专利名称：一种白鹤芋体细胞胚诱导并再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及植物诱导再生技术领域，具体地说，涉及一种白鹤芋体细胞胚诱导并再生植株的方法。
背景技术：
白鹤芋QSpathiphylIum Schott)为又称白掌或一帆风顺，原产中南美洲，是重要的热带观赏植物，在欧美市场备受欢迎。上世纪80年代引入我国大陆，迅速发展形成产业， 成为我国最重要的热带观赏植物之一。白鹤芋植物组织培养自20世纪70年代以来相继有所报道，主要利用顶芽和茎段等外植体诱导获得丛生芽，以丛生芽增殖的方式扩大繁殖数量，再以生根培养获得完整植株，其目的是实现离体快速繁殖，扩大稀有品种资源的个体数量，满足育种和生产的需要。曹静等(1995)和朱根发(2004)以幼嫩佛焰苞花序为外植体，经培养获得体细胞胚并再生植株。Werbrouck等(2000)、Eeckhaut T等(2001)和秦静远(2005)等报道了用幼嫩佛焰苞花序进行培养时，从雄蕊花丝部位诱导产生了体细胞胚。这些诱导体细胞胚的培养材料均为花器官，属生殖器官组织。从报道看诱导体细胞胚的效率比较低，一般每个外植体上只能产生单个或十几个体细胞胚；外植体的采集也需在开花季节，受到植物生长发育时限限制较大。目前，在白鹤芋上还未见从营养器官如叶片或叶柄等外植体成功诱导体细胞胚并再生植株的报道。
发明内容
本发明的目的是对白鹤芋体细胞胚诱导植株再生技术从材料和方法上进行创新， 提供一种以营养器官一幼嫩试管苗叶片或叶柄作为外植体，高效率的诱导体细胞胚并再生植株的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种白鹤芋体细胞胚诱导并再生植株的方法，利用外植体材料诱导，所采用的外植体材料为白鹤芋幼嫩试管苗叶片或叶柄。具体包括如下步骤
(1)后柱体细胞胚诱导。取白鹤芋属植物5⑵/Wi/Wi 的茎段或顶芽，经消毒处理， 接种至丛生芽诱导培养基中，获得无菌的试管苗，然后转移至试管苗增殖培养基中，在温度 2Γ30 °C、光照强度为1000 1400 lux，每日10 14小时光照的环境中，每3-4周继代一次， 试管苗不断增殖。将幼嫩试管苗叶片切成广10毫米宽的条块，或将叶柄切成广10毫米的截段，然后接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度M 30 °C的黑暗环境中培养3飞周，获得体细胞胚。
(2)体细胞胚的增殖。将获得的体细胞胚继代培养于体细胞胚增殖培养基中，在温度2Γ30 °C的黑暗环境中培养2、周后，体细胞胚大量增殖。(3)植株再生。将获得的体细胞胚接种至植株再生培养基中，在温度M 30 °C、光照强度为100(T1400 lux，每日1(Γ14小时光照培养2、周，体细胞胚萌发，获得完整再生植株。在上述方法中，步骤(1)所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，每 1升培养基中添加了 3. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为5. 6^6. 0 ；步骤(1)所述试管苗增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，每1升培养基中添加了 2. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、 20^40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为5. 6^6. 0 ；步骤(1)所述体细胞胚诱导培养基是以 MS培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有1. (Γ3. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤或0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5 2. 0毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、20 40克的蔗糖和6、克的琼脂，PH值为5. 6^6. 0 ；步骤(2)所述体细胞胚增殖培养基是以MS培养基为基本培养基， 同时每1升培养基中还含有1. (Γ3. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤或0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5 1. 0毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6 9克的琼脂，ρΗ值为5. 6 6. 0 ； 步骤(3)所述植株再生培养基是以MS培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有 0. 5^1. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2毫克的α -奈乙酸或0. Γθ. 2毫克的吲哚丁酸，2(Γ40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为5.6飞.O ；所述MS培养基由浓度为1900 mg · Γ1 的 KNO3,浓度为 1650 mg · Γ1 的 NH4NO3,浓度为 170 mg · Γ1 的 KH2PO4,浓度为 370 mg
Γ1 的 MgSO4 · 7H20，浓度为 440 mg · Γ1 的 CaCl2 · 2H20，浓度为 0. 83 mg · Γ1 的 KI，浓度为 6. 2 mg · L-1 的 H3BO3,浓度为 22. 3 mg · L-1 的 MnSO4 · 4H20，浓度为 8.6 mg · L-1 的 ZnSO ·7Η20，浓度为 0. 25 mg · L—1 的 Na2MoO4 · 2H20，浓度为 0. 025 mg · L—1 的 CuSO4 ·5Η20， 浓度为 0.025 mg · Γ1 的 CoCl2 ·6Η20，浓度为 37. 25 mg · Γ1 的 Na2EDTA,浓度为 27. 85 mg
L-1的FeSO4 · 7H20，浓度为100 mg · L-1的肌醇，浓度为2. O mg · L-1的甘氨酸，浓度为 0.4 mg · L—1的维生素B1,浓度为0.5 mg · L—1的维生素B6,浓度为0. 5 mg · L—1的烟酸组成。与现有技术相比，本发明具有明显进步
(1)体细胞胚诱导效率明显提高。由于白鹤芋的花器官与叶片或叶柄在器官组织结构和内源激素水平上的不同，导致了体细胞胚诱导效率明显差异。虽然现有技术报道的以幼嫩的花器官为外植体体细胞胚诱导率可达96. 59TlOO%，但在每块外植体表面至多形成十几个体细胞胚。本发明以叶片或叶柄为外植体，不仅体细胞胚诱导率可达979Γ100%，而且每块外植体表面能够形成多达5(Γ200个体细胞胚，诱导效率明显提高。(2)外植体材料容易获得。本发明所用的试管苗由茎段或顶芽诱导获得后，可以通过组织培养大量扩繁，取材十分方便。
实施例实施例1 本实施例通过以下步骤进行的
(1)体细胞胚诱导。取白鹤芋属植物5⑵/Wi/Wi 的茎段或顶芽，经消毒处理，接种至丛生芽诱导培养基中，获得无菌的试管苗，然后转移至试管苗增殖培养基中，在温度 2Γ30 °C、光照强度为1000 1400 lux，每日10 14小时光照的环境中，每3-4周继代一次，试管苗不断增殖。将幼嫩试管苗叶片切成广10毫米宽的条块，接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度M 30 °C的黑暗环境中培养2、周，获得体细胞胚；
(2)体细胞胚的增殖将获得的体细胞胚继代培养于体细胞胚诱导培养基中，在温度 2Γ30 °C的黑暗环境中培养2、周后，体细胞胚大量增殖；
(3)植株再生将获得的体细胞胚接种至植株再生培养基中，在温度M 30°C、光照强度为100(T1400 lux，每日1(Γ14小时光照的环境中培养2、周，体细胞胚萌发，获得完整再生植株。上述步骤(1)中的丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，每1升培养基中添加了 3. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的琼脂，PH值为5. 6^6. 0 ；步骤(1)所述试管苗增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，每 1升培养基中添加了 2. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤，0. 2毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为5. 6^6. 0步骤(1)中的体细胞胚诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有1. (Γ3. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤、0. 5^2. 0毫克的 2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为5. 6飞.0 ；步骤(2)中的体细胞胚增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有1. (Γ3. 0毫克的 6-苄基氨基腺嘌呤、0. 5^1. 0毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6、克的琼脂， PH值为5. 6飞.0 ；步骤(3)中的植株再生培养基是以MS培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有0. 5 1. 0毫克的6-苄基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2毫克的α -奈乙酸，20^40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为5. 6^6. O。按上述条件培养，有979Γ100%的外植体能够诱导形成体细胞胚，每块外植体表面上可以形成5(Γ200个体细胞胚。获得的体细胞胚中，有859Γ95%可以萌发形成完整小植株。实施例2 本实施例与实施例1不同的是步骤(1)中将试管苗叶柄切成广10毫米截段，然后接种于体细胞胚诱导培养基中培养获得体细胞胚；其余与实施例1相同。实施例3 本实施例与实施例1或2不同的是步骤(1)中体细胞胚诱导培养基以 MS培养基为基本培养基，且每1升培养基中含有0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5^2. O毫克的 2，4-二氯苯氧乙酸、20 40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为5. 6飞.O ；步骤(2)中体细胞胚增殖培养基以MS培养基为基本培养基，且每1升培养基中含有0. 05、. 25毫克的噻苯隆、 0. 5 1. O毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6 9克的琼脂，ρΗ值为5. 6 6. O ；其余与实施例1或2相同。实施例4 本实施例与实施例1、2或3不同的是步骤(3)中植株再生培养基以MS 培养基为基本培养基，且每1升培养基中含有0. 5^1. O毫克的6-苄基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2 毫克的α -奈乙酸、2(Γ40克的蔗糖和6 9克的琼脂，ρΗ值为5. 6 6. O ；其余与实施例1、2 或3相同。
权利要求
1.一种白鹤芋体细胞胚诱导并再生植株的方法，利用外植体材料诱导，其特征在于，所采用的外植体材料为白鹤芋叶片或叶柄或其混合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤(1)体细胞胚诱导取白鹤芋幼嫩试管苗，将叶片切成广10毫米的条块，或将叶柄切成 Γιο毫米的截段，然后接种于体细胞胚诱导培养基中，在温度M 30 °C的黑暗环境中培养 3飞周，获得体细胞胚；(2)体细胞胚的增殖将获得的体细胞胚继代培养于体细胞胚增殖培养基中，在温度 2Γ30 °C的黑暗环境中培养2、周后，体细胞胚大量增殖；(3)植株再生将获得的体细胞胚接种至植株再生培养基中，在温度M 30°C、光照强度为100(T1400 lux，每日1(Γ14小时光照环境中培养2、周，体细胞胚萌发，获得完整再生植株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述体细胞胚诱导培养基为以MS 培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有ι. (Γ3. O毫克的6-苄基氨基腺嘌呤或 0. 05、. 25毫克的噻苯隆、0. 5 2. O毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、20 40克蔗糖和6、克琼脂， PH 值为 5. 6^6. O。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述体细胞胚增殖培养基是以MS 培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有1. (Γ3. O毫克的6-苄基氨基腺嘌呤或 0. 05 0. 25毫克的噻苯隆、0. 5 1. O毫克的2，4- 二氯苯氧乙酸、20 40克的蔗糖和6 9克的琼脂，PH值为5. 6 6. O。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述植株再生培养基为以MS培养基为基本培养基，同时每1升培养基中还含有0. 5^1. O毫克的6-苄基氨基腺嘌呤、0. Γ0. 2 毫克的α -奈乙酸或0. Γ0. 2毫克的吲哚丁酸，2(Γ40克的蔗糖和6、克的琼脂，ρΗ值为 5. 6 6. O。
全文摘要
一种白鹤芋体细胞胚诱导并再生植株的方法，它涉及一种体细胞胚诱导植株再生的方法。方法1.取白鹤芋幼嫩试管苗，将叶片或叶柄，切成小片段进行诱导，获得体细胞胚；2.将体细胞胚继代培养于体细胞胚增殖培养基中大量增殖；3.将体细胞胚转移至植株再生培养基上培养获得完整小植株。本发明的体细胞胚诱导率达97%~100%，初次培养外植体表面即可形成多达50~200个体细胞胚，诱导效率显著提高；所获体细胞胚的植株再生率达85%~95%。本发明解决了现有白鹤芋体细胞胚诱导效率低、外植体材料采集不便的问题。
文档编号A01H4/00GK102388805SQ20111026708
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者于波, 刘晓荣, 刘金梅, 廖飞雄 申请人:广东省农业科学院花卉研究所