含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA其制备方法及用途
【专利摘要】本发明公开了含自由三磷酸基团的谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS）特异性siRNA（ppp-GLS）、制备方法及其应用。ppp-GLS的反义链和正义链序列5’端均为鸟嘌呤核苷，该鸟嘌呤核苷的戊糖5’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。本发明ppp-GLS可在制备治疗肿瘤特别是神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌、肝癌的药物中应用。
【专利说明】含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA其制备方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于RNA干扰技术治疗领域，涉及siRNA及其制备方法和应用，具体涉及含自由三磷酸基团的特异性siRNA靶向肿瘤代谢关键酶GLS，及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤细胞不受限制的生长增殖依赖于其快速的能量供应和胞内氧化还原平衡系统，有氧糖酵解(Glycolysis,也称Warburg effect)和谷氨酰胺酵解(Glutaminolysis)是肿瘤细胞满足上述要求的两个关键步骤。通过有氧糖酵解途径，肿瘤细胞将大部分的葡萄糖(Glucose)催化水解产生乳酸，快速产生ATP等高能分子；同时由于进入三羧酸循环(TCAcycle)的丙酮酸减少(Matthew G et al.Science.2009),肿瘤细胞通过高表达谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)来催化谷氨酰胺产生谷氨酸,谷氨酸进一步水解产生a_酮戍二酸进入三羧酸循环，以补充因有氧糖酵解而减少的TCA循环生物总量，并且通过这个替代途径为肿瘤细胞快速的分裂增殖补充能量、碳骨架、核酸和脂质合成的中间产物等。此外，谷氨酰胺酵解还提供细胞抗氧化系统中最为关键的分子一谷胱甘肽(Glutathione，GSH),能够有效清除肿瘤细胞旺盛代谢所产生的氧自由基等活性氧(R0S)，维持细胞内的氧化还原平衡(Erickson Jff and Cerione RA.0ncotarget.2010)。综上，谷氨酰胺酵解途径对于肿瘤细胞的生长增殖至关重要，因而使GLS成为一个抗肿瘤的潜在靶点。
[0003]科学家已经发现一些GLS的化学抑制剂，但治疗效果均不甚理想，可能与肿瘤细胞产生的耐药性、药物靶向特异性不足及毒副作用有关。小干扰RNA技术直接沉默目的基因是目前最有效而且最特异的手段。这种含21-23个碱基对的特异双链RNA序列，其反义链能靶向识别这些分子相应的信使RNA (mRNA),并在相关酶的协同作用下，剪切mRNA从而干预目的蛋白的合成。但在抗肿瘤领域，小干扰RNA的靶向的特异性决定了其作用机制的单一性，从而使其抗肿瘤治疗效果并不理`想。
【发明内容】
[0004]发明人通过大量实验设计并筛选出多条具有良好基因沉默功能的人GLS特异性siRNA，通过设计5’ 一 3’端依次含有GLS特异性siRNA的cDNA序列、胞嘧啶核苷及T7RNA聚合酶启动子序列的DNA模板，在体外利用T7RNA聚合酶转录合成得到含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA (以下简称ppp-GLS)，其特征为5’端为一鸟嘌呤核苷，在该鸟嘌呤核苷的戊糖5’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。
[0005]该ppp-GLS的显著性效果表现为:
(I)本发明ppp-GLS能有效地特异性沉默肿瘤代谢关键酶一谷氨酰胺酶(GLS)蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的代谢过程，显著降低肿瘤细胞内ATP水平，从而有效地抑制肿瘤细胞生长增殖。
[0006](2)本发明ppp-GLS，一方面由于含自由三磷酸基团的siRNA能够上调胞内ROS的产生；另一方面，通过沉默GLS显著性地抑制胞内关键的抗氧化分子谷胱甘肽，破坏肿瘤细胞对ROS的清除作用，从而能够协同作用，使肿瘤细胞内的ROS大量累积，诱发肿瘤细胞死亡。
[0007](3)本发明ppp-GLS为5’端含自由三磷酸基团的siRNA，是胞浆内视磺酸诱导基因-1 (RIG-1)的特异性配体，能激活固有免疫信号通路，并分泌多种细胞因子，活化机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用；同时能够大幅度上调肿瘤细胞表面I类抗原递呈分子的表达，阻断肿瘤免疫逃逸。
[0008](4)本发明ppp-GLS能激活肿瘤细胞内源性凋亡通路，大幅度上调Noxa、Caspase，PARP等前凋亡蛋白和凋亡蛋白的表达，诱导肿瘤细胞的程序性死亡。
[0009]本发明的特色是将上述4种独特的抗肿瘤功能融合于一个分子。对比于传统的小干扰RNA (OH-RNA, 一种直接体外化学合成的siRNA，其5’端核苷C-5上仅含有一个自由羟基，而不含有磷酸分子)、非特异性的含自由三磷酸基团的siRNA (简称ppp-RNA)和其它靶向GLS的化学药物有着更加显著的优势:更有效地促进了肿瘤细胞的死亡和抑制肿瘤生长；该药物并不存在肿瘤细胞产生耐药性的问题(如对化疗药物的耐药)；更重要的是，该药物对正常细胞并无毒性作用。
[0010]所述的GLS特异性SiRNA序列分别为ppp-GLSl，其正义链序列如SEQ ID N0.1所示，反义链序列如SEQ ID N0.2所示；或ppp-GLS2,其正义链序列如SEQ ID N0.3所示，反义链序列如SEQ ID N0.4所示；或ppp-GLS3,其正义链序列如SEQ ID N0.5所示，反义链序列如SEQ ID N0.6所示；或ppp-GLS4，其正义链序列如SEQ ID N0.7所示，反义链序列如SEQID N0.8所不。序列详细喊基对见序列表。
[0011]本发明的另一目的是提供该siRNA的用途:
本发明所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
[0012]本发明所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA在制备治疗神经胶质瘤的药物中的用途。
[0013]本发明所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
[0014]本发明所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA在制备治疗肺癌的药物中的用途。
[0015]本发明所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA在制备治疗肝癌的药物中的用途。
[0016]本发明还提供了治疗肿瘤的药物组合物，其包含本发明所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA。
[0017]本发明还提供了含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA的设计筛选、模板合成、体外转录和提纯检测的方案，其包括如下步骤:
步骤一、siRNA的设计与筛选:根据PUBMED基因库中，人GLS mRNA完整编码序列，使用siRNA设计软件设计筛选出数条相应匹配的反义短序列，各含19对核糖核苷。在体外合成相应的siRNA (Invitrogen, China),并于每条单链3’端链接2个游离尿喃唳核苷,用作体外筛选及抑瘤实验的OH-GLS组。[0018]将合成的siRNA序列(0H-GLS)，在体外用脂质体(Lipofectamine 2000)按0.5微克/微升在OptiMEM培养基中混合包被，体外转染肿瘤细胞24h之后提取细胞总RNA，用定量RT-PCR方法检测GLS的mRNA量，依据GLS的抑制效果而选择抑制效果最佳的siRNA，从而得到四条 GLS 特异性 siRNA，分别为 OH-GLS1、0H-GLS2、0H-GLS3、0H-GLS4。
[0019]步骤二、模板合成:依据步骤一中筛选出siRNA的cDNA序列，在其3’端依次链接一个胞嘧啶核苷和一段T7RNA聚合酶启动子序列，作为DNA模板，交公司合成，并且在体外合成识别T7RNA聚合酶启动子序列的引物。具体方法:PCR无酶反应微管中，加入10微升杂交缓冲液、2微升引物、2微升相应的DNA模板，于70°C孵育5分钟，再于25°C孵育约25分钟。在上述PCR反应管中，加入5微升不含RNA酶的纯水、2微升Klenow缓冲液、2微升dNTP混合液(2.5mM)和I微升Exo-Minus Klenow DNA多聚酶(20单位/微升,Fermentas),置于370C孵育30分钟，以合成双链DNA。PCR反应管再于70°C孵育5分钟，以灭活剩余Exo-MinusKlenow DNA 多聚酶。
[0020]步骤三、体外转录:利用T7RNA聚合酶启动体外转录并在新合成的RNA5’端加上三磷酸基团。在灭菌PCR反应管中，加入6微升不含RNA酶的无菌纯水、2微升10xT7Running buffer,8微升NTP混合物、2微升双链DNA模板和2微升T7RNA聚合酶(Megashortskript?T7 kit, Ambion),在 37°C过夜,合成 5’端含三憐酸基团 GLS siRNA 的正义链或反义链。再将合成的正义链和反义链混合，置于37°C过夜，杂交形成稳定双链，即为ppp-GLS。在步骤一中筛选出的四条不同序列对应的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA 分别为 ppp-GLS 1、ppp-GLS2、ppp_GLS3、ppp_GLS4。
[0021]步骤四、提纯检测:利用氯仿、异戊醇、苯酚等萃取，最后过柱、离心提纯，检测RNA纯度和浓度。在步骤三合成产物中，加入2微升Turbo-DNA酶并孵育30分钟去除残存的DNA链，再加入30微升乙酸铵灭活DNA酶，将合成产物转移到1.5毫升反应管，加入115微升不含RNA酶的纯水，再加入30`0微升异戊醇:酚:氯仿混合物混合均匀，于12000g室温下离心5分钟，将上层苯酚(相)吸出，转移到新的1.5毫升EP管中，再加入300微升氯仿，混合均匀后，于12000g室温下离心5分钟，吸出上层苯酚(相)，转移至新的EP管。向苯酚/RNA混合液中加入600微升100无水乙醇，吹打均匀，将混合物置于_20°C过夜，使RNA沉淀析出，再于14000g 4°C离心30分钟，取出EP管立即置于冰上，弃去上清液，将所得的RNA沉淀溶于50微升不含RNA酶的纯水中。进一步可以将RNA加入到Mini Quick Spin Columns(Roche)过柱，离心进行提纯，最后进行RNA定量及纯度测定。
[0022]本发明综合了抗肿瘤代谢，激活抗肿瘤免疫，诱导肿瘤细胞氧化损伤，活化肿瘤细胞程序性死亡通路等多种机制，有效地解决了传统siRNA仅有单一基因沉默功能，而治疗肿瘤疗效不佳的问题，并且绕过了化疗药物容易使肿瘤细胞产生耐药性的问题，同时具有良好的安全性。本发明ppp-GLS siRNA及其应用有着预料不到的技术效果，具有突出的实质性特点，而且PPP-GLS siRNA用于肿瘤治疗相比于传统方法有着显著性的进步，证实本发明在肿瘤的生物治疗领域具有极大的进步意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为实施例2实时定量PCR技术检测ppp-GLS的基因沉默功能:ppp-GLS转染多种肿瘤细胞株24h，检测不同序列的基因沉默功能。图1A、B、C、D分别代表U251 (人胶质细胞瘤)、A549 (人非小细胞肺癌)、patu-8988t (人胰腺癌)、H印G2 (人肝癌)细胞株。GLSl、GLS2、GLS3、GLS4分别代表筛选出的四对不同的GLS siRNA序列，下图同。
[0024]图2为实施例3实时定量PCR技术检测ppp-GLS的免疫诱导功能:ppp-GLS转染多种肿瘤细胞株24h，检测不同序列合成的ppp-GLS显著上调I型干扰素(IFN-β )的功能。图2A、B、C、D分别代表U251 (人胶质细胞瘤)、A549 (人非小细胞肺癌)、patu_8988t (人胰腺癌)、HepG2 (人肝癌)细胞株。
[0025]图3为实施例3实时定量PCR技术检测ppp-GLS的免疫诱导功能:ppp-GLS转染多种肿瘤细胞株24 h，检测不同序列合成的ppp-GLS的可以显著上调趋化因子CXCLlO(IP-10)的功能。图3A、B、C、D分别代表U251 (人胶质细胞瘤)、A549 (人非小细胞肺癌)、patu_8988t (人膜腺癌)、HepG2 (人肝癌)细胞株。 [0026]图4为实施例4流式细胞术(FACS)检测ppp-GLS活化抗肿瘤免疫的功能:ppp-GLS转染多种肿瘤细胞株24 h，检测不同序列合成的ppp-GLS的诱导I型抗原呈递分子HLA-ABC高表达的功能，其中Isotype为同型对照抗体。
[0027]图5为实施例5检测ppp-GLS促进肿瘤细胞死亡的功能:ppp-GLS转染多种肿瘤细胞株48小时，检测不同序列合成的ppp-GLS大量促进细胞死亡。
[0028]图6为实施例6检测ppp-GLS诱导细胞凋亡的功能:ppp-GLS转染肿瘤细胞株U251、patu-8988t 48 h, Annexin V/PI检测ppp-GLS诱导的细胞凋亡率。图6A、B分别为
三次试验统计结果。
[0029]图7为实施例7检测ppp-GLS抑制肿瘤细胞能量代谢的功能:ppp-GLS转染多种肿瘤细胞株48 h，检测不同序列合成的ppp-GLS显著性抑制肿瘤细胞能量代谢的功能。图7A、B、C、D 分别为 U251、patu-8988t、A549、！fepG2 细胞。
[0030]图8为实施例8检测ppp-GLS对肿瘤细胞内ROS水平的影响:分别用OH-control，ppp-control, OH-GLS和ppp-GLS转染多种肿瘤细胞株48 h,检测ppp-RNA上调细胞ROS的作用，检测不同序列合成的ppp-GLS显著性增加肿瘤细胞内ROS的水平。图8A、B、C、D分别为U251、patu-8988t、A549、H印G2细胞。同时验证了 ppp-GLS对关键抗氧化分子GSH的抑制作用。图8E、8F分别为U251、patu-8988t细胞。
[0031]图9为实施例9在蛋白水平上，用免疫印迹检测ppp-GLS的基因沉默，激活抗肿瘤免疫，诱导细胞死亡，抑制肿瘤代谢的功能ΦΡΡ-GLS转染肿瘤细胞株U251、patu-8988t48 h。图9A是基因沉默功能检测，图9B是诱导细胞凋亡功能检测，图9C是活化免疫分子检测，图9D是抑制肿瘤代谢检测。
[0032]图10为实施例10检测ppp-GLS对于正常细胞的安全性:ppp-GLS转染正常细胞人脐静脉内皮细胞HUVEC，检测细胞活率，判断ppp-GLS对正常细胞安全性。
【具体实施方式】
[0033]实施例1本发明ppp-GLS siRNA的合成 1.1 GLS特异小干扰RNA的设计和筛选:
根据PUBMED基因库中，人GLS mRNA完整编码序列，使用siRNA设计软件设计筛选出数条相应匹配的反义短序列，各含19对核糖核苷。在体外合成相应的siRNA (Invitrogen,China),并于每条单链3’端链接2个游离尿嘧啶核苷，用作体外筛选和抑瘤实验的OH-GLS组。
[0034]将合成的siRNA序列(0H-GLS)，在体外用脂质体(Lipofectamine 2000)按0.5微克/微升在OptiMEM培养基中混合包被，体外转染神经胶质瘤细胞24h之后提取细胞RNA,用定量RT-PCR方法检测GLS的mRNA表达量，最后选择抑制效果最佳的siRNA，从而得到四条GLS特异性siRNA，其序列分别表示为GLS1、GLS2、GLS3、GLS4，普通siRNA分别为 0H-GLS1、0H-GLS2、0H-GLS3、0H-GLS4，其含自由三磷酸基团的 siRNA 分别为 ppp-GLSl、ppp_GLS2、ppp_GLS3、ppp_GLS4。
[0035]同时，设计并合成一对无意义siRNA,含自由三磷酸基团的siRNA为ppp-control,其正义链序列为SEQ ID N0.9,反义链序列为SEQ ID N0.10,该序列通过与PUBMED基因库中相关mRNA进行匹配分析，证实无任何干扰作用。合成时为增强其稳定性，于每条单链3’端链接2个游离尿嘧啶核苷。该3’端链接2个UU的无意义siRNA，在考察抑瘤效果时作为OH-RNA对照。
[0036]合成ppp-GLS的DNA模板设计:
根据1.1筛选得到的序列，在相应的正义链或反义链的cDNA序列的3’端依次链接一个胞嘧啶核苷和一段T7RNA聚合酶启动子序列，作为编码相应的ppp-GLS正义链或反义链的DNA模板,送交基因公司(Invitrogen, China)合成,序列见表1。其中胞嘧唳的加入是为了增强转录效率，T7RNA聚合酶启动子序列的加入是使T7RNA聚合酶能特异识别并启动从5’端向3’端的转录，从而得到在5’端核糖核苷的戊糖5’位点上修饰有一自由三磷酸基团转录的产物，即ppp-GLS。
[0037]表1.合成ppp-GLS的DNA模板
类别I序列.含自由三磷酸基团的人GLS特异性SiRNA正义链DNA模板ISEQIDN0.11
含自由三磷酸基团的人GLS特异性`siRNA反义链DNA模板ISEQIDN0.12
含自由三磷酸基团的人GLS特异性siRNA正义链DNA模板2SEQIDN0.13
含自由三磷酸基团的人GLS特异性siRNA反义链DNA模板2SEQIDN0.14
含自由三磷酸基团的人GLS特异性siRNA正义链DNA模板3SEQIDN0.15
含自由三磷酸基团的人GLS特异性siRNA反义链DNA模板3SEQIDN0.16
含自由三磷酸基团的人GLS特异性siRNA正义链DNA模板4SEQIDN0.17
含自由三磷酸基团的人GLS特异性siRNA反义链DNA模板4SEQIDN0.18
无意义siRNA正义链DNA模板SEQIDN0.19
无意义siRNA反义链DNA模板Iseqidn0.20
1.3DNA模板双链的合成:
A.弓丨物与模板链杂交:体外合成识别T7RNA聚合酶启动子序列的引物。于PCR反应微管中，加入10微升杂交缓冲液、2微升引物、2微升相应的DNA模板，于70°C孵育5分钟，再于25 °C孵育约25分钟。
[0038]B.在上述PCR反应管中，加入5微升不含RNA酶的纯水、2微升Klenow缓冲液、2微升dNTP混合液(2.5mM)和I微升Exo-Minus Klenow DNA多聚酶(20单位/微升，Fermentas)，置于37°C孵育30分钟，以合成双链DNA。PCR反应管再于70°C孵育5分钟，以灭活剩余Exo-Minus Klenow DNA多聚酶。
[0039]体外转录:
含自由三磷酸基团siRNA合成的原理:T7RNA聚合酶能特异识别DNA模板链上的T7RNA聚合酶启动子序列，并启动从5’端向3’端(即从T7RNA聚合酶启动子端向另一端)的转录，并在RNA的转录过程中，于新合成的RNA序列5’端的首个核糖核苷戍糖5’位点上,修饰一个不被其它分子包被的自由三磷酸基团。
[0040]合成过程与反应体系:在灭菌PCR反应管中，加入6微升不含RNA酶的无菌纯水、2微升10xT7 Running缓冲液、8微升NTP混合物、2微升双链DNA模板和2微升T7RNA聚合酶(Megashortskript?T7 kit, Ambion),在 37°C过夜,合成 5’端含三憐酸基团 GLS siRNA的正义链或反义链。再将合成的正义链和反义链混合，置于37°C过夜，杂交形成稳定双链，即为ppp-GLS。四条不同的序列对应的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA分别为ppp-GLS 1、ppp-GLS2、ppp-GLS3、ppp-GLS4。利用上述方法,转录合成5’端含自由三磷酸基团的无意义siRNA,即为ppp-control。
[0041]的提纯:
在1.4合成产物中，加入2微升Turbo-DNA酶并孵育30分钟去除残存的DNA链，再加入30微升乙酸铵灭活DNA酶，将合成产物转移到1.5毫升反应管，加入115微升不含RNA酶的纯水，再加入300微升异戊醇:酚:氯仿混合物混合均匀，于12000g室温下离心5分钟，将上层苯酚(相)吸出，转移到新的1.5毫升EP管中，再加入300微升氯仿，混合均匀后，于12000g室温下离心5分钟，吸出上层苯酚(相)，转移至新的EP管。向苯酚/RNA混合液中加入600微升无水乙醇，吹打均匀，将混合物置于_20°C过夜，使RNA沉淀析出，再于14000g4°C离心30分钟，取出EP管立即置于冰上，弃去上清液，将所得的RNA沉淀溶于50微升不含RNA酶纯水中。进一步可以将RNA加入到Mini Quick Spin Columns (Roche)过柱,离心进行提纯，最后进行RNA定量及纯度测定。
[0042]实施例2实时定量PCR技术检测ppp-GLS的基因沉默功能
人胰腺癌细胞株Patu-8988t，来自于德国微生物菌种保藏中心、人神经胶质细胞瘤U251，人非小细胞肺癌A549 ，人肝癌细胞H印G2，来自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。以上肿瘤细胞株均用含有5% FBS (胎牛血清)和1%青霉素链霉素的DMEM培养基培养在37°C，5% CO2的细胞培养箱中。
[0043]转染方案:肿瘤细胞按每孔2 X IO5个细胞均匀铺种在6孔板中，过夜。用转染试剂lipofectamine2000 (Invitrogen)按照操作手册转染。每孔用 lipofectamine2000 3 μ I包裹2 μ g siRNA,使siRNA的终浓度为I μ g/ml。转染24 h之后用于RNA提取实验。
[0044]RNA提取及qRT-PCR检测:按照操作手册使用Trizol (Invitrogen)提取细胞内总RNA，然后用TaKaRa RT-PCR Master Mix (DRR0036A)按照说明书方法逆转录成cDNA，最后实时定量PCR使用ABI7300 Real-time system和SYBR Green (Roche)检测各个指标的相对表达量。引物由Invitrogen合成。qRT-PCR结果分析采用相对定量的方法分析。
[0045]结果显示:ppp-GLS特异性siRNA体外转染人类肿瘤细胞株patu_8988t，U251,A549, HepG2 24 h后，肿瘤细胞内GLS mRNA水平显著降低(见图1Α?))，并且所设计的4个GLS序列都有非常良好地基因沉默功能。
[0046]实施例3实时定量PCR技术检测ppp-GLS的免疫诱导功能 细胞株，转染方案，RNA提取和qRT-PCR方法均同实施例1。
[0047]结果显示:ppp-GLS特异性siRNA体外转染人类肿瘤细胞株patu_8988t，U251,A549, HepG2 24 h后，肿瘤细胞内I型干扰素(IFN-β )水平有非常显著上升(见图2A~D)，趋化因子CXCL10 (ΙΡ-10)也有非常显著的上升(见图3Α?))。并且所设计的4个不同GLS特异性序列合成的ppp-GLS siRNA都有非常良好地免疫诱导的功能。
[0048]实施例4流式细胞术(FACS)检测ppp-GLS激活抗肿瘤免疫的功能
ppp-GLS处理24 h后的肿瘤细胞，转染方案同实施例1，流式细胞术检测肿瘤细胞表面的1-型抗原递呈分子HLA-ABC的表达。流式细胞仪(BD FACSCalibur)使用FL-1通道检测 HLA-ABC 的表达，抗体为 HLA-ABC-FITC (eBioscience)。
[0049]结果显示:肿瘤细胞株转染ppp-GLS 24 h之后，细胞表面1-型抗原递呈分子表达均较OH-control及OH-GLS处理后有显著增高。并且4条不同序列合成的ppp-GLS都有极强的上调1-型抗原递呈分子的功能(见图4)。
[0050]实施例5检测ppp-GLS促进肿瘤细胞死亡的功能
ppp-GLS转染不同的肿瘤细胞株48 h，转染方案同实施例1，用台盼蓝染色计数的方法,计算ppp-GLS所诱导的肿瘤细胞死亡。
[0051]结果显示:ppp_GLS转染所诱导的细胞死亡率明显高于ppp-control、OH-GLS>OH-control组,并且4条不同序列合成的ppp-GLS都具有非常优秀的促进肿瘤细胞死亡的功能(见图5Α?))。表明我们设计的ppp-GLS有着比OH-GLS和ppp-control具有更显著的肿瘤杀伤效应。
[0052]实施例6检测ppp-GLS诱导细胞凋亡的功能
ppp-GLS转染U251、patu-8988t肿瘤细胞48 h，转染方案同实施例1，在流式细胞仪上用Annexin V/PI assay kit (Invitrogen)按照操作手册检测细胞凋亡率。
[0053]结果显示:ppp-GLS转染肿瘤细胞U251、patu_8988t 48 h后，细胞凋亡率明显高于 OH-control, OH-GLS 和 ppp-control 组(见图 6A/B)。
[0054]实施例7检测ppp-GLS抑制肿瘤细胞能量代谢的功能
ppp-GLS转染不同的肿瘤细胞株24 h，转染方案同实施例1，用ATP检测试剂盒(碧云天)按照操作手册检测细胞内ATP水平。
[0055]结果显示:ppp-GLS转染肿瘤细胞24 h之后，ppp-GLS处理的肿瘤细胞内ATP含量显著低于OH-control, OH-GLS和ppp-control对照组，并且4条不同序列合成的ppp-GLS都具有非常优秀的降低肿瘤细胞内ATP含量的功能(见图7k~C\
[0056] 实施例8检测ppp-GLS抑制GSH并诱导肿瘤细胞内ROS大量积累
PPP-GLS转染肿瘤细胞36 h之后，转染方案同实施例1，用ROS检测试剂盒(碧云天)按照操作手册检测细胞内ROS水平；用GSH/GSSG检测试剂盒(碧云天)按照操作手册检测细胞内GSH/GSSG比率。
[0057]结果显不:四种siRNA转染36 h之后，ppp-control能够显著上调肿瘤细胞内R0S,但胞内ROS水平在ppp-GLS处理组较ppp-control显著增加,其含量多少关系为，ppp-GLS>ppp-controI>0H-GLS>0H-controI,并且4条不同序列合成的ppp-GLS都具有非常优秀的诱导细胞内ROS水平的大幅上调的功能(见图8Α?))。同时证实，GLS的抑制显著降低细胞抗氧化关键分子GSH的胞内水平(图8E和8F)。
[0058]实施例9在蛋白水平上用免疫印迹检测ppp-GLS的基因沉默，激活抗肿瘤免疫，诱导细胞死亡，抑制肿瘤代谢的功能
肿瘤细胞patu-8988t和U251分别转染ppp-GLS 48 h，转染方案同实施例1，提取细胞总蛋白，检测GLS, IPS-1 (IFN-β promoter stimulator I), RIG-1, caspase, P RAP,Noxa, p-AMPK等蛋白的表达。
[0059]结果显示:在蛋白水平上，ppp-GLS明显抑制GLS蛋白的表达(见图9A);明显上调肿瘤细胞内免疫信号通路分子RIG-1、IPS-1蛋白表达(见图9B);显著诱导线粒体凋亡途径的caspase 3> caspase 9及Noxa蛋白的表达(见图9C);同时显著上调p-AMPK蛋白的表达(见图9D)，表明肿瘤细胞能量代谢受到抑制。
[0060]实施例10检测ppp-GLS对于正常细胞的毒性作用
人脐静脉内皮细胞HUVEC，来自于ATCC。用含有5%FBS (胎牛血清)和1%青霉素链霉素的DMEM培养基培养在37°C，5%C02的细胞培养箱中。
[0061]台盼蓝计数和Annexin V/PI方法检测ppp-GLS对于正常细胞的杀伤作用:方法同上述肿瘤细胞相同。
[0062]结果显示:ppp-GLS处理人类正常细胞HUVEC48 h后并未对细胞的活性有影响，并且4条不同序列合成的ppp-GLS均未抑制细胞的生长增殖(见图10A/B)。
参考文献
1.Erickson JW and Cerione RA.Glutaminase: A hot spot for regulation ofcancer cell metabolism? Oncotarget.2010; I (8):734-740.2.Besch R et al.Proapoptotic signaling induced by RIG-1 and MDA—5 resultsin type I interferon -1ndependent apoptosis in human melanoma cells.J.Clin.1nvest.2009; 119(8):2399-2411.3.Wang JBj Erickson JW et al.Targeting mitochondrial Glutaminase activityinhibits oncogenic transformation.Cancer cell.2010; 18 (4):207-219.
【权利要求】
1.含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA，其特征在于该GLS特异性siRNA的反义链和正义链序列5’端均为鸟嘌呤核苷，该鸟嘌呤核苷的戊糖5’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。
2.根据权利要求1所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA，其特征在于所述的GLS特异性siRNA序列选自:ppp-GLSl，其正义链序列如SEQ ID N0.1所示，反义链序列如SEQ ID N0.2所示；ppp_GLS2，其正义链序列如SEQ ID N0.3所示，反义链序列如SEQ IDN0.4所示；ppp-GLS3，其正义链序列如SEQ ID N0.5所示，反义链序列如SEQ ID N0.6所示;或PPP-GLS4,其正义链序列如SEQ ID N0.7所示，反义链序列如SEQ ID N0.8所示。
3.权利要求1或2所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述肿瘤选自胰腺癌、神经胶质细胞瘤、肺癌和肝癌。
5.治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1或2所述的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA。
6.权利要求5的药物组合物，其用于治疗选自胰腺癌、神经胶质细胞瘤、肺癌和肝癌的肿瘤。
7.含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA的制备方法，其包括以下步骤: (1)、siRNA的设计与筛选:依据GLS基因编码序列，设计多条与之匹配的反义序列，合成后转染细胞检测 ，根据GLS的抑制效果筛选序列； (2)、模板合成:根据步骤(1)中筛选出siRNA的cDNA序列，在其3’端依次链接一个胞嘧啶核苷和一段T7RNA聚合酶启动子序列，作为DNA模板，合成；利用DNA多聚酶合成模板双链； (3)、体外转录:利用T7RNA聚合酶启动体外转录并在新合成的RNA5’端加上三磷酸基团；将合成的正义链和反义链混合，置于37°C过夜,杂交形成稳定双链； (4)、提纯检测:提取、纯化步骤(3)获得的RNA稳定双链。
8.权利要求7的制备方法，其中步骤(2)中得到的DNA模板序列选自:ppp-GLSlDNA模板，其正义链序列如SEQ ID N0.11所示，反义链序列如SEQ ID N0.12所示；ppp_GLS2 DNA模板，其正义链序列如SEQ ID N0.13所示，反义链序列如SEQ ID N0.14所示；ppp_GLS3DNA模板，其正义链序列如SEQ ID N0.15所示，反义链序列如SEQ ID N0.16所示；或ppp-GLS4 DNA模板，其正义链序列如SEQ ID N0.17所示，反义链序列如SEQ ID N0.18所/Jn ο
9.权利要求7或8的制备方法，其中通过所述方法获得的含自由三磷酸基团的GLS特异性siRNA序列选自:ppp-GLSl，其正义链序列如SEQ ID N0.1所示，反义链序列如SEQ IDN0.2所示；ppp-GLS2，其正义链序列如SEQ ID N0.3所示，反义链序列如SEQ ID N0.4所示；ppp-GLS3,其正义链序列如SEQ ID N0.5所示，反义链序列如SEQ ID N0.6所示；或PPP-GLS4，其正义链序列如SEQ ID N0.7所示，反义链序列如SEQ ID N0.8所示。
【文档编号】C12N15/113GK103667287SQ201310012555
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年1月14日 优先权日:2013年1月14日
【发明者】魏继武, 孟刚, 杨婷 申请人:南京大学