柱(直径5厘米)上。
用1升相同缓冲液中含线性梯度0-0.5M氯化钠的溶液将蛋白酶洗脱下来。
将收集自CM Sepharose柱的含蛋白酶的级分合并在一起，用2μ滤器过滤。Balb/C小鼠IgG ELISA步骤·用碳酸盐缓冲液稀释抗原至1mg/ml。·每一孔中加100ml。·4℃包被板过夜。·将200ml封闭缓冲液加入每一孔中，室温温育1小时，以封闭非特异性吸收。·用300ml洗涤缓冲液洗平板3次。·将未知的小鼠血清稀释于稀释缓冲液中，通常稀释10倍、20倍和40倍，或者更高倍数。·将100ml加入每一孔中。·在室温保温1小时。·用洗涤缓冲液洗涤3次，以去除未结合的物质。·用稀释缓冲液将抗小鼠IgG1抗体稀释2000倍。·将100ml加入每一孔中。·室温保温1小时。·用洗涤缓冲液洗涤3次，以去除未结合的物质。·用稀释缓冲液稀释链霉亲和素1000倍。·将100ml加入每一孔中。·室温保温1小时。·用300ml洗涤缓冲液洗涤3次，以除去未结合的物质。·将OPD(0.6mg/ml)和过氧化氢(0.4ml/ml)溶解于柠檬酸盐缓冲液中。·将100ml加入每一孔中。·室温保温10分钟。·加入100ml硫酸终止反应。·滴定板置仪器上读取492nm吸收值，以620nm吸收值为参照。小鼠的免疫用本领域已知的标准步骤将上述修饰或未修饰多肽通过皮下注射免疫Balb/c小鼠(20克)10次(每次间隔14天)。
实施例实施例1PD498中适于添加氨基连接基团(-NH2)的合适取代基于与Thermitase(2tec.pdb)59％的序列同一性，如上所述构造亲本PD498的三维结构模型。
PD498的序列可见于SEQ ID NO.2。PD498的残基编号为1-280。
Insight(BIOSYM)中执行的指令可见于以下的指令文件makeKzone.bcl和makeKzone2.bcl保守性取代makeKzone.bcl1 Delete Subset *2 Color Molecule Atoms * Specified Specification 55，0，2553 Zone Subset LYSlysNZ Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，04 Zone Subset NTERM1N Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，05 #NOTEeditnextline ACTSITE residues according to theprotein6 Zone Subset ACTSITE39，72，226 Static monomer/residue 8Color_Subset 255，255，07 Combine Subset ALLZONE Union LYS NTERM8 Combine Subset ALLZONE Union ALLZONE ACTSITE9 #NOTEeditnextline object name according to the protein10 Combine Subset REST Difference PD498FINALMODEL ALLZONE11 List Subset REST Atom Output_File restatom.list12 List Subset REST monomer/residue Output_File restmole.list13 Color Molecule Atoms ACTSITE Specified Specification 255，0，014 List Subset ACTSITE Atom Output_File actsiteatom.list15 List Subset ACTSITE monomer/residue Output_Fileactsitemole.list16 #17 Zone Subset REST5A REST Static Monomer/Residue 5 -Color_Subset18 Combine Subset SUB5A Difference REST5A ACTSITE19 Combine Subset SUB5B Difference SUB5A REST20 Color Molecule Atoms SUB5B Specified Specification255，255，25521 List Subset SUB5B Atom Output_File sub5batom.list22 List Subset SUB5B monomer/residue Output_File sub5bmole.list23 #Now identify sites for lys→arg substitutions and continuewith makezone2.bcl24 #Use grep command to identify ARG in restatom.list，sub5batom.list & accsiteatom.list说明第1-8行ALLZONE亚组定义为所处位置距离赖氨酸上游离氨基或N-末端10以内，或者距离催化性三联体残基39、72和226 8以内的那些残基。
第10行REST亚组定义为不包括在ALLZONE内的那些残基。
第17-20行SUB5B亚组定义为位于REST周围一个5的壳内、除去距离催化性残基8以内的残基的那些残基。
第23-24行REST包含Arg62和Arg169，SUB5B包含Arg51，Arg121和Arg250。ACTSITE包含Arg103，但位置103距离必需的催化性残基在8以内，因此并不相关。
彩色残基有(255，0，255)＝深红色，(255，255，0)黄色，(255，0，0)红色，和(255，255，255)＝白色。
已鉴定出R51K，R62K，R121K，R169K和R250K这些取代是亲本PD498中适于诱变的一些合适位点。在下面的第2部分将对这些残基进行取代，并进一步分析非保守性取代makeKzone2.bcl1 #sourcefile makezone2.bcl Claus von der Osten 9611282 #3 #having scanned lists (grep arg command)and identifiedsites for lys→arg substitutions4 #NOTEeditnextline object name according to protein5 Copy Object -To_Clipboard -Displace PD498FINALMODELnewmodel6 Biopolymer7 #NOTEeditnextline object name according to protein8 Blank Object On PD498FINALMODEL9 #NOTEeditnextlines with lys→arg positions10 Replace Residue newmodel51 lys L11 Replace Residue newmodel62 lys L12 Replace Residue newmodel121 lys L13 Replace Residue newmodel169 lys L14 Replace Residue newmodel250 lys L15 #16 #Now repeat analysis done prior to arg→lys，now includingintroduced lysines17 Color Molecule Atoms newmodel Specified Specification255，0，25518 Zone Subset LYSx newmodellysNZ Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，019 Zone Subset NTERMx newmodellN Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，020 #NOTEeditnextline ACTSITEx residues according to theprotein21 Zone Subset ACTSITEx newmodel39，72，226 Staticmonomer/residue 8 Color_Subset 255，255，022 Combine Subset ALLZONEx Union LYSx NTERMx23 Combine Subset ALLZONEx Union ALLZONEx ACTSITEx24 Combine Subset RESTx Difference newmodel ALLZONEx25 List Subset RESTx Atom Output_File restxatom.list26 List Subset RESTx monomer/residue Output_Filerestxmole.list27 #28 Color Molecule Atoms ACTSITEx Specified Specification255，0，029 List Subset ACTSITEx Atom Output File actsitexatom.list30 List Subset ACTSITEx monomer/residue Output_Fileactsitexmole.list31 #32 #read restxatom.list or restxmole.list to identify sitesfor (not_arg)→lys subst.if needed说明第1-15行REST和SUB5B亚组中溶剂暴露型精氨酸被赖氨酸所取代。精氨酸取代后，重新计算溶剂可及性。
第16-23行ALLZONEx亚组定义为所处位置距离赖氨酸(取代后)上游离氨基或N-末端10以内、或者距离催化性三联体残基39、72和226 8以内的那些残基。
第24-26行RESTx亚组定义为不包括在ALLZONEx内的那些残基，即仍有可能构成表位的残基。在RESTx亚组内，下述残基暴露程度＞5％(见下表)6-7，9-12，43-45，65，87-88，209，211，216-221，262。
建议在亲本PD498内进行下述突变P6K，Y7K，S9K，A10K，Y11K，Q12K，D43K，Y44K，N45K，N65K，G87K，I88K，N209K，A211K，N216K，N217K，G218K，Y219K，S220K，Y221K，G262K。
实施例1中的有关数据PD498MODEL的溶剂可及性数据#PD498MODEL Fri Nov 29 102448 MET 1996#残基 面积TRP_1 136.275711SER_2 88.188095PRO_3 15.458788ASN_4 95.322319ASP_5 4.903404PRO_6 68.096909TYR_7 93.333252TYR_8 31.791576SER_9 95.983139ALA_10 77.983536TYR_11 150.704727GLN_12 26.983349TYR_13 44.328232GLY_14 3.200084PRO_15 2.149547GLN_16 61.385445ASN_17 37.776707THR_18 1.237873SER_19 41.031750THR_20 4.321402PRO_21 16.658991ALA_22 42.107288ALA_23 0.000000TRP_24 3.713619ASP_25 82.645493VAL_26 74.397812THR_27 14.950654ARG_28 110.606209GLY_29 0.242063SER_30 57.225292SER_31 86.986198THR_32 1.928865GLN_33 42.008949THR_34 0.502189VAL_35 0.268693ALA_36 0.000000VAL_37 5.255383LEU_38 1.550332ASP_39 3.585718SER_40 2.475746GLY_41 4.329043VAL_42 1.704864ASP_43 25.889742TYR_44 89.194855ASN_45 109.981819HIS_46 0.268693PRO_47 66.580925ASP_48 0.000000LEU_49 0.770882ALA_50 49.618046ARG_51 218.751709LYS_52 18.808538VAL_53 39.937984ILE_54 98.478104LYS_55 103.612228GLY_56 17.199390TYR_57 67.719147ASP_58 0.000000PHE_59 40.291119ILE_60 50.151962ASP_61 70.078888ARG_62 166.777557ASP_63 35.892376ASN_64 120.641953ASN_65 64.982895PRO_66 6.986028MET_67 58.504269ASP_68 28.668840LEU_69 104.467468ASN_70 78.460953GLY_71 5.615932HIS_72 43.158905GLY_73 0.268693THR_74 0.000000HIS_75 0.484127VAL_76 1.880854ALA_77 0.000000GLY_78 0.933982THR_79 9.589676VAL_80 0.000000ALA_81 0.000000ALA_82 0.000000ASP_83 46.244987THR_84 27.783333ASN_85 75.924225ASN_86 44.813908GLY_87 50.453152ILE_88 74.428070GLY_89 4.115077VAL_90 6.717335ALA_91 2.872341GLY_92 0.233495MET_93 5.876057ALA_94 0.000000PRO_95 17.682203ASP_96 83.431740THR_97 1.506567LYS_98 72.674973ILE_99 4.251006LEU_1006.717335ALA_1010.806080VAL_1021.426676ARG_1032.662697VAL_1042.171855LEU_10518.808538ASP_10652.167435ALA_10752.905663ASN_108115.871315GLY_10930.943356SER_11057.933651GLY_11150.705326SER_11256.383320LEU_11371.312195ASP_114110.410919SER_115 13.910152ILE_116 22.570246ALA_117 5.642561SER_118 29.313131GLY_119 0.000000ILE_120 1.343467ARG_121 118.391129TYR_122 44.203033ALA_123 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PD498FINALMODELTYR219N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELSER 220N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTYR221N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELVAL 232N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELALA 233N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELGLY 262N，CA，C，OPD498FINALMODELCA E282HCASubset SUB5Bsub5bmole.listSubset SUB5BPD498FINALMODEL4-5，8，13-16，34-35，47-51，53，64，83，85-86，90-91，120-124，PD498FINALMODEL128-130，140-141，143-144，147-148，151-152，156-157，PD498FINALMODEL165，167-168，172，175-176，178-179，196，200-205，208，PD498FINALMODEL234-237，250，253-254，260-261，263-267，272，E281H，PD498FINALMODELE283Hsub5batom.listSubset SUB5BPD498FINALMODELASN 4N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELASP 5N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELTYR8N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELTYR13N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELGLY 14N，CA，C，OPD498FINALMODELPRO 15N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELGLN 16N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2PD498FINALMODELTHR 34N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELVAL 35N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELPRO 47N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELASP 48N，CA， C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELLEU 49N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELALA 50N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELARG51N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2PD498FINALMODELVAL 53N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELASN 64N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELASP 83N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELASN 85N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELASN 86N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELVAL 90N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELALA 91N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELILE 120N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELARG121N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2PD498FINALMODELTYR122N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELALA 123N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 124N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 128N，CA，C，O，CB
PD498FINALMODELLYS 129N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZPD498FINALMODELVAL 130N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELASN 140N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELSER 141N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTHR 143N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELLEU 144N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELALA 147N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 148N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELALA 151N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELTRP52N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，NE1，CE2，CE3，CZ2，CZ3，CH2PD498FINALMODELALA 156N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 157N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELASP 165N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELVAL 167N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELSER 168N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELGLN172N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2PD498FINALMODELSER 175N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTYR176N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELASN 178N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELALA 179N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELASN 196N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELTRP200N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，NE1，CE2，CE3，CZ2，CZ3，CH2PD498FINALMODELVAL 201N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELASP 202N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELVAL 203N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELTHR 204N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELALA 205N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 208N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELGLY 234N，CA，C，OPD498FINALMODELLEU 235N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELALA 236N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 237N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELARG250N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2PD498FINALMODELILE 253N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELGLU254N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2PD498FINALMODELILE 260N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELSER 261N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTHR 263N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELGLY 264N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 265N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELASN 266N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELPHE267N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZPD498FINALMODELILE 272N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELCA E281HCAPD498FINALMODELCA E283HNASubset ACTSITEactsitemole.listSubset ACTSITEPD498FINALMODEL36-42，57-60，66-80，100-110，115-116，119，132-136，160-164，PD498FINALMODEL182-184，194，206-207，210，212-215，222-231actsiteatom.listSubset ACTSITEPD498FINALMODELALA 36N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 37N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELLEU 38N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELASP 39N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELSER 40N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELGLY 41N，CA，C，OPD498FINALMODELVAL 42N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELTYR57N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELASP 58N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELPHE59N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZPD498FINALMODELILE 60N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELPRO 66N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELMET 67N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEPD498FINALMODELASP 68N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELLEU 69N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELASN 70N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELGLY 71N，CA，C，OPD498FINALMODELHIS72N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2PD498FINALMODELGLY 73N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 74N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELHIS75N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2PD498FINALMODELVAL 76N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELALA 77N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELGLY 78N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 79N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELVAL 80N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELLEU 100N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELALA 101N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 102N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELARG103N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2PD498FINALMODELVAL 104N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELLEU 105N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELASP 106N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELALA 107N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELASN 108N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELGLY 109N，CA，C，OPD498FINALMODELSER 110N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELSER 115N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELILE 116N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELGLY 119N，CA，C，OPD498FINALMODELASN 132N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELLEU 133N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELSER 134N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELLEU 135N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2
PD498FINALMODELGLY 136N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 160N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 161N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 162N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELGLY 163N，CA，C，OPD498FINALMODELASN 164N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELVAL 182N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELGLY 183N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 184N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELPHE194N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZPD498FINALMODELPRO 206N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELGLY 207N，CA，C，OPD498FINALMODELILE 210N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELSER 212N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTHR 213N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELVAL 214N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELPRO 215N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELMET 222N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEPD498FINALMODELSER 223N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELGLY 224N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 225N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELSER 226N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELMET 227N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEPD498FINALMODELALA 228N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELSER 229N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELPRO 230N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELHIS231N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2Subset RESTxrestxmole.listSubset RESTXNEWMODEL6-7，9-12，43-46，65，87-89，131，173，209，211，216-221，232-233，NEWMODEL262，E282Hrestxatom.listSubset RESTXNEWMODELPRO 6N，CA，CD，C，O，CB，CGNEWMODELTYR7N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHNEWMODELSER 9N，CA，C，O，CB，OGNEWMODELALA 10N，CA，C，O，CBNEWMODELTYR11N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHNEWMODELGLN 12N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2NEWMODELASP 43N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2NEWMODELTYR44N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHNEWMODELASN 45N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELHIS 46N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2NEWMODELASN 65N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELGLY 87N，CA，C，ONEWMODELILE 88N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1NEWMODELGLY 89N，CA，C，ONEWMODELLEU 131N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2
NEWMODELPRO 173N，CA，CD，C，O，CB，CGNEWMODELASN 209N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELALA 211N，CA，C，O，CBNEWMODELASN 216N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELASN 217N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELGLY 218N，CA，C，ONEWMODELTYR219N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHNEWMODELSER 220N，CA，C，O，CB，OGNEWMODELTYR221N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHNEWMODELVAL 232N，CA，C，O，CB，CG1，CG2NEWMODELALA 233N，CA，C，O，CBNEWMODELGLY 262N，CA，C，ONEWMODELCA E282HCA实施例2Savinase中适于添加氨基连接基团(-NH2)的合适取代利用Savinase的已知X-射线结构，找出在何处可以添加合适的氨基连接基团(Betzel等，1992，分子生物学杂志，223，427-445)。
在Brookhaven数据库中，可以1svn.pbd的文件名得到Savinase的3D结构。
Savinase的序列示于SEQ ID NO3中。所用的序列编号与枯草杆菌蛋白酶BPN’中的一致，相对于BPN’，Savinase在36、56、158-159和163-164这些位置处存在缺失。活性位点残基(功能性位点)是D32、H64和S221。
Insight(BIOSYM)中运行的各个指令示于下述指令文件makeKzone.bcl和makeKzone2.bcl中保守性取代makeKzone.bclDelete Subset *Color Molecule Atoms * Specified Specification 255，0，255Zone Subset LYSlysNZ Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0Zone Subset NTERMe1N Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0#NOTEeditnextline ACTSITE residues according to the proteinZone Subset ACTSITEe32，e64，e221 Static monomer/residue 8Color_Subset 255，255，0Combine Subset ALLZONE Union LYS NTERMCombine Subset ALLZONE Union ALLZONE ACTSITE#NOTEeditnextline object name according to the proteinCombine Subset REST Difference SAVI8 ALLZONEList Subset REST Atom Output File_restatom.listList Subset REST monomer/residue Output_File restmole.listColor Molecule Atoms ACTSITE Specified Specification 255，0，0List Subset ACTSITE Atom Output_File actsiteatom.listList Subset ACTSITE monomer/residue Output_Fileactsitemole.list#Zone Subset REST5A REST Static Monomer/Residue 5 -Color SubsetCombine Subset SUB5A Difference REST5A ACTSITECombine Subset SUB5B Difference SUB5A RESTColor Molecule Atoms SUB5B Specified Specification 255，255，255List Subset SUB5B Atom Output_File sub5batom.listList Subset SUB5B monomer/residue Output_File sub5bmole.list#Now identify sites for lys→arg substitutions and continuewith makezone2.bcl#Use grep command to identify ARG in restatom.list，sub5batom.list & accsiteatom.list说明在Savinase的情形下，REST包含精氨酸Arg10，Arg170和Arg186，SUB5B包含Arg19，Arg45，Arg145和Arg247。
这些残基均是溶剂暴露型的。已鉴定出Savinase内R10K，R19K，R45K，R145K，R170K，R186K和R247K这些取代是适于进行本发明范围内诱变的一些位点。在下述第2部分将对这些残基进行取代，并进一步分析。ACTSITE亚组包含Lys94。
K94R这个取代是能除去作为活性位点附近连接基团的赖氨酸的一个突变。
非保守性取代makeKzone2.bcl#sourcefile makezone2.bcl Claus von der Osten 961128##having scanned lists(grep arg command) and identified sitesfor lys→arg substitutions#NOTEeditnextline object name according to proteinCopy Object -To_Clipboard -Displace SAVI8 newmodelBiopolymer#NOTEeditnextline object name according to proteinBlank Object On SAVI8#NOTEeditnextlines with lys→arg positionsReplace Residue newmodele10 lys LReplace Residue newmodele170 lys LReplace Residue newmodele186 lys LReplace Residue newmodele19 lys LReplace Residue newmodele45 lys LReplace Residue newmodele145 lys LReplace Residue newmodele241 lys L##Now repeat analysis done prior to arg→lys，now includingintroduced lysinesColor Molecule Atoms newmodel Specified Specification 255，0，255Zone Subset LYSx newmodellysNZ Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0Zone Subset NTERMx newmodele1N Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0#NOTEeditnextline ACTSITEx residues according to the proteinZone Subset ACTSITEx newmodele32，e64，e221 Staticmonomer/residue 8 Color_Subset 255，255，0Combine Subset ALLZONEx Union LYSx NTERMxCombine Subset ALLZONEx Union ALLZONEx ACTSITExCombine Subset RESTx Difference newmodel ALLZONExList Subset RESTx Atom Output_File restxatom.listList Subset RESTx monomer/residue Output_File restxmole.list#Color Molecule Atoms ACTSITEx Specified Specification 255，0，0List Subset ACTSITEx Atom Output_File actsitexatom.listList Subset ACTSITEx monomer/residue Output_Fileactsitexmole.list##read restxatom.list or restxmole.list to identify sites for(not_arg)→lys subst. if needed说明在RESTx亚组内，下述残基暴露程度＞5％(见下表)5，14，22，38-40，42，75-76，82，86，103-105，108，133-135，137，140，173，204，206，211-213，215-216，269。建议在Savinase中进行下述突变P5K，P14K，T22K，T38K，H39K，P40K，L42K，L75K，N76K，L82K，P86K，S103K，V104K，S105K，A108K，A133K，T134K，L135K，Q137K，N140K，N173K，N204K，Q206K，G211K，S212K，T213K，A215K，S216K，N269K。
实施例2的有关数据SAVINASE中的溶剂可及性数据# SAVI8NOH2O Fri Nov 29 133207 MET 1996#残基 面积ALA_1 118.362808GLN_2 49.422764SER_3 61.982887VAL_4 71.620255PRO_5 21.737535TRP_6 58.718731GLY_7 4.328117ILE_8 6.664074SER_9 60.175900ARG_1070.928963VAL_112.686934GLN_1272.839996ALA_130.000000PRO_1452.308453ALA_15 38.300892ALA_16 0.000000HIS_17 41.826324ASN_18 136.376602ARG_19 105.678642GLY_20 48.231510LEU_21 17.196377THR_22 36.781742GLY_23 0.000000SER_24 64.151276GLY_25 50.269905VAL_26 4.030401LYS_27 54.239555VAL_28 0.000000ALA_29 0.000000VAL_30 3.572827LEU_31 0.233495ASP_32 1.074774THR_33 1.973557GLY_34 3.638052ILE_35 8.044439SER_36 8.514903THR_37 122.598907HIS_38 18.834011PRO_39 76.570526ASP_40 0.000000LEU_41 19.684013ASN_42 88.870216ILE_43 56.117710ARG_44 110.647194GLY_45 26.935413GLY_46 35.515778ALA_47 21.495472SER_48 34.876190PHE_49 52.647541VAL_50 23.364208PRO_51 110.408752GLY_52 80.282906GLU_53 43.033707PRO_54 124.444336SER_55 60.284889THR_56 47.103241GLN_57 120.803505ASP_58 12.784743GLY_59 61.742443ASN_60 56.760231GLY_61 1.576962HIS_62 38.590118GLY_63 0.000000THR_64 0.537387HIS_65 0.968253VAL_66 1.612160ALA_67 0.000000GLY_68 2.801945THR_69 9.074596ILE_70 0.000000ALA_71 4.577205ALA_72 0.000000LEU_73 47.290039ASN_74 102.187248ASN_75 60.210400SER_76 84.614494ILE_77 66.098572GLY_78 17.979534VAL_79 5.642561LEU_80 13.025185GLY_81 0.000000VAL_82 0.268693ALA_83 0.000000PRO_84 18.193810SER_85 56.839039ALA_86 13.075745GLU_87 37.011765LEU_88 2.149547TYR_89 30.633518ALA_90 1.343467VAL_91 0.779450LYS_92 5.862781VAL_93 0.466991LEU_94 10.747736GLY_95 8.707102ALA_96 41.414677SER_97 96.066040GLY_98 33.374485SER_99 67.664116GLY_100 35.571117SER_101 54.096992VAL_102 52.695324SER_103 62.929684SER_104 8.683097ILE_105 15.852910ALA_106 14.509443GLN_107 94.463066GLY_108 0.000000LEU_109 0.537387GLU_110 63.227707TRP_111 55.500740ALA_112 0.502189GLY_113 11.908267ASN_114 107.208527ASN_115 78.811234GLY_116 41.453194MET_117 9.634291HIS_118 54.022118VAL_119 5.105174ALA_120 0.268693ASN_121 0.233495LEU_122 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SUB5BSAVI8E2-E4，E16，E19-E21，E23-E24，E28，E37，E41，E44-E45，E77-E81，E87-E88，SAVI8E90，E113-E114，E117-E118，E120-E121，E145-E148，E169，E172，E174-E176，SAVI8E193-E196，E198-E199，E214，E231-E234，E236，E243，E247，E250，E253-E254，SAVI8E260，E263-E266，E270-E273，M276H-M277Hsub5batom.listSubset SUB5BSAVI8GLN E2N，CA，NE2，OE1，CD，CG，CB，C，OSAVI8SER E3N，CA，OG，CB，C，OSAVI8VAL E4N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8ALA E16N，CA，CB，C，OSAVI8ARG E19N，CA，NH2，NH1，CZ，NE，CD，CG，CB，C，OSAVI8GLY E20N，CA，C，OSAVI8LEU E21N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E23N，CA，C，OSAVI8SER E24N，CA，OG，CB，C，OSAVI8VAL E28N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8SER E37N，CA，OG，CB，C，OSAVI8ASP E41N，CA，OD2，OD1，CG，CB，C，OSAVI8ILE E44N，CA，CD1，CG1，CB，CG2，C，OSAVI8ARG E45N，CA，NH2，NH1，CZ，NE，CD，CG，CB，C，OSAVI8ASN E77N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，OSAVI8SER E78N，CA，OG，CB，C，OSAVI8ILE E79N，CA，CD1，CG1，CB，CG2，C，OSAVI8GLY E80N，CA，C，OSAVI8VAL E81N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8SER E87N，CA，OG，CB，C，OSAVI8ALA E88N，CA，CB，C，OSAVI8LEU E90N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，OSAVI8TRP E113N，CA，CD2，CE2，NE1，CD1，CG，CE3，CZ3，CH2，CZ2，CB，C，OSAVI8ALA 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E263N，CA，OH，CZ，CD2，CE2，CE1，CD1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E264N，CA，C，OSAVI8SER E265N，CA，OG，CB，C，OSAVI8GLY E266N，CA，C，OSAVI8ALA E270N，CA，CB，C，OSAVI8GLU E271N，CA，OE2，OE1，CD，CG，CB，C，OSAVI8ALA E272N，CA，CB，C，OSAVI8ALA E273N，CA，CB，C，OSAVI8ION M276HCASAVI8ION M277HCASubset ACTSITEactsitemole.listSubset ACTSITESAVI8E29-E35，E48-E51，E54，E58-E72，E91-E102，E106-E107，E110，E123-E127，SAVI8E151-E155，E177-E179，E189，E201-E202，E205，E207-E210，E217-E226actsiteatom.listSubset ACTSITESAVI8ALA E29N，CA，CB，C，OSAVI8VAL E30N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8LEU E31N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，OSAVI8ASP E32N，CA，OD2，OD1，CG，CB，C，OSAVI8THR E33N，CA，CG2，OG1，CB，C，OSAVI8GLY E34N，CA，C，OSAVI8ILE E35N，CA，CD1，CG1，CB，CG2，C，OSAVI8ALA E48N，CA，CB，C，OSAVI8SER E49N，CA，OG，CB，C，OSAVI8PHE E50N，CA，CD2，CE2，CZ，CE1，CD1，CG，CB，C，OSAVI8VAL E51N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8GLU E54N，CA，OE2，OE1，CD，CG，CB，C，OSAVI8THR E58N，CA，CG2，OG1，CB，C，OSAVI8GLN E59N，CA，NE2，OE1，CD，CG，CB，C，OSAVI8ASP E60N，CA，OD2，OD1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E61N，CA，C，OSAVI8ASN E62N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E63N，CA，C，OSAVI8HIS E64N，CA，CD2，NE2，CE1，ND1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E65N，CA，C，OSAVI8THR E66N，CA，CG2，OG1，CB，C，OSAVI8HIS E67N，CA，CD2，NE2，CE1，ND1，CG，CB，C，OSAVI8VAL E68N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8ALA E69N，CA，CB，C，OSAVI8GLY E70N，CA，C，OSAVI8THR E71N，CA，CG2，OG1，CB，C，OSAVI8ILE E72N，CA，CD1，CG1，CB，CG2，C，OSAVI8TYR E91N，CA，OH，CZ，CD2，CE2，CE1，CD1，CG，CB，C，OSAVI8ALA E92N，CA，CB，C，OSAVI8VAL E93N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8LYS E94N，CA，NZ，CE，CD，CG，CB，C，OSAVI8VAL E95N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8LEU E96N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E97N，CA，C，OSAVI8ALA E98N，CA，CB，C，OSAVI8SER E99N，CA，OG，CB，C，OSAVI8GLY E100N，CA，C，OSAVI8SER E101N，CA，OG，CB，C，OSAVI8GLY E102N，CA，C，OSAVI8SER E106N，CA，OG，CB，C，OSAVI8ILE E107N，CA，CD1，CG1，CB，CG2，C，OSAVI8GLY E110N，CA，C，OSAVI8ASN E123N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，OSAVI8LEU E124N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，OSAVI8SER E125N，CA，OG，CB，C，OSAVI8LEU E126N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E127N，CA，C，OSAVI8ALA E151N，CA，CB，C，OSAVI8ALA E152N，CA，CB，C，OSAVI8SER E153N，CA，OG，CB，C，OSAVI8GLY E154N，CA，C，OSAVI8ASN E155N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，O
SAVI8VAL E177N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8GLY E178N，CA，C，OSAVI8ALA E179N，CA，CB，C，OSAVI8PHE E189N，CA，CD2，CE2，CZ，CE1，CD1，CG，CB，C，OSAVI8PRO E201N，CD，CA，CG，CB，C，OSAVI8GLY E202N，CA，C，OSAVI8VAL E205N，CA，CG2，CG1，CB，C，OSAVI8SER E207N，CA，OG，CB，C，OSAVI8THR E208N，CA，CG2，OG1，CB，C，OSAVI8TYR E209N，CA，OH，CZ，CD2，CE2，CE1，CD1，CG，CB，C，OSAVI8PRO E210N，CD，CA，CG，CB，C，OSAVI8LEU E217N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，OSAVI8ASN E218N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，OSAVI8GLY E219N，CA，C，OSAVI8THR E220N，CA，CG2，OG1，CB，C，OSAVI8SER E221N，CA，OG，CB，C，OSAVI8MET E222N，CA，CE，SD，CG，CB，C，OSAVI8ALA E223N，CA，CB，C，OSAVI8THR E224N，CA，CG2，OG1，CB，C，OSAVI8PRO E225N，CD，CA，CG，CB，C，OSAVI8HIS E226N，CA，CD2，NE2，CE1，ND1，CG，CB，C，OSubset RESTxrestxmole.listSubset RESTXNEWMODELE5，E13-E14，E22，E38-E40，E42，E73-E76，E82-E86，E103-E105，NEWMODELE108，E122，E133-E135，E137-E140，E149-E150，E173，E204，E206，NEWMODELE211-E213，E215-E216，E227-E229，E258，E269restxatom.listSubset RESTXNEWMODELPRO E5N，CD，CA，CG，CB，C，ONEWMODELALA E13N，CA，CB，C，ONEWMODELPRO E14N，CD，CA，CG，CB，C，ONEWMODELTHR E22N，CA，CG2，OG1，CB，C，ONEWMODELTHR E38N，CA，CG2，OG1，CB，C，ONEWMODELHIS E39N，CA，CD2，NE2，CE1，ND1，CG，CB，C，ONEWMODELPRO E40N，CD，CA，CG，CB，C，ONEWMODELLEU E42N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，ONEWMODELALA E73N，CA，CB，C，ONEWMODELALA E74N，CA，CB，C，ONEWMODELLEU E75N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，ONEWMODELASN E76N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，ONEWMODELLEU E82N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，ONEWMODELGLY E83N，CA，C，ONEWMODELVAL E84N，CA，CG2，CG1，CB，C，ONEWMODELALA E85N，CA，CB，C，ONEWMODELPRO E86N，CD，CA，CG，CB，C，ONEWMODELSER E103N，CA，OG，CB，C，ONEWMODELVAL E104N，CA，CG2，CG1，CB，C，ONEWMODELSER E105N，CA，OG，CB，C，ONEWMODELALA E108N，CA，CB，C，ONEWMODELALA E122N，CA，CB，C，ONEWMODELALA E133N，CA，CB，C，ONEWMODELTHR E134N，CA，CG2，OG1，CB，C，ONEWMODELLEU E135N，CA，CD2，CD1，CG，CB，C，ONEWMODELGLN E137N，CA，NE2，OE1，CD，CG，CB，C，ONEWMODELALA E138N，CA，CB，C，ONEWMODELVAL E139N，CA，CG2，CG1，CB，C，ONEWMODELASN E140N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，ONEWMODELVAL E149N，CA，CG2，CG1，CB，C，ONEWMODELVAL E150N，CA，CG2，CG1，CB，C，ONEWMODELASN E173N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，ONEWMODELASN E204N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，ONEWMODELGLN E206N，CA，NE2，OE1，CD，CG，CB，C，ONEWMODELGLY E211N，CA，C，ONEWMODELSER E212N，CA，OG，CB，C，ONEWMODELTHR E213N，CA，CG2，OG1，CB，C，ONEWMODELALA E215N，CA，CB，C，ONEWMODELSER E216N，CA，OG，CB，C，ONEWMODELVAL E227N，CA，CG2，CG1，CB，C，ONEWMODELALA E228N，CA，CB，C，ONEWMODELGLY E229N，CA，C，ONEWMODELGLY E258N，CA，C，ONEWMODELASN E269N，CA，ND2，OD1，CG，CB，C，O实施例3PD498中适于添加羧酸连接基团(-COOH)的合适取代按照实施例1所述建立PD498的3D结构。
按照下述找出添加羧基连接基团(天冬氨酸和谷氨酸)的合适位置。遵循实施例1所述的操作。Insight(BIOSYM)中运行的各个指令示于下述指令文件makeDEzone.bcl和makeDEzone2.bcl中保守性取代makeDEzone.bclDelete Subset*Color Molecule Atoms * Specified Specification 255，0，255Zone Subset ASPaspod* Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0Zone Subset GLUgluoe* Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0#NOTEeditnextline C-terminal residue number according to theproteinzone Subset CTERM280O Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0#NOTEeditnextline ACTSITE residues according to the proteinZone Subset ACTSITE39，72，226 Static monomer/residue 8Color_Subset 255，255，0Combine Subset ALLZONE Union ASP GLUCombine Subset ALLZONE Union ALLZONE CTERMCombine Subset ALLZONE Union ALLZONE ACTSITE#NOTEeditnextline object name according to the proteinCombine Subset REST Difference PD498FINALMODEL ALLZONEList Subset REST Atom Output_File restatom.listList Subset REST monomer/residue Output_File restmole.listColor Molecule Atoms ACTSITE Specified Specification 255，0，0List Subset ACTSITE Atom Output_File actsiteatom.listList Subset ACTSITE monomer/residue Output_Fileactsitemole.list#Zone Subset REST5A REST Static Monomer/Residue 5 -Color_SubsetCombine Subset SUB5A Difference REST5A ACTSITECombine Subset SUB5B Difference SUB5A RESTColor Molecule Atoms SUB5B Specified Specification 255，255，255List Subset SUB5B Atom Output_File sub5batom.listList Subset SUB5B monomer/residue Output_File sub5bmole.list#Now identify sites for asn→asp & gln→glu substitutions and...#continue with makezone2.bcl.#Use grep command to identify asn/gln in restatom.list ...#sub5batom.list & accsiteatom.list说明REST亚组包含Gln33和Asn245，SUB5B包含Gln12，Gln126、Asn209，Gln242，Asn246，Gln248和Asn266，所有这些残基都是溶剂暴露型的。
鉴定出PD498内Q12E或Q12D、Q33E或Q33D、Q126E或Q126D、N209D或N209E、Q242E或Q242D、N245D或N245E、N246D或N246E、Q248E或Q248D以及N266D或N266E这些取代是进行本发明范围内诱变的一些位点。将在下面第2部分中进行残基取代，并进一步分析非保守性取代makeDEzone2.bcl#sourcefile makezone2.bcl Claus von der Osten 961128##having scanned lists(grep gln/asn command)and identifiedsites for ...#asn→asp & gln→glu substitutions#NOTEeditnextline object name according to proteinCopy object -To_Clipboard -Displace PD498FINALMODEL newmodelBiopolymer#NOTEeditnextline object name according to proteinBlank Object On PD498FINALMODEL#NOTEeditnextlines with asn→asp & gln→glu positionsReplace Residue newmodel33 glu LReplace Residue newmodel245 asp LReplace Residue newmodel12 glu LReplace Residue newmodel126 glu LReplace Residue newmodel209 asp LReplace Residue newmodel242 glu LReplace Residue newmodel246 asp LReplace Residue newmodel248 glu LReplace Residue newmodel266 asp L##Now repeat analysis done prior to asn→asp & gln→glu，...#now including introduced asp & gluColor Molecule Atoms newmodel Specified specification 255，0，255Zone Subset ASPx newmodelaspod* Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0Zone Subset GLUx newmodelgluoe* Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0#NOTEeditnextline C-terminal residue number according to theproteinZone Subset CTERMx newmodel280O Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0#NOTEeditnextline ACTSITEx residues according to the proteinZone Subset ACTSITEx newmodel39，72，226 Static monomer/residue8 Color_Subset 255，255，0Combine_Subset ALLZONEx Union ASPx GLUxCombine Subset ALLZONEx Union ALLZONEx CTERMxCombine Subset ALLZONEx Union ALLZONEx ACTSITExCombine Subset RESTx Difference newmodel ALLZONExList Subset RESTx Atom Output_File restxatom.listList Subset RESTx monomer/residue Output_File restxmole.list#Color Molecule Atoms ACTSITEx Specified Specification 255，0，0List Subset ACTSITEx Atom Output_File actsitexatom.listList Subset ACTSITEx monomer/residue Output_Fileactsitexmole.list##read restxatom.list or restxmole.list to identify sites for(not_gluasp)→gluasp ...#subst.if needed说明RESTx亚组仅含有两个残基A233和G234，它们都不是溶剂暴露型的。不需要进一步诱变来达到对表面的完全保护。然而，有可能需要除去活性位点区域内的一些反应活性羧基，以确保能到达PD498的活性位点。ACTSITE亚组内的酸性残基是D39、D58、D68和D106。这些残基中，仅后面两个残基是溶剂暴露型的，且D39是一个功能性残基。根据本发明，D68N、D68Q、D106N和D106Q是比较合适的突变。
实施例3的有关数据PD498MODEL的溶剂可及性数据参见上述实施例1。Subset RESTrestmole.listSubset RESTPD498FINALMODEL10-11，33-35，54-55，129-130，221，233-234，236，240，243，PD498FINALMODEL245，262，264-265restatom.listSubset RESTPD498FINALMODELALA 10N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELTYR 11N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELGLN 33N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2PD498FINALMODELTHR 34N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELVAL 35N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELILE 54N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELLYS 55N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZPD498FINALMODELLYS 129N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZPD498FINALMODELVAL 130N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELTYR 221N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELALA 233N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELGLY 234N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 236N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 240N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELGLY 243N，CA，C，OPD498FINALMODELASN 245N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELGLY 262N，CA，C，OPD498FINALMODELGLY 264N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 265N，CA，C，O，CB，OG1，CG2Subset SUB5Bsub5bmole.listSubset SUB5BPD498FINALMODEL6-9，12-13，31-32，51-53，56，81，93-94，97-99，122，126-128，PD498FINALMODEL131，155-157，159，197-199，209，211，219-220，232，235，PD498FINALMODEL237-239，241-242，244，246-249，253，260-261，263，266-268sub5batom.listSubset SUB5BPD498FINALMODELPRO 6N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELTYR 7N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELTYR 8N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELSER 9N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELGLN 12N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2PD498FINALMODELTYR 13N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELSER 31N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTHR 32N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELARG 51N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2PD498FINALMODELLYS 52N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZPD498FINALMODELVAL 53N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELGLY 56N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 81N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELMET 93N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEPD498FINALMODELALA 94N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELTHR 97N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELLYS 98N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZPD498FINALMODELILE 99N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELTYR 122N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELGLN 126N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2PD498FINALMODELGLY 127N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 128N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELLEU 131N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELGLY 155N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 156N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 157N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELVAL 159N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELTYR 197N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELGLY 198N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 199N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELASN 209N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELALA 211N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELTYR 219N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELSER 220N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELVAL 232N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELLEU 235N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELALA 237N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELLEU 238N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELLEU 239N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELSER 241N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELGLN 242N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2PD498FINALMODELLYS 244N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZPD498FINALMODELASN 246N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELVAL 247N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELGLN 248N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2PD498FINALMODELILE 249N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELILE 253N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELILE 260N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELSER 261N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTHR 263N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELASN 266N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELPHE 267N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZPD498FINALMODELLYS 268N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZSubset ACTSITEactsitemole.listSubset ACTSITEPD498FINALMODEL36-42，57-60，66-80，100-110，115-116，119，132-136，160-164，PD498FINALMODEL182-184，194，206-207，210，212-215，222-231actsiteatom.listSubset ACTSITEPD498FINALMODELALA 36N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 37N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELLEU 38N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELASP 39N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELSER 40N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELGLY 41N，CA，C，OPD498FINALMODELVAL 42N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELTYR57N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHPD498FINALMODELASP 58N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELPHE59N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZPD498FINALMODELILE 60N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELPRO 66N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELMET 67N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEPD498FINALMODELASP 68N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELLEU 69N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELASN 70N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELGLY 71N，CA，C，OPD498FINALMODELHIS 72N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2PD498FINALMODELGLY 73N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 74N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELHIS 75N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2PD498FINALMODELVAL 76N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELALA 77N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELGLY 78N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 79N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELVAL 80N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELLEU 100N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELALA 101N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELVAL 102N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELARG 103N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2PD498FINALMODELVAL 104N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELLEU 105N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELASP 106N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2PD498FINALMODELALA 107N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELASN 108N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELGLY 109N，CA，C，OPD498FINALMODELSER 110N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELSER 115N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELILE 116N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELGLY 119N，CA，C，OPD498FINALMODELASN 132N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELLEU 133N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELSER 134N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELLEU 135N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2PD498FINALMODELGLY 136N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 160N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 161N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELALA 162N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELGLY 163N，CA，C，OPD498FINALMODELASN 164N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2PD498FINALMODELVAL 182N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELGLY 183N，CA，C，OPD498FINALMODELALA 184N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELPHE 194N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZPD498FINALMODELPRO 206N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELGLY 207N，CA，C，OPD498FINALMODELILE 210N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1PD498FINALMODELSER 212N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELTHR 213N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELVAL 214N，CA，C，O，CB，CG1，CG2PD498FINALMODELPRO 215N，CA，CD，C，O，CB，CGPD498FINALMODELMET 222N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEPD498FINALMODELSER 223N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELGLY 224N，CA，C，OPD498FINALMODELTHR 225N，CA，C，O，CB，OG1，CG2PD498FINALMODELSER 226N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELMET 227N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEPD498FINALMODELALA 228N，CA，C，O，CBPD498FINALMODELSER 229N，CA，C，O，CB，OGPD498FINALMODELPRO 230N，CA，CD，C，O，CB，CG
PD498FINALMODELHIS 231N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2Subset RESTxrestxmole.listSubset RESTXNEWMODEL233-234restxatom.listSubset RESTXNEWMODELALA 233N，CA，C，O，CBNEWMODELGLY 234N，CA，C，O实施例4Arthromyces ramosus过氧化物酶中适于添加羧酸连接基团(-COOH)的合适取代按照下述找出一种非水解酶-Arthromyces ramosus氧化物酶中适于添加羧基连接基团(天冬氨酸和谷氨酸)的合适位置。
在Brookhaven数据库中可以larp.pdb的文件名得到这种氧化还原酶的3D结构。此A.ramosus过氧化物酶中含有344个氨基酸残基。X-射线结构中见不到最初的8个残基QGPGGGGG，N143被糖基化。
遵循实施例1中所述的操作。
Arthromyces ramosus过氧化物酶(E.C.1.11.1.7)的氨基酸序列示于SEQ ID NO4中。
Insight(BIOSYM)中运行的各个指令示于下述指令文件makeDEzone.bcl和makeDEzone2.bcl中。C-末端残基是P344，ACTSITE定义为血红素基团和与其协作的两个组氨酸(H56和H184)。
保守性取代makeDEzone.bclDelete Subset*Color Molecule Atoms * Specified Specification 255，0，255Zone Subset ASPaspod* Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0Zone Subset GLUgluoe* Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0#NOTEeditnextline C-terminal residue number according to theproteinZone Subset CTERM344O Static monomer/residue 10 Color_Subset255，255，0#NOTEeditnextline ACTSITE residues according to the proteinZone Subset ACTSITEHEM，56，184 Static monomer/residue 8Color_Subset 255，255，0Combine Subset ALLZONE Union ASP GLUCombine Subset ALLZONE Union ALLZONE CTERMCombine Subset ALLZONE Union ALLZONE ACTSITE#NOTEeditnextline object name according to the proteinCombine Subset REST Difference ARP ALLZONEList Subset REST Atom Output_File restatom.listList Subset REST monomer/residue Output_File restmole.listColor Molecule Atoms ACTSITE Specified Specification 255，0，0List Subset ACTSITE Atom Output_File actsiteatom.listList Subset ACTSITE monomer/residue Output_Fileactsitemole.list#Zone Subset REST5A REST Static Monomer/Residue 5 -Color_SubsetCombine Subset SUB5A Difference REST5A ACTSITECombine Subset SUB5B Difference SUB5A RESTColor Molecule Atoms SUB5B Specified Specification 255，255，255List Subset SUB5B Atom Output_File sub5batom.listList Subset SUB5B monomer/residue Output_File sub5bmole.list#Now identify sites for asn→asp & gln→glu substitutions and...#continue with makezone2.bcl.#Use grep command to identify asn/gln in restatom.list ...#sub5batom.list & accsiteatom.list说明REST亚组包含Gln70，SUB5B包含Gln34，Asn128，Asn303，这几个残基都是溶剂暴露型的。
已鉴定出A.ramosus过氧化物酶内Q34E或Q34D、Q70E或Q70D、N128D或N128E以及N303D或N303E这些取代是适于进行诱变的一些位点。在下述将对这些残基进行取代，并进一步分析非保守性取代makeDEzone2.bcl#sourcefile makezone2.bcl Claus von der Osten 961128##having scanned lists (grep gln/asn command) and identifiedsites for ...#asn→asp & gln→glu substitutions#NOTEeditnextline object name according to proteinCopy Object -To_Clipboard -Displace ARP newmodelBiopolymer#NOTEeditnextline object name according to proteinBlank Object On ARP#NOTEeditnextlines with asn→asp & gln→glu positionsReplace Residue newmodel34 glu LReplace Residue newmodel70 glu LReplace Residue newmodel128 asp LReplace Residue newmodel303 asp L##Now repeat analysis done prior to asn→asp & gln→glu，...#now including introduced asp & gluColor Molecule Atoms newmodel Specified Specification 255，0，255Zone Subset ASPx newmodelaspod* Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0Zone Subset GLUx newmodelgluoe* Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0#NOTEeditnextline C-terminal residue number according to theproteinZone Subset CTERMx newmodel344O Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，0#NOTEeditnextline ACTSITEx residues according to the proteinZone Subset ACTSITEx newmodelHEM，56，184 Static monomer/residue8 Color_Subset 255，255，0Combine Subset ALLZONEx Union ASPx GLUxCombine Subset ALLZONEx Union ALLZONEx CTERMxCombine Subset ALLZONEx Union ALLZONEx ACTSITExCombine Subset RESTx Difference newmodel ALLZONExList Subset RESTx Atom Output_File restxatom.listList Subset RESTx monomer/residue Output_File restxmole.list#Color Molecule Atoms ACTSITEx Specified Specification 255，0，0List Subset ACTSITEx Atom Output_File actsitexatom.listList Subset ACTSITEx monomer/residue Output_Fileactsitexmole.list##read restxatom.list or restxmole.list to identify sites for(not_gluasp)→gluasp ...#subst. if needed说明RESTx亚组仅含有4个残基S9、S334、G335和P336，它们的溶剂暴露程度都＞5％。建议在A.ramosus过氧化物酶内进行下述突变S9D、S9E、S334D、S334E、G335D、G335E、P336D和P336E。ACTSITE亚组内的酸性残基有E44、D57、D77、E87、E176、D179、E190、D202、D209、D246以及P344上的N-末端羧酸。这些残基中仅E44、D77、E176、D179、E190、D209、D246以及P344上的N-末端羧酸是溶剂暴露型的。突变的合适位点是E44Q、D77N、E176Q、D179N、E190Q、D209N和D246N。由于D246对血红素的结合比较重要，因此D246N和D246E这两种突变颇有危险。
由于N-末端8个残基不出现在此结构中，因此，在上述计算中不包括这几个残基。这8个残基，QGPGGGGG，都不含羧基。下述变体有可能使得能在这一区域内进行连接Q1E、Q1D、G2E、G2D、P3E、P3D、G4E、G4D、G5E、G5D、G6E、G6D、G7E、G7D、G8E、G8D。
实施例4的有关数据
A.ramosus氧化物酶的溶剂可及性数据(备注由于X-射线结构中缺失了最开始的8个残基，因此，在下述可及性表中列出的残基号比其它处用于残基编号的残基号要小8)#ARP Thu Jan 30 153905 MET 1997#残基 面积SER_1 143.698257VAL_2 54.879990THR_3 86.932701CYS_4 8.303715PRO_5 126.854782GLY_6 53.771488GLY_7 48.137802GLN_8 62.288475SER_9 79.932549THR_10 16.299215SER_11 81.928642ASN_12 51.432678SER_13 81.993019GLN_14 92.344009CYS_15 0.000000CYS_16 32.317432VAL_17 54.067810TRP_18 6.451035PHE_19 25.852070ASP_20 79.033997VAL_21 0.268693LEU_22 22.032858ASP_23 90.111404ASP_24 43.993240LEU_25 1.074774GLN_26 25.589321THR_27 82.698059ASN_28 96.600883PHE_29 32.375275TYR_30 5.898365GLN_31 103.380585GLY_32 40.042034SER_33 46.789322LYS_34 87.161873CYS_35 12.827215GLU_36 51.582657SER_37 16.378180PRO_38 33.560043VAL_39 6.448641ARG_40 7.068311LYS_41 15.291286ILE_42 1.612160LEU_43 1.880854ARG_44 16.906845ILE_45 0.000000VAL_46 2.312647PHE_47 2.955627HIS_48 20.392527ASP_49 4.238116ALA_50 0.510757ILE_51 1.576962GLY_52 2.858601PHE_53 48.633503SER_54 8.973248PRO_55 58.822315ALA_56 59.782852LEU_57 46.483955THR_58 86.744827ALA_59 89.515816ALA_60 81.163239GLY_61 70.119019GLN_62 112.635498PHE_63 93.522354GLY_64 2.742587GLY_65 13.379636GLY_66 22.722847GLY_67 0.000000ALA_68 0.268693ASP_69 12.074840GLY_70 0.700486SER_71 0.000000ILE_72 0.000000ILE_73 0.000000ALA_74 17.304443HIS_75 41.071186SER_76 20.000793ASN_77 120.855316ILE_78 66.574982GLU_79 2.334954LEU_80 41.329689ALA_81 77.370575PHE_82 38.758774PRO_83 131.946289ALA_84 34.893864ASN_85 5.457000GLY_86 43.364151GLY_87 51.561348LEU_88 0.242063THR_89 73.343575ASP_90 130.139389THR_91 17.863211ILE_92 0.268693GLU_93 92.210396ALA_94 35.445068LEU_95 1.343467ARG_96 31.175611ALA_97 44.650192VAL_98 17.698566GLY_99 1.471369ILE_100 62.441463ASN_101 107.139748HIS_102 46.952496GLY_103 46.559296VAL_104 11.342628SER_105 15.225677PHE_106 6.422011GLY_1073.426864ASP_10810.740790LEU_1090.268693ILE_1101.880854GLN_11131.867456PHE_1120.000000ALA_1130.000000THR_1143.656114ALA_1158.299393VAL_1160.268693GLY_1170.268693MET_1183.761708SER_11914.536770ASN_12025.928799CYS_1210.537387PRO_12229.798336GLY_12333.080013SER_12417.115562PRO_12536.908714ARG_126108.274727LEU_12721.238588GLU_12853.742313PHE_1293.761708LEU_13012.928699THR_13110.414591GLY_13247.266495ARG_13312.247048SER_13463.047237ASN_13531.403708SER_13697.999619SER_13728.505201GLN_138102.845520PRO_13949.691917SER_1409.423104PRO_14125.724171PRO_14280.706665SER_143105.318176LEU_14420.154398ILE_14541.288322PRO_14610.462679GLY_14719.803421PRO_14818.130360GLY_14947.391853ASN_15060.248917THR_15187.887985VAL_15213.870322THR_15374.664734ALA_15445.251106ILE_1552.686934LEU_15628.720940ASP_157110.081253ARG_15831.228874MET_1591.612160GLY_16038.223858ASP_16146.293152ALA_1629.877204GLY_16334.267326PHE_164 11.057570SER_165 51.158882PRO_166 62.767738ASP_167 75.164917GLU_168 43.334976VAL_169 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130N，CA，CD，C，O，CB，CGARPGLY 131N，CA，C，OARPSER 132N，CA，C，O，CB，OGARPARG 134N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2ARPGLY 270N，CA，C，OARPARG 274N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2ARPILE 297N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPPRO 298N，CA，CD，C，O，CB，CG
ARPSER 302N，CA，C，O，CB，OGARPASN 303N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2ARPGLY 311N，CA，C，OARPGLY 312N，CA，C，OARPTHR 332N，CA，C，O，CB，OG1，CG2ARPALA 333N，CA，C，O，CBARPLEU 337N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPPRO 338N，CA，CD，C，O，CB，CGSubset ACTSITEactsitemole.listSubset ACTSITEARP44-61，75-77，79-80，87-88，90-96，99，118，122，126，135，148-149，152-158，ARP163-164，167，176-194，197-205，207-209，211-213，216，230-231，241，ARP243-246，249，259，273，277，280，343-347Hactsiteatom.listSubset ACTSITEARPGLU 44N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2ARPSER 45N，CA，C，O，CB，OGARPPRO 46N，CA，CD，C，O，CB，CGARPVAL 47N，CA，C，O，CB，CG1，CG2ARPARG 48N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2ARPLYS 49N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZARPILE 50N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPLEU 51N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPARG 52N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2ARPILE 53N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPVAL 54N，CA，C，O，CB，CG1，CG2ARPPHE 55N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPHIS 56N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2ARPASP 57N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2ARPALA 58N，CA，C，O，CBARPILE 59N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPGLY 60N，CA，C，OARPPHE 61N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPGLY 75N，CA，C，OARPALA 76N，CA，C，O，CBARPASP 77N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2ARPSER 79N，CA，C，O，CB，OGARPILE 80N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPGLU 87N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2ARPLEU 88N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPPHE 90N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPPRO 91N，CA，CD，C，O，CB，CGARPALA 92N，CA，C，O，CBARPASN 93N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2ARPGLY 94N，CA，C，OARPGLY 95N，CA，C，OARPLEU 96N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPTHR 99N，CA，C，O，CB，OG1，CG2ARPILE 118N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPTHR 122N，CA，C，O，CB，OG1，CG2ARPMET 126N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEARPLEU 135N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPSER 148N，CA，C，O，CB，OGARPPRO 149N，CA，CD，C，O，CB，CGARPLEU 152N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPILE 153N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPPRO 154N，CA，CD，C，O，CB，CGARPGLY 155N，CA，C，OARPPRO 156N，CA，CD，C，O，CB，CGARPGLY 157N，CA，C，OARPASN 158N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2ARPILE 163N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1ARPLEU 164N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPMET 167N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEARPGLU 176N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2ARPVAL 177N，CA，C，O，CB，CG1，CG2ARPVAL 178N，CA，C，O，CB，CG1，CG2ARPASP 179N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2ARPLEU 180N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPLEU 181N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPALA 182N，CA，C，O，CBARPALA 183N，CA，C，O，CBARPHIS 184N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2ARPSER 185N，CA，C，O，CB，OGARPLEU 186N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPALA 187N，CA，C，O，CBARPSER 188N，CA，C，O，CB，OGARPGLN 189N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2ARPGLU 190N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2ARPGLY 191N，CA，C，OARPLEU 192N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPASN 193N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2ARPSER 194N，CA，C，O，CB，OGARPPHE 197N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPARG 198N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2ARPSER 199N，CA，C，O，CB，OGARPPRO 200N，CA，CD，C，O，CB，CGARPLEU 201N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPASP 202N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2ARPSER 203N，CA，C，O，CB，OGARPTHR 204N，CA，C，O，CB，OG1，CG2ARPPRO 205N，CA，CD，C，O，CB，CGARPVAL 207N，CA，C，O，CB，CG1，CG2ARPPHE 208N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPASP 209N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2ARPGLN 211N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2ARPPHE 212N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPTYR 213N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHARPTHR 216N，CA，C，O，CB，OG1，CG2ARPPHE 230N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPALA 231N，CA，C，O，CBARPPHE 241N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZARPMET 243N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEARPARG 244N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2ARPSER 245N，CA，C，O，CB，OGARPASP 246N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2ARPLEU 249N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2ARPTRP 259N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，NE1，CE2，CE3，CZ2，CZ3，CH2ARPTYR 273N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHARPMET 277N，CA，C，O，CB，CG，SD，CE
ARPMET 280N，CA，C，O，CB，CG，SD，CEARPALA 343N，CA，C，O，CBARPPRO 344N，CA，CD，C，O，OXT，CB，CGARPHEM 345HFE，NA，NB，NC，ND，CHA，CHB，CHC，CHD，C1A，C2A，C3A，CMA，CMA，CAA，CBA，CGAARPHEM 345HO1A，O2A，C1B，C2B，C3B，C4B，CMB，CAB，CBB，C1C，C2C，C3C，C4C，CMC，CAC，CBCARPHEM 345HC1D，C2D，C3D，C4D，CMD，CAD，CBD，CGD，O1D，O2DARPCA 346HCAARPCA 347HCASubset RESTxrestxmole.listSubset RESTXNEWMODEL9，334-336restxatom.listSubset RESTXNEWMODELSER 9N，CA，C，O，CB，OGNEWMODELSER 334N，CA，C，O，CB，OGNEWMODELGLY 335N，CA，C，ONEWMODELPRO 336N，CA，CD，C，O，CB，CG实施例5用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG 15,000将mPEG 15,000悬浮在甲苯中(4ml/g mPEG)，在正常压力下蒸馏除去20％以共沸干燥反应物。当溶液冷却到30℃时，加入二氯甲烷(1ml/g干燥mPEG)，并加入甲苯中的碳酰氯(1.93M 5摩尔/摩尔mPEG)，混合物在室温下搅动过夜。混合物蒸发至干燥，所得的目的产物为蜡状块。
在蒸发之后，添加二氯甲烷和甲苯(1∶2，3ml/g干燥mPEG)以重新溶解白色固体。以固体形式加入N-羟基琥珀酰亚胺(2摩尔/摩尔mPEG)，然后加入三乙胺(1.1摩尔/摩尔mPEG)。将混合物搅动3小时。混合物最初并不清亮，然后变得清亮，最后形成小沉淀。将混合物蒸发至干燥，在乙酸乙酯(10ml)中重结晶，热过滤以除去盐和不溶性的微量物质。放置清亮液体，使其在室温下缓慢冷却16小时，然后在冰箱中过夜。滤出白色沉淀，以一些冷乙酸乙酯洗涤，并进行干燥，得到98％(w/w)的产物。核磁共振表明有80-90％被活化和5o/oo(w/w)HNEt3Cl。mPEG 15,000(CDCl3)的1H-NMR为d 1.42t(I＝4.8CH3i HNEt3Cl)，2.84s(I＝3.7琥珀酰亚胺)，3.10dq(I＝3.4 CH2i HNEt3Cl)，3.38s(I＝2.7 CH3i OMe)，3.40dd(I＝4.5o/oo13C satellite)，3.64 bs(I＝1364主峰)，3.89 dd(I＝4.8o/oo13C satellite)，4.47dd(I＝1.8，PEG中的CH2)。于22℃下在干燥器中存储4个月后来见变化。实施例6用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG 5,000如实施例5所述，用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG 5,000。实施例7PD498变体的构建和表达采用Sarkar等人(1990，生物技术，8404-407)描述的“maxi-寡核苷酸PCR”方法，构建PD498定点变体。
模板质粒是含有PD498蛋白酶基因变体的穿梭载体pPD498或者其类似物。
构建、表达和纯化下述PD498变体。AR28KBR62KCR169KDR28K+R62KER28K+R169KFR62K+R169KGR28K+R69K+R169K构建变体为了导入R28K取代，利用了含有下述序列的一种合成寡核苷酸GGG ATG TAA CCA AGG GAA GCA GCA CTC AAA CG(SEQ ID NO7)。
将769bp的PCR片段连接到经过BstE II和BglII消化的pPD498质粒中。通过StyI消化检测出阳性变体，并通过对此整个769bp插入片段的DNA测序进一步证实。
为了导入R62K取代，利用了含有下述序列的一种合成寡核苷酸CGA CTT TAT CGA TAA GGA CAA TAA CCC(SEQ ID NO8)。
将769bp的PCR片段连接到经过BstE II和BglII消化的pPD498质粒中。通过ClaI消化检测出阳性变体，并通过对此整个769bp插入片段的DNA测序进一步证实。
为了导入R169K取代，利用了含有下述序列的一种合成寡核苷酸CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA ACC AGC(SEQ ID NO9)。
将769bp的PCR片段连接到经过BstE II和BglII消化的pPD498质粒中。通过一个RsaI限制性位点的缺失检测出阳性变体，并通过对此整个769bp插入片段的DNA测序进一步证实。
为了同时导入R28K和R62K取代，同时利用了含有下述序列的合成寡核苷酸GGG ATG TAA CCA AGG GAA GCA CCA CTC AAA CG(SEQ ID NO7)以及CGA CTT TAT CGA TAA GGA CAA TAA CCC(SEQ ID NO8)。将769bp的PCR片段连接到经过BstE II和BglII消化的pPD498质粒中。通过StyI和ClaI消化检测出阳性变体，并通过对此整个769bp插入片段的DNA测序进一步证实。
为了同时导入R28K和R169K取代，同时利用了含有下述序列的合成寡核苷酸GGG ATG TAA CCA AGG GAA GCA GCA CTC AAA CG(SEQ ID NO8)以及CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA ACC AGC(SEQ ID NO8)。将769bp的PCR片段连接到经过BstE II和BglII消化的pPD498质粒中。通过StyI的消化以及一个RsaI位点的缺失检测出阳性变体。通过对此整个769bp插入片段的DNA测序进一步证实。
为了同时导入R62K和R169K取代，同时利用了含有下述序列的合成寡核苷酸CGA CTT TAT CGA TAA GGA CAA TAA CCC(SEQ ID NO8)，以及CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA ACC AGC(SEQ ID NO9)。将769bp的PCR片段连接到经过BstEII和BglII消化的pPD498质粒中。通过ClaI的消化以及一个RsaI位点的缺失检测出阳性变体。通过对此整个769bp插入片段的DNA测序进一步证实。
为了同时导入R28K、R62K和R169K取代，同时利用了分别含有下述序列的几种合成寡核苷酸GGG ATG TAA CCA AGG GAA GCA GCA CTC AAA CG(SEQ ID NO7)CGA CTT TAT CGA TAA GGA CAA TAA CCC(SEQ ID NO8)，以及CAA TGT ATC CAA AAC GTT CCA ACC AGC(SEQ ID NO9)。将769bp的PCR片段连接到经过BstEII和BglII消化的pPD498质粒中。通过StyI和ClaI的消化以及一个RsaI位点的缺失检测出阳性变体。通过对此整个769bp插入片段的DNA测序进一步证实。PD498变体的发酵、表达和纯化从大肠杆菌培养物中纯化出含有上述PD498变体的载体，将它们转化至枯草芽孢杆菌中，按照上述“材料和方法”所述，从中发酵、表达和纯化变体。实施例7三联体取代的PD498变体与活化的mPEG 5,000的偶联在20ml的终体积内，于50mM硼酸钠(pH 10)中，将200mg三联体取代的PD498变体(即R28K+R62K+R169K取代的变体)与1.8g用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG 5,000(按照实施例2制备)一起温育。通过磁性搅拌，在室温下进行反应。反应时间是1小时。通过添加DMG缓冲液至终浓度为5mM二甲基戊二酸、1mM CaCl2和50mM硼酸盐(pH 5.0)来终止反应。
所得衍生物的分子量大约是120kDa，相当于每摩尔酶连接了大约16摩尔mPEG。
与亲本酶比较，被修饰酶对肽底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-酰基对硝基苯胺)的剩余活性接近100％。实施例8豚鼠中PD498变体-SPEG 5,000的变应原性实验通过气管内施药，用1.0μg PD498-SPEG 5,000和1.0μg修饰的变体PD498-SPEG 5,000刺激Dunkin Hartley豚鼠。
用特异性的IgG1 ELISA(如上所述)检测实验期间经免疫的DunkinHartley豚鼠的血清，以分析该分子是否能活化免疫应答系统，引起指示为变应原性应答的特异性IgG1应答。
观察10周的实验期间Dunkin Hartley豚鼠的IgG1水平。实施例9Humicola lanuginosa脂肪酶中适于添加氨基连接基团(-NH2)的取代在Brookhaven数据库中，可以1tib.pdb的文件名得到Humicolalanuginosa脂肪酶(SEQ ID NO6)的3D结构。该脂肪酶由269个氨基酸组成。
遵循实施例1中描述的操作。在下面列出的H.lanuginosa脂肪酶溶剂可及性数据中给出了H.lanuginosa脂肪酶的序列。采用H.lanuginosa残基编号系统(1-269)，活性位点残基(功能性位点)是S146、S201和H258。用同义词TIB表示H.lanuginosa脂肪酶。
Insight(BIOSYM)中运行的各个指令示于下述指令文件makeKzone.bcl和makeKzone2.bcl中保守性取代makeKzone.bcl1 Delete Subset *2 Color Molecule Atoms * Specified Specification 255，0，2553 Zone Subset LYSlysNZ Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，04 Zone Subset NTERM1N Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，05 #NOTEeditnextline ACTSITE residues according to theprotein6 Zone Subset ACTSITE146，201，258 Static monomer/residue 8Color_Subset 255，255，07 Combine Subset ALLZONE Union LYS NTERM8 Combine Subset ALLZONE Union ALLZONE ACTSITE9 #NOTEeditnextline object name according to the protein10 Combine Subset REST Difference TIB ALLZONE11 List Subset REST Atom Output_File restatom.list12 List Subset REST monomer/residue Output_File restmole.list13 Color Molecule Atoms ACTSITE Specified Specification 255，0，014 List Subset ACTSITE Atom Output_File actsiteatom.list15 List Subset ACTSITE monomer/residue Output_Fileactsitemole.list16 #17 Zone Subset REST5A REST Static Monomer/Residue 5 -Color_Subset18 Combine Subset SUB5A Difference REST5A ACTSITE19 Combine Subset SUB5B Difference SUB5A REST20 Color Molecule Atoms SUB5B Specified Specification255，255，25521 List Subset SUB5B Atom Output_File sub5batom.list22 List Subset SUB5B monomer/residue Output_File sub5bmole.list23 #Now identify sites for lys→arg substitutions and continuewith makezone2.bcl24 #Use grep command to identify ARG in restatom.list，sub5batom.list & accsiteatom.list说明在H.lanuginosa脂肪酶(＝TIB)的情形下，REST包含精氨酸Arg133、Arg139、Arg160、Arg179和Arg209，SUB5B包含Arg118和R125。
这些残基均是溶剂暴露型的。已鉴定出TIB内R133K，R139K，R160K，R179K，R209K，R118K和R125K这些取代是适于进行本发明范围内诱变的一些位点。在下述第2部分将对这些残基进行取代，并进一步分析。ACTSITE亚组中无赖氨酸。
非保守性取代makeKzone2.bcl1 #sourcefile makezone2.bcl Claus von der Osten 9611282 #3 #having scanned lists (grep arg command) and identifiedsites for lys→arg substitutions4 #NOTEeditnextline object name according to protein5 Copy Object -To_Clipboard -Displace TIB newmodel6 Biopolymer7 #NOTEeditnextline object name according to protein8 Blank Object On TIB9 #NOTEeditnextlines with lys→arg positions10 Replace Residue newmodel118 lys L11 Replace Residue newmodel125 lys L12 Replace Residue newmodel133 lys L13 Replace Residue newmodel139 lys L14 RePlace Residue newmodel160 lys L15 Replace Residue newmodel179 lys L16 Replace Residue newmodel209 lys L17 #18 #Now repeat analysis done prior to arg→lys，now includingintroduced lysines19 Color Molecule Atoms newmodel Specified Specification255，0，25520 Zone Subset LYSx newmodellysNZ Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，021 Zone Subset NTERMx newmodel1N Static monomer/residue 10Color_Subset 255，255，022 #ZOTEeditnextline ACTSITEx residues according to theprotein23 Zone Subset ACTSITEx newmodel146，201，258 Staticmonomer/residue 8 Color_Subset 255，255，024 Combine Subset ALLZONEx Union LYSx NTERMx25 Combine Subset ALLZONEx Union ALLZONEx ACTSITEx26 Combine Subset RESTx Difference newmodel ALLZONEx27 List Subset RESTx Atom Output File_restxatom.list28 List Subset RESTx monomer/residue Output_Filerestxmole.list29 #30 Color Molecule Atoms ACTSITEx Specified Specification255，0，031 List Subset ACTSITEx Atom Output_File actsitexatom.list32 List Subset ACTSITEx monomer/residue Output_Fileactsitexmole.list33 #34 #read restxatom.list or restxmole.list to identify sitesfor (not_arg)→lys subst.if needed说明在RESTx亚组内的残基中，下述残基的暴露程度＞5％(参见下表)18、31-33、36、38、40、48、50、56-62、64、78、88、91-93、104-106、120、136、225、227-229、250、262、268。这些残基中，有3个半胱氨酸参与二硫键形成，因而由于结构上的原因，对它们不进行突变。建议在H.lanuginosa脂肪酶(TIB)中进行下述突变A18K，G31K，T32K，N33K，G38K，A40K，D48K，T50K，E56K，D57K，S58K，G59K，V60K，G61K，D62K，T64K，L78K，N88K，G91K，N92K，L93K，S105K，G106K，V120K，P136K，G225K，L227K，V228K，P229K，P250K，F262K。实施例2的有关数据# TIBNOH2O#残基面积GLU_1110.792610VAL_218.002457SER_353.019516GLN_485.770164ASP_5107.565826LEU_633.022659PHE_734.392754ASN_884.855331GLN_9 39.175591PHE_10 2.149547ASN_11 40.544380LEU_12 27.648788PHE_13 2.418241ALA_14 4.625293GLN_15 28.202387TYR_16 0.969180SER_17 0.000000ALA_18 7.008336ALA_19 0.000000ALA_20 0.000000TYR_21 6.947358CYS_22 8.060802GLY_23 32.147034LYS_24 168.890747ASN_25 8.014721ASN_26 11.815564ASP_27 92.263428ALA_28 18.206699PRO_29 83.188431ALA_30 69.428421GLY_31 50.693439THR_32 52.171135ASN_33 111.230743ILE_34 2.801945THR_35 82.130569CYS_36 17.269245THR_37 96.731941GLY_38 77.870995ASN_39 123.051003ALA_40 27.985256CYS_41 0.752820PRO_42 46.258949GLU_43 69.773987VAL_44 0.735684GLU_45 77.169510LYS_46 141.213562ALA_47 10.249716ASP_48 109.913902ALA_49 2.602721THR_50 32. 012184PHE_51 8.255627LEU_52 60.093613TYR_53 77.877937SER_54 26.980494PHE_55 10.747735GLU_56 112.689758ASP_57 92.064278SER_58 32.990780GLY_59 53.371807VAL_60 83.563644GLY_61 69.625633ASP_62 75.520988VAL_63 4.030401THR_64 8.652839GLY_65 0.000000PHE_66 0.268693LEU_67 11.822510ALA_68 0.537387LEU_69 30.243870ASP_70 0.000000ASN_71 84.101044THR_72 89.271126ASN_73 70.742401LYS_74 98.319168LEU_75 8.329495ILE_76 5.197878VAL_77 0.806080LEU_78 5.293978SER_79 0.000000PHE_80 2.079151ARG_81 41.085312GLY_82 1.471369SER_83 43.794014ARG_84 100.261627SER_85 70.607552ILE_86 59.696865GLU_87 136.510773ASN_88 119.376373TRP_89 102.851227ILE_90 78.068588GLY_91 60.783607ASN_92 45.769428LEU_93 134.228363ASN_94 101.810959PHE_95 41.212212ASP_96 79.645950LEU_97 25.281572LYS_98 88.840263GLU_99 132.377090ILE_100 9.135575ASN_101 63.444527ASP_102 88.652847ILE_103 33.470661CYS_104 11.553816SER_105 99.461174GLY_106 40.325161CYS_107 4.433561ARG_108 97.450104GLY_109 1.343467HIS_110 4.652464ASP_111 37.023655GLY_112 29.930408PHE_113 14.976435THR_114 10.430954SER_115 40.606895SER_116 13.462922TRP_117 10.747735ARG_118 114.364281SER_119 46.880249VAL_120 13.434669ALA_121 18.258261ASP_122 110.753098THR_123 69.641922LEU_124 17.090784ARG_125 73.929977GLN_126 101.320190LYS_127 84.450241VAL_128 6.448641GLU_129 47.700993ASP_130 75.529091ALA_131 11.340775VAL_132 27.896025ARG_133 153.136490GLU_134 132.140594HIS_135 54.553406PRO_136 97.386963ASP_137 22.653191TYR_138 35.392658ARG_139 74.321243VAL_140 10.173222VAL_141 0.233495PHE_142 3.224321THR_143 0.000000GLY_144 0.000000HIS_145 4.514527SER_146 15.749787LEU_147 40.709171GLY_148 0.000000GLY_149 0.000000ALA_150 0.537387LEU_151 22.838938ALA_152 0.268693THR_153 18.078798VAL_154 7.254722ALA_155 0.000000GLY_156 0.000000ALA_157 15.140230ASP_158 41.645477LEU_159 6.144750ARG_160 41.939716GLY_161 68.978180ASN_162 68.243805GLY_163 79.181274TYR_164 36.190247ASP_165 103.068283ILE_166 0.000000ASP_167 24.326443VAL_168 4.299094PHE_169 0.466991SER_170 3.339332TYR_171 0.000000GLY_172 0.000000ALA_173 12.674671PRO_174 13.117888ARG_175 10.004488VAL_176 21.422220GLY_177 2.680759ASN_178 21.018063ARG_179 110.282166ALA_180 33.210381PHE_181 4.567788ALA_182 3.897251GLU_183 76.354004PHE_184 71.225983LEU_185 24.985012THR_186 47.023815VAL_187 98.244606GLN_188 54.152954THR_189 88.660645GLY_190 24.792120GLY_191 10.726818THR_192 45.458744LEU_193 16.633211TYR_194 34.829491ARG_195 29.030851ILE_196 1.973557THR_197 3.493014HIS_198 1.532270THR_199 34.785877ASN_200 39.789238ASP_201 0.000000ILE_202 31.168434VAL_203 29.521076PRO_204 3.515322ARG_205 44.882454LEU_206 51.051746PRO_207 12.575329PRO_208 43.259636ARG_209 113.700233GLU_210 154.628540PHE_211 112.505188GLY_212 30.084938TYR_213 3.268936SER_214 12.471436HIS_215 23.354481SER_216 16.406200SER_217 14.665598PRO_218 17.240993GLU_219 13.145291TYR_220 18.718306TRP_221 39.229233ILE_222 5.105175LYS_223 120.739983SER_224 15.407301GLY_225 29.306646THR_226 66.806862LEU_227 122.682808VAL_228 60.923004PRO_229 104.620377VAL_230 23.398251THR_231 63.372971ARG_232 80.357857ASN_233 89.255066ASP_234 43.011250ILE_235 2.114349VAL_236 45.140491LYS_237105.651306ILE_23824.671705GLU_239116.891907GLY_24031.965794ILE_24146.278099ASP_24228.963699ALA_24325.158146THR_24498.351440GLY_24543.842186GLY_2460.700486ASN_2473.926274ASN_24851.047890GLN_24966.699188PRO_250132.414047ASN_25170.213730ILE_252141.498062PRO_25359.089233ASP_25459.010895ILE_25563.298943PRO_25678.608688ALA_2570.806080HIS_2583.761708LEU_25950.747856TRP_26035.229710TYR_2615.440791PHE_26236.457939GLY_26322.071375LEU_264109.148178ILE_2652.418241GLY_26617.730062THR_26768.217873CYS_26815.418195LEU_269165.990997Subset RESTrestmole.listSubset RESTTIB5，8-9，13-14，16，18-20，31-34，36，38，40，48-50，56-66，68，76-79，88，91-93，TIB100-107，116-117，119-121，132-134，136，139-142，154-169，177-185，TIB187，189-191，207-212，214-216，225，227-229，241-244，250，262，268restatom. listSubset RESTTIBASP 5N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBASN 8N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBGLN 9N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2TIBPHE 13N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBALA 14N，CA，C，O，CBTIBTYR 16N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBALA 18N，CA，C，O，CBTIBALA 19N，CA，C，O，CBTIBALA 20N，CA，C，O，CBTIBGLY 31N，CA，C，OTIBTHR 32N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBASN 33N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBILE 34N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBCYS 36N，CA，C，O，CB，SGTIBGLY 38N，CA，C，OTIBALA 40N，CA，C，O，CBTIBASP 48N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBALA 49N，CA，C，O，CBTIBTHR 50N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBGLU 56N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBASP 57N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBSER 58N，CA，C，O，CB，OGTIBGLY 59N，CA，C，OTIBVAL 60N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBGLY 61N，CA，C，OTIBASP 62N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBVAL 63N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBTHR 64N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBGLY 65N，CA，C，OTIBPHE 66N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBALA 68N，CA，C，O，CBTIBILE 76N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBVAL 77N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBLEU 78N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBSER 79N，CA，C，O，CB，OGTIBASN 88N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBGLY 91N，CA，C，OTIBASN 92N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBLEU 93N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBILE 100N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBASN 101N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBASP 102N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBILE 103N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBCYS 104N，CA，C，O，CB，SGTIBSER 105N，CA，C，O，CB，OGTIBGLY 106N，CA，C，OTIBCYS 107N，CA，C，O，CB，SGTIBSER 116N，CA，C，O，CB，OGTIBTRP 117N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，NE1，CE2，CE3，CZ2，CZ3，CH2TIBSER 119N，CA，C，O，CB，OGTIBVAL 120N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBALA 121N，CA，C，O，CBTIBVAL 132N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBARG 133N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBGLU 134N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBPRO 136N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBARG 139N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBVAL 140N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBVAL 141N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBPHE 142N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBVAL 154N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBALA 155N，CA，C，O，CBTIBGLY 156N，CA，C，OTIBALA 157N，CA，C，O，CBTIBASP 158N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBLEU 159N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBARG 160N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBGLY 161N，CA，C，OTIBASN 162N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2
TIBGLY 163N，CA，C，OTIBTYR 164N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBASP 165N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBILE 166N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBASP 167N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBVAL 168N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBPHE 169N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBGLY 177N，CA，C，OTIBASN 178N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBARG 179N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBALA 180N，CA，C，O，CBTIBPHE 181N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBALA 182N，CA，C，O，CBTIBGLU 183N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBPHE 184N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBLEU 185N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBVAL 187N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBTHR 189N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBGLY 190N，CA，C，OTIBGLY 191N，CA，C，OTIBPRO 207N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBPRO 208N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBARG 209N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBGLU 210N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBPHE 211N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBGLY 212N，CA，C，OTIBSER 214N，CA，C，O，CB，OGTIBHIS 215N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2TIBSER 216N，CA，C，O，CB，OGTIBGLY 225N，CA，C，OTIBLEU 227N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBVAL 228N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBPRO 229N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBILE 241N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBASP 242N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBALA 243N，CA，C，O，CBTIBTHR 244N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBPRO 250N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBPHE 262N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBCYS 268N，CA，C，O，CB，SGSubset SUB5Bsub5mole.listSubset SUB5BTIB3-4，6-7，10-12，15，22-23，25-30，35，37，39，41-42，44-47，51-55，67，69-70，TIB72，74-75，94-99，108-112，114-115，118，122-126，128-131，135，137-138，TIB186，188，192-195，213，217-219，223-224，230-231，234-235，238-240，TIB245，269sub5batom.listSubset SUB5BTIBSER 3N，CA，C，O，CB，OGTIBGLN 4N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2TIBLEU 6N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBPHE 7N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBPHE 10N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBASN 11N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBLEU 12N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBGLN 15N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2TIBCYS 22N，CA，C，O，CB，SGTIBGLY 23N，CA，C，OTIBASN 25N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBASN 26N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBASP 27N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBALA 28N，CA，C，O，CBTIBPRO 29N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBALA 30N，CA，C，O，CBTIBTHR 35N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBTHR 37N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBASN 39N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBCYS 41N，CA，C，O，CB，SGTIBPRO 42N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBVAL 44N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBGLU 45N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBLYS 46N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZTIBALA 47N，CA，C，O，CBTIBPHE 51N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBLEU 52N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBTYR 53N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBSER 54N，CA，C，O，CB，OGTIBPHE 55N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBLEU 67N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBLEU 69N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBASP 70N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBTHR 72N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBLYS 74N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZTIBLEU 75N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBASN 94N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBPHE 95N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBASP 96N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBLEU 97N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBLYS 98N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZTIBGLU 99N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBARG 108N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBGLY 109N，CA，C，OTIBHIS 110N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2TIBASP 111N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBGLY 112N，CA，C，OTIBTHR 114N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBSER 115N，CA，C，O，CB，OGTIBARG 118N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBASP 122N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBTHR 123N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBLEU 124N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBARG 125N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBGLN 126N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2TIBVAL 128N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBGLU 129N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBASP 130N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBALA 131N，CA，C，O，CBTIBHIS 135N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2TIBASP 137N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBTYR 138N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OH
TIBTHR 186N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBGLN 188N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2TIBTHR 192N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBLEU 193N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBTYR 194N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBARG 195N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBTYR 213N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBSER 217N，CA，C，O，CB，OGTIBPRO 218N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBGLU 219N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBLYS 223N，CA，C，O，CB，CG，CD，CE，NZTIBSER 224N，CA，C，O，CB，OGTIBVAL 230N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBTHR 231N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBASP 234N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBILE 235N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBILE 238N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBGLU 239N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBGLY 240N，CA，C，OTIBGLY 245N，CA，C，OTIBLEU 269N，CA，C，O，CB，OXT，CG，CD1，CD2Subset ACTSITEactsitemole.listSubset ACTSITETIB17，21，80-87，89-90，113，143-153，170-176，196-206，221-222，226，246-249，TIB251-261，263-267actsiteatom.listSubset ACTSITETIBSER 17N，CA，C，O，CB，OGTIBTYR 21N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBPHE 80N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBARG 81N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBGLY 82N，CA，C，OTIBSER 83N，CA，C，O，CB，OGTIBARG 84N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBSER 85N，CA，C，O，CB，OGTIBILE 86N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBGLU 87N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2TIBTRP 89N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，NE1，CE2，CE3，CZ2，CZ3，CH2TIBILE 90N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBPHE 113N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZTIBTHR 143N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBGLY 144N，CA，C，OTIBHIS 145N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2TIBSER 146N，CA，C，O，CB，OGTIBLEU 147N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBGLY 148N，CA，C，OTIBGLY 149N，CA，C，OTIBALA 150N，CA，C，O，CBTIBLEU 151N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBALA 152N，CA，C，O，CBTIBTHR 153N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBSER 170N，CA，C，O，CB，OGTIBTYR 171N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBGLY 172N，CA，C，OTIBALA 173N，CA，C，O，CB
TIBPRO 174N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBARG 175N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBVAL 176N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBILE 196N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBTHR 197N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBHIS 198N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2TIBTHR 199N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBASN 200N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBASP 201N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBILE 202N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBVAL 203N，CA，C，O，CB，CG1，CG2TIBPRO 204N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBARG 205N，CA，C，O，CB，CG，CD，NE，CZ，NH1，NH2TIBLEU 206N，CA，C，O，CB，CG，CD1， CD2TIBTRP221N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，NE1，CE2，CE3，CZ2，CZ3，CH2TIBILE 222N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBTHR 226N，CA，C，O，CB，OG1，CG2TIBGLY 246N，CA，C，OTIBASN 247N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBASN 248N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBGLN 249N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，NE2TIBASN 251N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2TIBILE 252N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBPRO 253N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBASP 254N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2TIBILE 255N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBPRO 256N，CA，CD，C，O，CB，CGTIBALA 257N，CA，C，O，CBTIBHIS 258N，CA，C，O，CB，CG，ND1，CD2，CE1，NE2TIBLEU 259N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBTRP260N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，NE1，CE2，CE3，CZ2，CZ3，CH2TIBTYR 261N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHTIBGLY 263N，CA，C，OTIBLEU 264N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2TIBILE 265N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1TIBGLY 266N，CA，C，OTIBTHR 267N，CA，C，O，CB，OG1，CG2Subset RESTXrestxmole.listSubset RESTXNEWMODEL14，16，18-20，31-34，36，38，40，48-50，56-66，68，78-79，88，91-93，NEWMODEL104-106，120，136，225，227-229，250，262，268restxatom.listSubset RESTXNEWMODELALA 14N，CA，C，O，CBNEWMODELTYR 16N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZ，OHNEWMODELALA 18N，CA，C，O，CBNEWMODELALA 19N，CA，C，O，CBNEWMODELALA 20N，CA，C，O，CBNEWMODELGLY 31N，CA，C，ONEWMODELTHR 32N，CA，C，O，CB，OG1，CG2NEWMODELASN 33N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELILE 34N，CA，C，O，CB，CG1，CG2，CD1NEWMODELCYS 36N，CA，C，O，CB，SGNEWMODELGLY 38N，CA，C，ONEWMODELALA 40N，CA，C，O，CBNEWMODELASP 48N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2NEWMODELALA 49N，CA，C，O，CBNEWMODELTHR 50N，CA，C，O，CB，OG1，CG2NEWMODELGLU 56N，CA，C，O，CB，CG，CD，OE1，OE2NEWMODELASP 57N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2NEWMODELSER 58N，CA，C，O，CB，OGNEWMODELGLY 59N，CA，C，ONEWMODELVAL 60N，CA，C，O，CB，CG1，CG2NEWMODELGLY 61N，CA，C，ONEWMODELASP 62N，CA，C，O，CB，CG，OD1，OD2NEWMODELVAL 63N，CA，C，O，CB，CG1，CG2NEWMODELTHR 64N，CA，C，O，CB，OG1，CG2NEWMODELGLY 65N，CA，C，ONEWMODELPHE 66N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZNEWMODELALA 68N，CA，C，O，CBNEWMODELLEU 78N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2NEWMODELSER 79N，CA，C，O，CB，OGNEWMODELASN 88N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELGLY 91N，CA，C，ONEWMODELASN 92N，CA，C，O，CB，CG，OD1，ND2NEWMODELLEU 93N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2NEWMODELCYS 104N，CA，C，O，CB，SGNEWMODELSER 105N，CA，C，O，CB，OGNEWMODELGLY 106N，CA，C，ONEWMODELVAL 120N，CA，C，O，CB，CG1，CG2NEWMODELPRO 136N，CA，CD，C，O，CB，CGNEWMODELGLY 225N，CA，C，ONEWMODELLEU 227N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2NEWMODELVAL 228N，CA，C，O，CB，CG1，CG2NEWMODELPRO 229N，CA，CD，C，O，CB，CGNEWMODELPRO 250N，CA，CD，C，O，CB，CGNEWMODELPHE 262N，CA，C，O，CB，CG，CD1，CD2，CE1，CE2，CZNEWMODELCYS 268N，CA，C，O，CB，SG实施例10提供脂肪酶变体E87K+D254K按照WO92/05249所述，构建、表达和纯化Humicola lanuginosa脂肪酶变体E87K+D254K。实施例11脂肪酶-SPEG15000偶联物按照实施例7所述制备脂肪酶变体E87K+D254K-SPEG偶联物，不同之处在于所用酶为实施例10所述的Humicola lanuginosa脂肪酶变体(E87K+D254K)，聚合物是mPEG15000。实施例12Balb/c小鼠中脂肪酶变体(D87K+D254K)评估为IgG1的免疫原性通过皮下注射下述物质免疫Balb/c小鼠i)0.9％(wt/vol)NaCl溶液50μl(对照组，8只小鼠)(对照)，ii) 含有25μg Humicola lanuginosa脂肪酶变体(E87K+D254K)蛋白质的0.9％(wt/vol)NaCl溶液50μl(组1，8只小鼠)(未修饰的脂肪酶变体)，iii)含有在D87K+D254K位置发生了取代、并偶联至经N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化了的mPEG15000上的Humicola lanuginosa脂肪酶变体的0.9％(wt/vol)NaCl溶液50％(组2，8只小鼠)(脂肪酶-SPEG15000)。
通过光密度测量，得到每一批号的蛋白质量。免疫接种一周之后且在下次免疫接种之前，从眼部收集血样(200μl)。通过血液凝集和离心得到血清。
采用上述的Balb/c小鼠IgG1 ELISA方法测定IgG1应答。
结果需要5次(每周1次)的免疫接种来刺激对未修饰的Humicolalanuginosa变体产生可检测的体液应答。由偶联物(即脂肪酶-SPEG15000)所刺激的抗体滴度为960-1920，与未修饰的HL82-Lipolase所刺激的抗体滴度3840相比，仅低2-4倍(左边的数字)。
结果示于图1中。
对于本领域技术人员来说，显然，根据前述的公开内容，在本发明的实施中，可以有很多改变和修饰，而仍不偏离其精神或范围。因此，本发明的范围应按照下述权利要求的实质内容理解。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)国家丹麦(F)邮政编码(ZIP)DK-2880(G)电话45 4444 8888(H)传真45 4449 3256(ii)发明题目一种被修饰的多肽(iii)序列数9(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC可兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度840个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)生物来源(B)菌株芽孢杆菌属之种的PD498，NCIMB No.40484(ix)特征
(A)名称/关键词CDS(B)位置1..840(xi)序列描述SEQ ID NO1TGG TCA CCG AAT GAC CCT TAC TAT TCT GCT TAC CAG TAT GGA CCA CAA 48Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15AAC ACC TCA ACC CCT GCT GCC TGG GAT GTA ACC CGT GGA AGC AGC ACT 96Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30CAA ACG GTG GCG GTC CTT GAT TCC GGA GTG GAT TAT AAC CAC CCT GAT 144Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45CTT GCA AGA AAA GTA ATA AAA GGG TAC GAC TTT ATC GAC AGG GAC AAT 192Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60AAC CCA ATG GAT CTT AAC GGA CAT GGT ACC CAT GTT GCC GGT ACT GTT 240Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80GCT GCT GAT ACG AAC AAT GGA ATT GGC GTA GCC GGT ATG GCA CCA GAT 288Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95ACG AAG ATC CTT GCC GTA CGG GTC CTT GAT GCC AAT GGA AGT GGC TCA 336Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110CTT GAC AGC ATT GCC TCA GGT ATC CGC TAT GCT GCT GAT CAA GGG GCA 384Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125AAG GTA CTC AAC CTC TCC CTT GGT TGC GAA TGC AAC TCC ACA ACT CTT 432Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140AAG AGT GCC GTC GAC TAT GCA TGG AAC AAA GGA GCT GTA GTC GTT GCT 480Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160GCT GCA GGG AAT GAC AAT GTA TCC CGT ACA TTC CAA CCA GCT TCT TAC 528Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175CCT AAT GCC ATT GCA GTA GGT GCC ATT GAC TCC AAT GAT CGA AAA GCA 576Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190TCA TTC TCC AAT TAC GGA ACG TGG GTG GAT GTC ACT GCT CCA GGT GTG 624Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205AAC ATA GCA TCA ACC GTT CCG AAT AAT GGC TAC TCC TAC ATG TCT GGT 672Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220ACG TCC ATG GCA TCC CCT CAC GTG GCC GGT TTG GCT GCT TTG TTG GCA 720Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240AGT CAA GGT AAG AAT AAC GTA CAA ATC CGC CAG GCC ATT GAG CAA ACC768Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255GCC GAT AAG ATC TCT GGC ACT GGA ACA AAC TTC AAG TAT GGT AAA ATC816Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270AAC TCA AAC AAA GCT GTA AGA TAC840Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度280个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度269个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)生物来源(B)菌株迟缓芽孢杆菌(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala85 90 95Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser115 120 125Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile180 185 190Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr195 200 205Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 265(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度344个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)生物来源(B)菌株Arthromyces ramosus(xi)序列描述SEQ ID NO1Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly Gly Gln1 5 10 15Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp20 25 30Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro Val Arg35 40 45Lys Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Ala50 55 60Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile65 70 75 80Ile Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly Gly Leu85 90 95Thr Asp Thr Ile Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His Gly Val100 105 110Ser Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly Met Ser Asn115 120 125Cys Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser Asn Ser130 135 140Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Asn Thr Val145 150 155 160Thr Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asp Glu165 170 175Val Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu Gly Leu180 185 190Asn Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln Val Phe195 200 205Asp Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr Thr Gln Pro210 215 220Gly Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe Pro Gly Glu225 230 235 240Phe Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala245 250 255Cys Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly Gln Arg260 265 270Tyr Arg Ala Ala Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe Asp Arg Asn275 280 285Ala Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val Ser Asn Asn290 295 300Ala Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile Glu Val305 310 315 320Ser Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr Ala Ser Gly Pro325 330 335Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro340(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度876个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)生物来源(B)菌株Humicola lanuginosa DSM4109(ix)特征(A)名称/关键词信号肽(B)位置1..66(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置67..876(ix)特征(D)名称/关键词CDS(E)位置1..876(xi)序列描述SEQ ID NO5ATG AGG AGC TCC CTT GTG CTG TTC TTT GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG 48Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu-22 -20 -15 -10GCC AGT CCT ATT CGT CGA GAG GTC TCG CAG GAT CTG TTT AAC CAG TTC 96Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5 1 5 10AAT CTC TTT GCA CAG TAT TCT GCA GCC GCA TAC TGC GGA AAA AAC AAT 144Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn15 20 25GAT GCC CCA GCT GGT ACA AAC ATT ACG TGC ACG GGA AAT GCC TGC CCC 192Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro30 35 40GAG GTA GAG AAG GCG GAT GCA ACG TTT CTC TAC TCG TTT GAA GAC TCT 240Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser45 50 55GGA GTG GGC GAT GTC ACC GGC TTC CTT GCT CTC GAC AAC ACG AAC AAA 288Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys60 65 70TTG ATC GTC CTC TCT TTC CGT GGC TCT CGT TCC ATA GAG AAC TGG ATC 336Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90GGG AAT CTT AAC TTC GAC TTG AAA GAA ATA AAT GAC ATT TGC TCC GGC 384Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly95 100 105TGC AGG GGA CAT GAC GGC TTC ACT TCG TCC TGG AGG TCT GTA GCC GAT 432Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp110 115 120ACG TTA AGG CAG AAG GTG GAG GAT GCT GTG AGG GAG CAT CCC GAC TAT 480Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr125 130 135CGC GTG GTG TTT ACC GGA CAT AGC TTG GGT GGT GCA TTG GCA ACT GTT 528Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly GLy Ala Leu Ala Thr Val140 145 150GCC GGA GCA GAC CTG CGT GGA AAT GGG TAT GAT ATC GAC GTG TTT TCA 576Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155 160 165 170TAT GGC GCC CCC CGA GTC GGA AAC AGG GCT TTT GCA GAA TTC CTG ACC 624Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr175 180 185GTA CAG ACC GGC GGA ACA CTC TAC CGC ATT ACC CAC ACC AAT GAT ATT 672Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile190 195 200GTC CCT AGA CTC CCG CCG CGC GAA TTC GGT TAC AGC CAT TCT AGC CCA 720Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro205 210 215GAG TAC TGG ATC AAA TCT GGA ACC CTT GTC CCC GTC ACC CGA AAC GAT 768Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp220 225 230ATC GTG AAG ATA GAA GGC ATC GAT GCC ACC GGC GGC AAT AAC CAG CCT 816Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235 240245 250AAC ATT CCG GAT ATC CCT GCG CAC CTA TGG TAC TTC GGG TTA ATT GGG 864Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly255 260 265ACA TGT CTT TAG 876Thr Cys Leu *270(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度292个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu-22 -20 -15 -10Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5 1 5 10Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn15 20 25Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro30 35 40Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser45 50 55Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys60 65 70Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly95 100 105Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp110 115 120Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr125 130 135Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val140 145 150Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155 160 165 170Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr175 180 185Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile190 195 200Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro205 210 215Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp220 225 230Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235 240 245 250Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly255 260 265Thr Cys Leu *270(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“R28K oligo”(xi)序列描述SEQ ID NO7gggatgtaac caagggaagc agcactcaaa cg32(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“R62K oligo”(xi)序列描述SEQ ID NO8cgactttatc gataaggaca ataaccc 27(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“R169K oligo”(xi)序列描述SEQ ID NO9caatgtatcc aaaacgttcc aaccagc 2权利要求
1.一种多肽-聚合物偶联物，其具有a)一个或多个额外的聚合分子偶联至多肽上，所述多肽已被修饰，使得与相应亲本多肽上的可用连接基团数相比，该多肽表面上的连接基团数增加了，和/或b)少一个或多个聚合分子偶联至多肽上，所述多肽已被修饰，使得与相应亲本多肽上的可用连接基团数相比，该多肽的功能性位点处或附近的连接基团数减少了。
2.根据权利要求1的偶联物，与由相应亲本酶制得的偶联物上的聚合分子数相比，其有1-25个、优选1-10个额外的聚合分子偶联到该多肽的表面上。
3.根据权利要求1和2的偶联物，其中所述额外连接基团是赖氨酸残基形式的氨基，或者是天冬氨酸或谷氨酸残基形式的羧基。
4.根据权利要求1-3中任何一项的偶联物，其中所述的额外连接基团是通过氨基酸残基的保守性取代，如精氨酸至赖氨酸的取代而制得的。
5.根据权利要求1-3中任何一项的偶联物，其中所述的额外连接基团是通过氨基酸的保守性取代、如天冬酰胺至天冬氨酸/谷氨酸的取代或者谷氨酰胺至天冬氨酸/谷氨酸的取代而制得的。
6.根据权利要求1-5中任何一项的偶联物，其中添加的连接基团所处的位置距离功能性位点5以上，优选8以上，更优选10以上。
7.根据权利要求1的偶联物，其特征在于，与在相应亲本多肽基础上制得的偶联物上的聚合分子数相比，所述偶联物上偶联到多肽的功能性位点处或者附近的聚合分子要少1-25个、优选1-10个。
8.根据权利要求7的偶联物，其中被除去的连接基团是赖氨酸残基形式的氨基，或者是天冬氨酸或谷氨酸残基形式的羧基。
9.根据权利要求7或8的偶联物，其中连接基团的除去是通过氨基的保守性取代，如赖氨酸至精氨酸的取代而达到的。
10.根据权利要求7或8的偶联物，其中连接基团的除去是通过羧基的保守性取代，如天冬氨酸/谷氨酸至天冬酰胺的取代或者天冬氨酸/谷氨酸至谷氨酰胺的取代而达到的。
11.根据权利要求1-10中任何一项的偶联物，其中被除去的连接基团所处的位置距离功能性位点5以内，优选8以内，更优选10以内。
12.根据权利要求1-11中任何一项的偶联物，其中所述连接基团广泛分布。
13.根据权利要求1-12的偶联物，其中所述偶联物的亲本多肽部分的分子量为1-100kDa，优选15-100kDa。
14.根据权利要求13的偶联物，其中所述偶联物的亲本多肽部分的分子量为1-35kDa。
15.根据权利要求14的偶联物，其中所述亲本多肽是选自下述的一种酶氧化还原酶，包括漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶，包括蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶，和脂解酶；转移酶，包括转谷氨酰胺酶(TG酶)；异构酶，包括蛋白质二硫键异构酶(PDI)。
16.根据权利要求15的偶联物，其中所述亲本酶是PD498，Savinase，BPN’，蛋白酶K，蛋白酶R，枯草杆菌蛋白酶DY，Lion Y，Rennilase，JA16，Alcalase或者Humicola lanuginosa脂肪酶，如Lipolase。
17.根据权利要求16的偶联物，其中所述偶联物的酶部分是具有下述一或多个取代的PD498变体R51K，R62K，R121K，R169K，R250K，R28K，R190K，P6K，Y7K，S9K，A10K，Y11K，Q12K，D43K，Y44K，N45K，N65K，G87K，I88K，N209K，A211K，N216K，N217K，G218K，Y219K，S220K，Y221K，G262K。
18.根据权利要求17的偶联物，其具有下述突变之一R28K+R62K，R28K+R169K，R62K+R169K，R28K+R69K+R169K。
19.根据权利要求16的偶联物，其中所述偶联物的酶部分是具有下述一或多个取代的Savinase变体R10K，R19K，R45K，R145K，R170K，R186K，R247K，K94R，P5K，P14K，T22K，T38K，H39K，P40K，L42K，L75K，N76K，L82K，P86K，S103K，V104K，S105K，A108K，A133K，T134K，L135K，Q137K，N140K，N173K，N204K，Q206K，G211K，S212K，T213K，A215K，S216K，N269K。
20.根据权利要求16的偶联物，其中所述偶联物的酶部分是具有下述一或多个取代的Humicola lanuginosa脂肪酶变体R133K，R139K，R160K，R179K，R209K，R118K，R125K，A18K，G31K，T32K，N33K，G38K，A40K，D48K，T50K，E56K，D57K，S58K，G59K，V60K，G61K，D62K，T64K，L78K，E87K，N88K，G91K，N92K，L93K，S105K，G106K，V120K，P136K，G225K，L227K，V228K，P229K，P250K，D254K，F262K。
21.根据权利要求20的偶联物，其具有下述突变E87K+D254K。
22.根据权利要求1-21中任何一项的偶联物，其中偶联至多肤上的聚合分子的分子量为1-60kDa，特别是1-35kDa，尤其是3-25kDa。
23.根据权利要求22的偶联物，其中所述聚合分子选自包含天然或合成同聚物和异聚物的组中，该组包括含下述的合成聚合分子分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸、聚(乙烯吡咯烷酮)和聚D，L-氨基酸，或者含下述的天然存在的聚合分子；葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，和纤维素，如甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素，以及聚氨基葡糖的水解产物，淀粉，如羟乙基淀粉、羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖，瓜尔胶，菊粉，支链淀粉，合成生物聚合胶，角叉菜胶，果胶和藻酸。
24.制备改良的多肽-聚合物偶联物的方法，包括以下步骤a)鉴定出位于所述亲本多肽的3D结构表面上的氨基酸残基，b)选择出所述待突变的亲本多肽的所述3D结构表面上的目标氨基酸残基，c)i)用具有合适连接基团的氨基酸残基取代步骤b)中选定的一个或多个氨基酸残基或者在所选位点插入所述氨基酸残基，和/或ii)取代或者删除步骤b)中选定的、功能性位点处或者附近的一个或多个氨基酸残基，d)将聚合分子偶联到已突变的多肽上。
25.根据权利要求24的方法，其中步骤a)中所指的位于多肽表面上的氨基酸残基的鉴定是利用计算机程序分析所述亲本多肽3D结构进行的。
26.根据权利要求24的方法，其中步骤b)包括选择出亲本多肽表面上的精氨酸或赖氨酸残基。
27.根据权利要求24的方法，其中，在步骤c)中，用赖氨酸残基取代步骤b)中鉴定出的一个或多个精氨酸残基。
28.根据权利要求27的方法，其中被取代的精氨酸残基所处的位置距离功能性位点5以上，优选8以上，特别是10以上。
29.根据权利要求24-28中任何一项的方法，其中将步骤c)中制得的多肽与聚合分子偶联。
30.权利要求1-23中的偶联物在降低工业产品变应原性中的用途。
31.权利要求1-23中的偶联物在降低药物免疫原性中的用途。
32.含有权利要求1-23中任何一项的偶联物以及工业产品中所用成分的一种组合物。
33.根据权利要求32的组合物，其中所述工业产品是洗涤剂，如洗衣、洗盘子或硬表面清洁产品，或者是食品或饲料产品。
34.根据权利要求32的组合物，其中含有权利要求1-22中任何一项的偶联物以及皮肤护理产品中使用的成分。
35.含有权利要求1-23中任何一项的偶联物以及药物中所用成分的组合物。
全文摘要
本发明涉及已添加和/或除去了位于多肽结构表面上用以偶联聚合分子之一个或者多个连接基团的多肽－聚合物偶联物,制备本发明多肽－聚合物偶联物的方法,以及所述偶联物用于降低含有所述偶联物之组合物的免疫原性和变应原性的用途。
文档编号C12N15/57GK1246891SQ9880236
公开日2000年3月8日 申请日期1998年2月6日 优先权日1997年2月6日
发明者C·冯德奥斯滕, A·A·奥尔森, E·L·罗根 申请人:诺沃挪第克公司