一种分子标记的白鹤芋(白掌)定向选育方法
【专利摘要】本发明公开了一种分子标记的白鹤芋(白掌)定向选育方法，在白鹤芋(白掌)杂交育种的过程中引入了分子标记，且此分子标记所标记的为与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇，特别是与色泽表型密切相关的基因或基因簇；此方法不仅仅是传统杂交育种与分子标记技术的有机结合，还在整合了组培苗生产过程，因而不仅仅可以解决白鹤芋(白掌)杂交育种的选育周期长，工作量大，有较大程度随机性，不易选育出性状优良稳定的新品种的技术问题，使白鹤芋(白掌)育种具有定向性，大大提高了育种的方向性与效率，同时所选育出的白鹤芋(白掌)品种，能适用于规模化组织培养育苗。
【专利说明】—种分子标记的白鹤芋(白掌)定向选育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种白鹤芋(白掌)选育方法，特别是利用分子标记进行白鹤芋(白掌)优良性状定向选育，属于农业生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]白鹤芋(白掌)原产于南美热带雨林，现为欧洲和中东各国最流行的室内观叶植物之一，在世界各地均有栽培。白掌株高40~60厘米，具短根茎，多为丛生状。叶长圆形或近披针形，两端渐尖，基部楔形。花为佛苞，微香，呈叶状，即花并无花瓣，只是由一块白色的苞片和一条黄白色的肉穗所组成，酷似手掌，故名白掌；花大而显著，花梗长而高出叶面，白色或绿色；花期5~8月；性喜温暖湿润、半阴的环境，忌强烈阳光直射；不耐寒，生长适温为20~28°C，越冬温度为10°C以上。
[0003]白鹤芋(白掌)自人工栽培以来，不断被培育筛选出新品种，目前全世界有近30种。我国没有成功开发白鹤芋(白掌)新品种的报道，多为引进栽培，国内主要的引种载培的白鹤芋(白掌)品种有5种，即绿巨人、香水白掌、神灯白掌、大叶白掌、梦娜罗亚白掌。目前，我国对白鹤芋(白掌)人工载培的研究主要集中于利用白鹤芋(白掌)不同部位(如根的不同部位、顶芽、侧芽、肉穗花序、茎尖等)作为外植体，优化其组织培养及快速繁殖技术等方面，其目的为增加白掌组培的繁殖系数，研究层次仅仅局限于增加白掌组培苗生产数量的水平。近年也有一些学者注要到了在白鹤芋(白掌)组培苗生产过程中，因片面追求高增殖系数而过度使用植物激素而带来白掌组培苗质量不稳定的问题，比如叶片变尖或条形，团块上叶片，叶柄卷曲，甚至黄化等叶片形状表型变异问题，提出了从温度和培养基两方面着手，探索其恢复技术，但此是一种治标不治本的方法。白鹤芋(白掌)组培苗植株外观表型的变异，其深层原因必然是涉及了遗传物质的改变或基因调控上发生了变化。要彻底解决白鹤芋(白掌)组培苗的质量问题，必须从育种源头，培育筛选出优良性状稳定、耐激素刺激、适用于工厂化白鹤芋(白掌)组培苗生产的优良原种，并结合具体的白鹤芋(白掌)组培苗生产过程，研究开发出一整套技术可控的生产流程，进行标准化生产才有可能。
[0004]白鹤芋(白掌)作为一种观花室内装饰植物，其最终成品植株的花苞色泽是影响其成品价值的最要因素之一，问题是，白掌的花苞色泽表型只有成品植株时才可见，在组培苗工厂化生产过程中只能借助植株外观有无异常等直观经验进行淘选。白掌的花苞色泽表型，尤其是优质色泽白玉色系表型，和白掌的基因及基因调控过程是有关联的，这种关联可以在选种育种阶段和组培苗生产的过程中进行定性定量评估监控。
[0005]花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类合物，是植物花瓣中的主要呈色物质。花青素其基本结构母核是2-苯基苯并吡喃，大多数花素在花色基元的3_，5_，7-碳位上有取代羟基，由于A环和B环各碳位上的取代基不同(羟基或甲氧基)，成了各种各样的花青素。植物花青素生物合成途径已被研究得较为清楚(详见说明书附图图1):苯丙氨酸是花青素及其他类黄酮生物合成的直接前体，由苯丙氨酸到花青素经历3个阶段，第一阶段由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA，这是许多次生代谢共有的，该步骤受苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因活性调控。第二阶段由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢黄酮醇，是类黄酮代谢的关键反应，该阶段产生的黄烷酮和二氢黄酮醇在不同酶作用下，可转化为花青素和其他类黄酮物质。第三阶段是各种花青素的合成，至少有3个酶:二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)和类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)能够将无色的二氢黄酮醇转化成有色的花色素。其中DFR催化二氢黄酮醇进一步还原成无色花色素，再经过氧化、脱水和糖基化，不同的无色花色素变成有色的花色素苷。这些花色素苷还可进一步糖基化、甲基化和酰基化形成不同的产物。
[0006]同时，植物花青素的时空合成机制已有深入的研究。已有的研究表明(详见说明书附图图2)，不同植物中的花青素生物合成受2类基因的共同控制，一类是结构基因，其编码生物合成途径中所需的酶；另一类是调苄基因，其编码的转录因子调控结构基因的时空表达。目前已分离和鉴定了 3类花青素合成的转录因子:(1)R2R3-MYB蛋白；(2)myc家族的bHLH蛋白；(3)WD40蛋白。玉米、矮牵牛、金鱼草、紫苏、拟南芥等多种植物的花青素合成的调控基因已被鉴定，其调控机制也被基本阐明。[0007]白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇研究罕见有报道。按植物通用的基因功能推测，其中与白鹤芋(白掌)色泽表型密切相关的基因或基因簇，应包括花青素合成途径的关键酶基因及其相关转录因子基因。如花青素合成途径中关键酶基因:苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮
3-葡糖基转移酶(3GT)基因等；花青素合成途径中的重要调控因子基因，如R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因及WD40蛋白基因等。白鹤芋(白掌)色泽表型，是这些关键酶基因及调控因子综合作用的结果。换句话说，这些关键酶基因及调控因子在时空中的表达量与活性的差异，是白鹤芋(白掌)色泽差异的内在因素。具有优良色泽表型且适用于作为原种进行规模化组织培养育苗的白鹤芋(白掌)品种，花青素合成途径中关键酶基因及调控因子的基因量与表达活性应该具有合适的比例，且能消除组培育苗过程中及其后生长发育过程中激素刺激及营养条件、栽培条件差异等因素带来的波动影响，其基因量与表达活性及互相之间的比例具有高度稳定性，从而能最终保持色泽表型的高度稳定。
[0008]目前白鹤芋(白掌)新品种选育方法主要为杂交育种后通过人工栽培杂交子代选育，其选育周期长，至少要三至五年的时间，工作量大，有较大程度随机性，不易选育出性状优良稳定的新品种。
[0009]分子标记与分子标记定向育种，由于其定向选择性，可以大大提高育种效率。分子标记育种的核心技术是DNA分子标记技术，其主要有两大类:一类是基于Southern杂交的分子标记，另一类是基于PCR技术的分子标记。高密度的分子标记技术可以用于构建遗传连锁图谱，所构建的遗传连锁图谱可为基因定位、物理图谱构建和以图谱为基础的目的基因克隆奠定基础，是种质资源、育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。同时，分子标记也是数量性状位点(QTL)定位、关联遗传、突变体及其特征、相关近缘物种基因组研究等遗传育种学研究的重要技术手段。
[0010]由于白鹤芋(白掌)的基因组学及其优良性状相关的基因或基因族研究很少，特别是与茎高、叶形、花色等影响观赏性的性状关联基因研究基本没有见诸报道，在此，借鉴其它观赏植物基因组学的研究成果，提出了在白鹤芋(白掌)杂交育种的过程中，应用PCR分子标记技术标记与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的保守区域，或是包含有与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的活性关键位点的区域的技术方法，从而实现白鹤芋(白掌)优良品种的定向选育。
[0011]特别要说明的是，在此提出的白鹤芋(白掌)育种方法中，不仅仅是传统杂交育种与分子标记技术的有机结合，还在整合了组培苗生产过程，因而不仅仅可以解决白鹤芋(白掌)杂交育种的选育周期长，工作量大，有较大程度随机性，不易选育出性状优良稳定的新品种的技术问题，使白鹤芋(白掌)育种具有定向性，大大提闻了育种的方向性与效率，同时所选育出的白鹤芋(白掌)品种，能适用于规模化组织培养育苗。
【发明内容】
[0012]基于上述技术背景与理论，本发明提出了一种分子标记的白鹤芋(白掌)定向选育方法，其特征在于:在白鹤芋(白掌)杂交育种的过程中引入了分子标记，且此分子标记所标记的为与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇，特别是与色泽表型密切相关的基因或基因族；此等所被标记的基因或基因族包括但不限于花青素合成途径的关键酶基因，如苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因；此等所被标记的基因或基因簇包括但不限于花青素合成途径中的3个调控因子基因，如R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因及WD40蛋白基因。
[0013]本发明的分子标记的白鹤芋(白掌)定向选育方法包括如下程序:
[0014](I)分子标记的选择及检测:所选择的分子标记为与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的保守区域，或是包含有与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的活性关键位点的 区域，并依据上述区域分别设计一对PCR引物，用PCR方法进行检测；
[0015](2)亲本选择:选择能检测到目标分子标记的白鹤芋(白掌)作为亲本；
[0016](3)杂交:将选择的亲本通过人工授粉方式进行杂交，收集杂交所得到的种子播种萌发后得杂交后子代；
[0017](4)杂交子代分子标记检测与子代优选:抽提杂交子代不同生长发育阶段其叶片组织中的总DNA及总RNA，以此为模板，用所设计的PCR引物，分别进行PCR检测及逆转录PCR检测，考察子代中所标记的基因或基因簇的量与不同生长发育阶段的转录量的稳定性，以此为依据，优选出杂交子代；
[0018](5)优选子代组织培养扩繁:将优选出的杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁，得到优选子代的组培苗；
[0019](6)优选子代组培苗培育与淘选:将优选子代组培苗进行壮苗培育，培育过程中分阶段检测所标记的基因或基因簇的量与转录量，考察其稳定性，淘汰稳定性量较差的子代，得到适合用于通过组织培养方式进行无性扩繁育苗的杂交子代；
[0020](7)选育子代的新品种性状验证:对(6)中所得到的优选杂交子代及其无性扩繁得到的组培苗进行新品种性状验证试验，选取能通过新品种验证试验的选育子代，得到白鹤芋(白掌)新品种。
[0021]所用分子标记为与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的任意组合(如单个基因、两两组合、三三组合等)；所用分子标记分别为所选定标记基因组合中各个基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据所选定标记基因组合中各个基因的保守区域设计。
[0022]在选育优良稳定色泽表型的白鹤芋(白掌)方面，所用分子标记为花青素合成途径中的4个已经研究得较为清楚的关键酶基因(苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇
4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因)与花青素合成途径中的3个调控因子基因(R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因、WD40蛋白基因)共7个基因中的任意组合(如单个基因、两两组合、三三组合等)；所用分子标记分别为所选定标记基因组合中各个基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据所选定标记基因组合中各个基因的保守区域设计。
[0023]如:所标记为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因等2个基因组合；所用分子标记分别为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的保守区域设计。
[0024]如:所标记为二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因等3个基因组合；所用分子标记分别为二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域设计。
[0025]如:所用分子标记为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因等4个基因组合；所用分子标记分别为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域设计。
[0026]如:所用分子标记为R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因等3个基因组合；所用分子标记分别为R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的保守区域设计。
[0027]依据上述本
【发明内容】
中提出的技术方案，可以解决白鹤芋(白掌)杂交育种的选育周期长，工作量大，有较大程度随机性，不易选育出性状优良稳定的新品种的技术问题，使白鹤芋(白掌)育种具有定向性，大大提高了育种的方向性与效率，同时所选育出的白鹤芋(白掌)品种，能适用于规模化组织培养育苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1花青素生物合成途径(引自郭凤丹，王效忠，刘学英等.植物花青素生物代谢调控.[J].生命科学.2011，V23(10):939)，技术背境中提及，此图说明了当前最新研究进展中花青素生物合成途径中关键酶的种类及其作用。
[0029] 图2花青素生物合成途径调控模型(引自张宁，胡宗利，陈绪清等.植物花青素代谢途径分析及调控模型建立.[J].中国生物工程杂志.2008，28 (I):101)，技术背境中提及，此图说明了当前最新研究进展中花青素生物合成途径中调控因子的种类及其作用。【具体实施方式】
[0030]实施例1:分子标记苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因进行白鹤芋(白掌)优良色泽体系品种的定向选育
[0031](I)分子标记的选择及检测:选择与白鹤芋(白掌)花苞色泽性状密切相关的花青素生物合成途径中的关键酶，苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的保守区域作为分子标记，并依据上述区域分别设计一对PCR引物，用PCR方法进行检测。[0032]依据苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因保守区域生物信息学分析结果，设计的一对PCR检测引物(5，-TGTCGACCAGCGTCAACGG-3’、5’ -TACTCTTCGTCGTCGTCGCTGA-3’)，预期所扩增的区域长度约为Ikb左右。
[0033]依据二氢黄酮醇4 一还原酶(DFR)基因保守区域生物信息学分析结果，设计的一对 PCR 简并检测引物(5，-GGNTTCATCGGNTCDTGGCT-3’、5’ -AARTACATCCADCCDGTCAT-3’ )，预期所扩增的区域长度约为430bp左右。
[0034]以白鹤芋(白掌)叶片总DNA抽提物为模板的分子标记PCR检测方法为:
[0035]①检测苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因
[0036]PCR体系体积为 25 μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一对PAL 基因 PCR检测引物各2 μ L，白鹤芋(白掌)叶片总DNA I μ L，Taq酶0.2 μ L，灭菌蒸馏水15.3 μ L。PCR程序为:94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 50s, 30 个循环；72°C 5min。
[0037]②检测二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因
[0038]PCR体系体积为 25 μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一对DFR基因 PCR检测引物各2 μ L，白鹤芋(白掌)叶片总DNA I μ L，Taq酶0.2 μ L，灭菌蒸馏水15.3 μ L。PCR程序为:94°C 3min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 50s, 30 个循环；72°C 5min。
[0039]以白鹤芋(白掌)叶片总RNA抽提物为模板的分子标记PCR检测方法为:
[0040]①检测苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因
[0041 ] 一步法 RT-PCR 体系体积为 50 μ L: 10 X One Step RT-PCR Buffer (含有 dNTP、镁离子等)5μ L，一对 PAL 基因 PCR检测引物(10ymol/L)各 2μ L，AMV RT 0.5 μ L, RNaseinhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5μL,白鹤芋(白掌)叶片总 RNA IuL, RNasefree ddH20 38.5 μ L。RT-PCR程序为:45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 50s,30 个循环；72°C IOmin0
[0042]②检测二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因
[0043]一步法 RT-PCR 体系体积为 50 μ L: 10 X One Step RT-PCR Buffer (含有 dNTP、镁离子等)5μ L，一对 DFR基因 PCR检测引物(10ymol/L)各 2μ L，AMV RT 0.5 μ L, RNaseinhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5μL,白鹤芋(白掌)叶片总 RNA IuL, RNasefree ddH20 38.5 μ L。RT-PCR程序为:45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 50s,30 个循环；72°C IOmin0
[0044](2)亲本选择:选择能检测到目标分子标记的白鹤芋(白掌)作为亲本。用(I)中所建立的分子标记PCR检测方法，对拟做杂交育种的多株母本探戈白掌(Spathiphyllum iTango')和父本碧绿白掌(Spathiphyllum iPicolino')分别进行分子标记检测，选择苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因的量与表达量均稳定(PAL与DFR基因量约1:1，PAL与DFR的表达量比例约为1: 2)的植株作为亲本。
[0045](3)杂交:将选择的母本探戈白掌(Spathiphyllum iTango1 )和父本碧绿白掌(Spathiphyllum iPicolino;)通过人工授粉方式进行杂交,收集杂交所得到的种子播种萌发后得杂交后子代。
[0046](4)杂交子代分子标记检测与子代优选:抽提杂交子代不同生长发育阶段其叶片组织中的总DNA及总RNA，以此为模板，用所设计的PCR检测引物，分别进行PCR检测及逆转录PCR检测，考察子代中丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因的量与不同生长发育阶段的转录量的稳定性(PAL与DFR基因量约1:1 ;PAL与DFR的表达量比例约为1: 2)，优选出杂交子代。
[0047](5)优选子代组织培养扩繁:将优选出的杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁，得到优选子代的组培苗。
[0048](6)优选子代组培苗培育与淘选:将优选子代组培苗进行壮苗培育，培育过程中分阶段检测所标记的丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因的量与转录量，考察其稳定性(PAL与DFR基因量约1:1 ;PAL与DFR的表达量比例约为1: 2)，淘汰稳定性量较差的子代，得到适合用于通过组织培养方式进行无性扩繁育苗的杂交子代。
[0049](7)选育子代的新品种性状验证:对(6)中所得到的优选杂交子代及其无性扩繁得到的组培苗进行 新品种性状验证试验，选取能通过新品种验证试验的选育子代，得到白鹤芋(白掌)新品种。
[0050]实施例2:分子标记R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因进行白鹤芋(白掌)优良色泽体系品种的定向选育
[0051](I)分子标记的选择及检测:选择与白鹤芋(白掌)花苞色泽性状密切相关的花青素生物合成途径中的3个调控转录因子——R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的保守区域作为分子标记，并依据上述区域分别设计一对PCR引物，用PCR方法进行检测。
[0052]依据R2R3-MYB蛋白基因保守区域生物信息学分析结果，设计的一对PCR检测引物(5，-CAGGTGGCTAGTCATGCTCA-3’、5’ -AGATTCGGATTGTGGTGGAG-3’)，预期所扩增的区域长度约为1.1kb左右。
[0053]依据myc家族的bHLH蛋白基因保守区域生物信息学分析结果，设计的一对PCR检测引物(5，-GACAAGAAGGTGAAAGGC-3’、5’ -TATCACAGCCTGGGACCAG-3’)，预期所扩增的区域长度约为500bp左右。
[0054]依据WD40蛋白基因保守区域生物信息学分析结果，设计的一对PCR检测引物(5，-TGAATAYTGTGCTCCTTTGAC-3’、5’ -CCAAGCAATAGCATTCA-3’)，预期所扩增的区域长度约为430bp左右。
[0055]以白鹤芋(白掌)叶片总DNA抽提物为模板的上述分子标记PCR检测方法为:
[0056]①检测R2R3-MYB蛋白基因
[0057]PCR 体系体积为 25 μ L: 10 X PCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L, 一对 R2R3-MYB 蛋白基因PCR检测引物各2 μ L，白鹤芋(白掌)叶片总DNA IyL, Taq酶0.2 μ L，灭菌蒸馏水15.3 μ L。PCR 程序为:94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 70s, 30 个循环；72°C 5min。
[0058]②检测myc家族的bHLH蛋白基因
[0059]PCR体系体积为 25 μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一对myc家族的bHLH蛋白基因PCR检测引物各2 μ L，白鹤芋(白掌)叶片总DNA I μ L，Taq酶0.2 μ L，灭菌蒸馏水 15.3 μ L。PCR 程序为:94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 50s, 32 个循环；72°C 5min。
[0060]③检测WD40蛋白基因
[0061]PCR 体系体积为 25μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2 μ L，一对 WD40 蛋白基因PCR检测引物各2 μ L，白鹤芋(白掌)叶片总DNA IyL, Taq酶0.2 μ L，灭菌蒸馏水
15.3 μ L。PCR 程序为:94°C 5min ；94°C 30s, 52°C 45s, 72°C 50s, 30 个循环；72°C 5min。
[0062]以白鹤芋(白掌)叶片总RNA抽提物为模板的分子标记PCR检测方法为:
[0063]①检测R2R3-MYB蛋白基因
[0064]一步法RT-PCR体系体积为 50μ L:10X0ne Step RT-PCR Buffer (含有dNTP、镁离子等)5μ L，一对 R2R3-MYB 蛋白基因 PCR检测引物(10ymol/L)各 2 μ L，AMV RT 0.5 μ L,RNase inhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5 μ L,白鹤芋(白掌)叶片总 RNA I μ L，RNase free ddH20 38.5 μ L0 RT-PCR 程序为:45°C 20min ;94°C 5min ;94°C 30s，62°C 30s，72°C 50s, 30 个循环；72°C IOmin0
[0065]②检测myc家族的bHLH蛋白基因
[0066]一步法 RT-PCR 体系体积为 50 μ L: 10 X One Step RT-PCR Buffer (含有 dNTP、镁离子等)5 μ L，一对myc家族的bHLH蛋白基因PCR检测引物(ΙΟμ mol/L)各2 μ L，AMV RT
0.5 μ L, RNase inhibitor 0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5 μ L,白鹤芋(白掌)叶片总RNA I μ L, RNase free ddH20 38.5 μ L。RT-PCR 程序为:45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s,56°C 30s, 72°C 50s，32 个循环；72°C IOmin0
[0067]③检测WD40蛋白基因
[0068]一步法RT-PCR体系体积为 50μ L:10X0ne Step RT-PCR Buffer (含有dNTP、镁离子等)5yL，一对 WD40 蛋白基因 PCR 检测引物(lOymol/L)各 2yL，AMV RT 0.5 μ LjRNaseinhibitor0.5 μ L, Taq DNA polymerase 0.5 μ L,白鹤芋(白掌)叶片总 RNA I μ L, RNasefree ddH20 38.5 μ L。RT-PCR程序为:45°C 20min ；94°C 5min ；94°C 30s, 52°C 45s, 72°C 50s,30 个循环；72°C IOmin0
[0069](2)亲本选择:选择能检测到目标分子标记的白鹤芋(白掌)作为亲本。用(I)中所建立的分子标记PCR检测方法，对拟做杂交育种的多株母本探戈白掌(Spathiphyllum ‘Tango,)和父本碧绿白掌(Spathiphyllum iPicolino')分别进行分子标记检测，选择R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的量与表达量均稳定(R2R3-MYB、bHLH与WD40基因量约1:1:1 ;R2R3_MYB、bHLH与WD40的表达量比例约为1:1:1)的植 株作为亲本。
[0070](3)杂交:将选择的母本探戈白掌(Spathiphyllum ‘Tango')和父本碧绿白掌(Spathiphyllum iPicolino;)通过人工授粉方式进行杂交,收集杂交所得到的种子播种萌发后得杂交后子代。
[0071](4)杂交子代分子标记检测与子代优选:抽提杂交子代不同生长发育阶段其叶片组织中的总DNA及总RNA，以此为模板，用所设计的PCR引物，分别进行PCR检测及逆转录PCR检测，考察子代中R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的量与不同生长发育阶段的转录量的稳定性(R2R3-MYB、bHLH与WD40基因量约1:1:1;R2R3-MYB、bHLH与WD40的表达量比例约为1:1:1)，优选出杂交子代。
[0072](5)优选子代组织培养扩繁:将优选出的杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁，得到优选子代的组培苗。
[0073](6)优选子代组培苗培育与淘选:将优选子代组培苗进行壮苗培育，培育过程中分阶段检测所标记的R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的量与转录量，考察其稳定性(R2R3-MYB、bHLH与WD40基因量约1:1:1 ;R2R3_MYB、bHLH与WD40的表达量比例约为1:1:1)，淘汰稳定性量较差的子代，得到适合用于通过组织培养方式进行无性扩繁育苗的杂交子代。
[0074](7)选育子代的新品种性状验证:对(6)中所得到的优选杂交子代及其无性扩繁得到的组培苗 进行新品种性状验证试验，选取能通过新品种验证试验的选育子代，得到白鹤芋(白掌)新品种。
【权利要求】
1.一种分子标记的白鹤芋(白掌)定向选育方法，其特征在于:在白鹤芋(白掌)杂交育种的过程中引入了分子标记，且此分子标记所标记的为与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇，特别是与色泽表型密切相关的基因或基因簇；此等所被标记的基因或基因簇包括但不限于花青素合成途径的关键酶基因，如苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因；此等所被标记的基因或基因簇包括但不限于花青素合成途径中的3个转录因子基因，如R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因及WD40蛋白基因。
2.根据权利I所述的选育方法，其特征在于分子标记的白鹤芋(白掌)定向选育方法包括如下程序: (1)分子标记的选择及检测:所选择的分子标记为与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的保守区域，或是包含有与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的活性关键位点的区域，并依据上述区域分别设计一对PCR引物，用PCR方法进行检测； (2)亲本选择:选择能检测到目标分子标记的白鹤芋(白掌)作为亲本； (3)杂交:将选择的亲本通过人工授粉方式进行杂交,收集杂交所得到的种子播种萌发后得杂交后子代； (4)杂交子代分子标记检测与子代优选:抽提杂交子代不同生长发育阶段其叶片组织中的总DNA及总RNA，以此为模板，用所设计的PCR引物，分别进行PCR检测及逆转录PCR检测，考察子代中所标记的基因或基因簇的量与不同生长发育阶段的转录量的稳定性，以此为依据，优选出杂交子代； (5)优选子代组织培养扩繁:将优选出的杂交子代通过组织培养的方式进行无性扩繁，得到优选子代的组培苗； (6)优选子代组培苗培育与淘选:将优选子代组培苗进行壮苗培育，培育过程中分阶段检测所标记的基因或基因簇的量与转录量，考察其稳定性，淘汰稳定性量较差的子代，得到适合用于通过组织培养方式进行无性扩繁育苗的杂交子代； (7)选育子代的新品种性状验证:对(6)中所得到的优选杂交子代及其无性扩繁得到的组培苗进行新品种性状验证试验，选取能通过新品种验证试验的选育子代，得到白鹤芋(白掌)新品种。
3.根据权利I与权利2所述的选育方法，其特征在于:所用分子标记为与白鹤芋(白掌)优良性状相关的基因或基因簇的任意组合(如单个基因、两两组合、三三组合等)；所用分子标记分别为所选定标记基因组合中各个基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据所选定标记基因组合中各个基因的保守区域设计。
4.根据权利I与权利2所述的选育方法，其特征在于:所用分子标记为花青素合成途径中的4个关键酶基因(苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因)与花青素合成途径中的3个转录因子基因(R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因、WD40蛋白基因)共7个基因中的任意组合(如单个基因、两两组合、三三组合等)；所用分子标记分别为所选定标记基因组合中各个基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据所选定标记基因组合中各个基因的保守区域设计。
5.根据权利I与权利2所述的选育方法，其特征在于:所标记为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因及二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因等2个基因组合；所用分子标记分别为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因的保守区域设计。
6.根据权利I与权利2所述的选育方法，其特征在于:所标记为二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因等3个基因组合；所用分子标记分别为二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因及类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域设计。
7.根据权利I与权利2所述的选育方法，其特征在于:所用分子标记为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因等4个基因组合；所用分子标记分别为苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因、二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因、花青素合成酶(ANS)基因、类黄酮3-葡糖基转移酶(3GT)基因的保守区域设计。
8.根据权利I与权利2所述的选育方法，其特征在于:所用分子标记为R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因等3个基因组合；所用分子标记分别为R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的保守区域；所用的分子标记检测PCR引物分别依据R2R3-MYB蛋白基因、myc家族的bHLH蛋白基因与WD40蛋白基因的保守区域设计。
【文档编号】C12Q1/68GK103923970SQ201310011032
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月10日 优先权日:2013年1月10日
【发明者】蒋雄辉, 詹启成, 周英彪, 王奎 申请人:佛山市三水阳特园艺有限公司