专利名称：一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基。
背景技术：
棉花是重要的经济作物，其细胞和组织培养研究已取得了很大的进展，并初步建立和完善了棉花组织培养的技术体系。棉花组织培养、离体再生作为棉花细胞工程和基因工程的基础技术，在棉花遗传改良中有着极为重要的作用。然而，棉花是较难通过体细胞胚胎发生途径获得再生植株的作物，表现为在组织培养中基因型依赖性强且周期长，重复性差。另外，在棉花体细胞胚胎发生过程中，体胚发生效率低且畸形胚胎频率高。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基。本发明所提供的培养基为用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，分为只由活性成分组成的便于存放的贮存型培养基和由所述贮存型培养基和水配成的即用型培养基。所述用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，其中的贮存型培养基，由独立包装的培养基A、培养基B和培养基C组成；所述培养基A为由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和凝固剂组成的培养基；所述培养基B为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和氨基酸添加物组成的
培养基；所述培养基C为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖、氨基酸添加物和凝固剂组成的培养基；所述改良MS基本培养基由下述质量份的营养成分组成NH4NO3 825 份、KNO3 3800 份、Iffl2PO4 170 份、CaCl2 · 2H20 440 份和 MgSO4 · 7H20370 份；KI 0. 83 份、Na2MoO4 · 2H20 0. 25 份、H3BO3 6. 2 份、CuSO4 · 5H20 0. 025 份、MnSO4 · 4H20 22. 3 份、CoCl2 · 6H20 0. 025 份和 ZnSO4 · 4H20 8. 6 份；Na2EDTA 37. 3 份和 FeSO4 · 7H20 27. 8 份；烟酸0. 5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0. 1份、盐酸吡哆素0. 5份和甘氨酸2. 0份；所述激素为吲哚丁酸和激动素，所述吲哚丁酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0. 3份-1. 0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3,具体可为0. 3份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3或0. 6份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3或1. 0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3 ；所述激动素和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0. 05份-0. 3份所述激动素/825份NH4NO3,具体可为0. 05份所述激动素/825份NH4NO3或0. 15份所述激动素/825份NH4NO3或0. 3份所述激动素/825 份NH4NO3 ；所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基A、培养基B和培养基C中的质量份之比均为(7. 00-3. 00) 1，具体可为6 1或4 1或3. 33 1;所述葡萄糖和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足25000份-35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3,具体可为25000份所述葡萄糖/825 份NH4NO3或30000份所述葡萄糖/825份NH4NO3或35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3 ；所述氨基酸添加物为谷氨酰胺和天冬氨酸，所述谷氨酰胺和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3, 具体可为300份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3或500份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3或700 份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3 ；所述天冬氨酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700份所述天冬氨酸/825份NH4NO3,具体可为300份所述天冬氨酸/825份NH4NO3或500份所述天冬氨酸/825份NH4NO3或700份所述天冬氨酸/825 份 NH4NO3 ；所述凝固剂具体可为植物凝胶或琼脂。所述用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，其中的即用型培养基，由独立包装的培养基Al、培养基Bl和培养基Cl组成；所述培养基Al为向液体培养基D中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基D由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η200· 44g/L,MgSO4 ·7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、 MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/ L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L_l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、 激动素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述培养基Bl为液体培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下=NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、 MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/ L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L_l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、 激动素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L、谷氨酰胺 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；所述培养基Cl为向液体培养基E中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基E由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下=NH4NO3 0. 825g/L、 KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KIO. 83mg/L、 Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、 烟酸0. 5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L-l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、激动素 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L、谷氨酰胺 0. 3g/L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；
所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基D、所述培养基Bi、所述培养基E、所述培养基Al和所述培养基Cl中的质量比为(7.00-3.00) 1，具体可为6 1或4 1或 3·33 · Io所述培养基D、所述培养基Bi、所述培养基E、所述培养基Al和所述培养基Cl的 pH 值均为 5. 6-6. 2 或 5. 6 或 5. 8 或 6. 2 ；所述凝固剂为植物凝胶，所述植物凝胶在所述培养基Al和所述培养基Cl中的浓度均为 2. 4g/L-3. Og/L 或 2. 4g/L 或 2. 6g/L 或 3. Og/L。利用所述的成套培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株1)将棉花愈伤组织在所述培养基Al中培养，获得胚性愈伤组织；2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基Bl中，获得原胚；3)将所述步骤幻中获得的所述原胚在所述培养基Cl中培养，获得棉花再生植株。所述步骤2~)包括如下步骤将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织在所述培养基Bl中进行第一次悬浮培养，使所述胚性愈伤组织增殖，再转接入所述培养基Bl中进行第二次悬浮培养，得到所述原胚。所述步骤2、中，所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的温度、振荡频率和培养时间如下23-30°C、70-130转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养10-14天，具体可为10天或12天或14天。所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的光照条件为每天M小时中光照 14-18小时，光照强度为16001UX，其余时间黑暗。所述转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于50目，如60目或70目的愈伤组织接入所述培养基Bi。所述步骤1)的培养在如下条件进行23-30°C、光照条件为每天对小时中光照 14-18小时，光照强度为16001UX，其余时间黑暗；所述步骤3)的培养在如下条件进行23-30°C、光照条件为每天M小时中光照 14-18小时，光照强度为16001UX，其余时间黑暗。所述棉花愈伤组织是通过如下诱导培养基培养棉花子叶苗的下胚轴得到的向液体培养基F中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基F由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下=NH4NO3 1. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 CuSO4 ·5Η20 0. 025mg/L、MnS04 ·4Η20 22. 3mg/L、CoCl2 ·6Η200· 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/ L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4_D 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、吲哚乙酸 0. 05mg/L_0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、 激动素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述诱导培养基中的所述2，4_D、所述吲哚乙酸和所述激动素的质量之比为 1:1:1;
所述诱导培养基的pH值为5. 6-6. 2或5. 6或5. 8或6. 2。本发明所提供的方法及其培养基尤其适用于陆地棉品种。本发明所提供的棉花体细胞再生方法及其培养基不受棉花基因型的限制；培养周期短，70天即可获得再生棉花苗；胚性愈伤诱导率高，可达72. 14% ；体细胞胚胎发生率高， 可达47. 71%;成苗率高，可达18.本发明所提供的棉花体细胞再生方法及其培养基使棉花具高效获得大量体细胞胚胎与植株再生的能力，从而为棉花的细胞工程、基因工程以及棉花遗传改良等相关研究提供重要平台。
图1为珂字棉201固-液交替培养诱导体胚发生与植株再生过程。其中，A为愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；B为胚性愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；C为胚性愈伤组织悬浮细胞系预增殖的愈伤形态；D为胚性愈伤组织悬浮细胞增殖和体细胞胚胎发生阶段愈伤及体胚形态，其中，a为增殖中胚性愈伤组织悬浮细胞形态，b为体胚发生过程中原胚的形态； E为体细胞胚胎发育阶段体胚形态；F为从体细胞胚胎中获得的再生植株。图2为冀无2031固-液交替培养诱导体胚发生与植株再生过程。其中，A为愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；B为胚性愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；C为胚性愈伤组织悬浮细胞系预增殖的愈伤形态；D为胚性愈伤组织悬浮细胞增殖和体细胞胚胎发生阶段愈伤及体胚形态，其中，a为增殖中胚性愈伤组织悬浮细胞形态，b为体胚发生过程中原胚的形态； E为体细胞胚胎发育阶段形态；F为从体细胞胚胎中获得的再生植株。图3为农大58固-液交替培养诱导体胚发生与植株再生过程。其中，A为愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；B为胚性愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；C为胚性愈伤组织悬浮细胞系预增殖的愈伤形态；D为胚性愈伤组织悬浮细胞增殖和体细胞胚胎发生阶段愈伤及体胚形态，其中，a为增殖中胚性愈伤组织悬浮细胞形态，b为体胚发生过程中原胚的形态；E 为体细胞胚胎发育阶段形态；F为从体细胞胚胎中获得的再生植株。
具体实施例方式下面以三个基因型的棉花品种为例，阐明本发明的技术方案。在本发明的第一个实施例中，棉花珂字棉201使用的成套培养基为培养基Al、 培养基 Bl 和培养基 Cl。其中，培养基 Al =NH4NO3 0. 825g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L、 H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、 ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 IOOmg/ L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. :3mg/L、激动素 0. 05mg/L、葡萄糖 25g/L，植物凝胶 2. 4g/L 和水，ρΗ5· 6 ；培养基Bl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. :3mg/L、激动素0. 05mg/L、葡萄糖25g/L、谷氨酰胺0. 3g/L、天冬氨酸0. 3g/L和水，ρΗ5· 6 ；培养基Cl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. :3mg/L、激动素0. 05mg/L、葡萄糖25g/L、谷氨酰胺0. 3g/L、天冬氨酸0. 3g/L、植物凝胶2. 4g/L和水，pH5. 6 ；诱导培养基=NH4NO31. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/ L、MgS04.7H20 0.37g/L、KI 0. 83mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuS04 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4-D0. 05mg/L、吲哚乙酸 0. 05mg/L、激动素 0. 05mg/L、葡萄糖为25g/L、植物凝胶2. 4g/L和水，pH值为5. 6。利用上述成套培养基和诱导培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株1)将在诱导培养基中形成的棉花愈伤组织在所述培养基Al中培养，获得胚性愈伤组织；2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基Bl中，获得原胚；3)将所述步骤幻中获得的所述原胚在所述培养基Cl中培养，获得棉花再生植株。其中，在第一次悬浮培养和第二次悬浮培养的温度、振荡频率、培养时间、光照条件如下23°C、70转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养10天、每天M小时中光照14小时，光照强度为16001UX，其余时间黑暗。转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于60目的愈伤组织接入所述培养基Bi。所述步骤1)和所述步骤幻的培养在如下条件进行23°C、每天M小时中光照14 小时，光照强度为16001UX，其余时间黑暗。在本发明的第二个实施例中，棉花品种是冀无2031使用的成套培养基为培养基 Al、培养基 Bl 和培养基 Cl。其中，培养基 Al =NH4NO3 0. 825g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4O. 17g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 25mg/L、 H3BO 36. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、 ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H2027. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 IOOmg/ L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸0. 6mg/L、激动素 0. 15mg/L、葡萄糖 30g/L，植物凝胶 2. 6g/L 和水，ρΗ5· 8 ；培养基Bl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸0. 6mg/L、激动素0. 15mg/L、葡萄糖30g/L、谷氨酰胺0. 5g/L、天冬氨酸0. 5g/L和水，ρΗ5· 8 ；
培养基Cl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. 6mg/L、激动素0. 15mg/L、葡萄糖30g/L、谷氨酰胺0. 5g/L、天冬氨酸0. 5g/L、植物凝胶2. 6g/L和水，pH5. 8 ；诱导培养基=NH4NO31. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/ L、MgS04.7H20 0.37g/L、KI 0. 83mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuS04 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4-D0. 15mg/L、吲哚乙酸 0. 15mg/L、激动素 0. 15mg/L、葡萄糖为30g/L、植物凝胶2. 6g/L和水，pH值为5. 8。利用上述成套培养基和诱导培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株1)将在诱导培养基中形成的棉花愈伤组织在所述培养基Al中培养，获得胚性愈伤组织；2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基Bl中，获得原胚；3)将所述步骤幻中获得的所述原胚在所述培养基Cl中培养，获得棉花再生植株。其中，第一次悬浮培养和第二次悬浮培养的温度、振荡频率、培养时间、光照条件如下J6°C、100转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养12天、每天M小时中光照16小时， 光照强度为16001UX，其余时间黑暗。转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于60目的愈伤组织接入所述培养基Bi。所述步骤1)和所述步骤幻的培养在如下条件进行J6°C、光照条件为每天M小时中光照16小时，光照强度为16001UX，其余时间黑暗。在本发明的第三个实施例中，棉花农大58使用的培养基为培养基Al、培养基Bl 和培养基 Cl。其中，培养基 Al :ΝΗ4Ν030 · 825g/L、KN03 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 CuSO4 ·5Η20 0. 025mg/L、MnS04 ·4Η20 22. 3mg/L、CoCl2 ·6Η200· 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/ L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸1. 0mg/L、激动素0. :3mg/L、葡萄糖 35g/L，植物凝胶 3. 0g/L 和水，ρΗ6· 2 ；培养基Bl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、 MgSO4 · 7Η20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、吲哚丁酸1. 0mg/L、激动素0. :3mg/L、葡萄糖35g/L、谷氨酰胺0. 7g/L、天冬氨酸0. 7g/L和水，ρΗ6· 2 ；培养基Cl =NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸1. Omg/L、激动素0. :3mg/L、葡萄糖35g/L、谷氨酰胺0. 7g/L、天冬氨酸0. 7g/L、植物凝胶3. Og/L和水，ρΗ6· 2 ；诱导培养基NH4NO31. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/ L、MgS04.7H20 0.37g/L、KI 0. 83mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuS04 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2，4-D0. 3mg/L、吲哚乙酸0. 3mg/L、激动素0. 3mg/L、葡萄糖为35g/L、植物凝胶3. Og/L和水，pH值为6. 2。利用上述成套培养基和诱导培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株1)将在诱导培养基中形成的棉花愈伤组织在所述培养基Al中培养，获得胚性愈伤组织；2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基Bl中，获得原胚；3)将所述步骤幻中获得的所述原胚在所述培养基Cl中培养，获得棉花再生植株。其中，第一次悬浮培养和第二次悬浮培养的温度、振荡频率、培养时间、光照条件如下30°C、130转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养14天、每天M小时中光照18小时， 光照强度为16001UX，其余时间黑暗。转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于60目的愈伤组织接入所述培养基Bi。所述步骤1)和所述步骤幻的培养在如下条件进行30°C、光照条件为每天M小时中光照18小时，光照强度为16001uX，其余时间黑暗。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、高效获得体细胞胚胎与再生植株(一)无菌子叶苗的获得1、棉花种子的脱绒取50g棉花品种珂字棉201种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2_;3min，然后石灰水中和，不断搓洗，流水冲洗10-iaiiin，获得干净的脱绒种子。2、棉花种子的萌发将脱绒种子经0. 1% (w/v)HgCl2溶液消毒10分钟，然后用灭菌水清洗种子5-6遍， 最后加入150ml灭菌水，28°C暗处萌发M小时，获得萌发种子。3、棉花种子的发芽将萌发种子在无菌环境下剥去种壳，并将去种壳的棉花种胚种植于发芽培养基上，28°C暗培养6天，获得无菌黄化子叶苗。发芽培养基为NH4NO30. 825g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、 CaCl2 · 2Η200· 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、蔗糖 20g/L，琼脂粉 7. 5g/L 和水，pH5. 8。
( 二)愈伤组织的诱导和增殖将珂字棉201无菌黄化子叶苗的下胚轴切成0. 5cm长度，接种于诱导培养基(培养皿直径9cm，每皿含诱导培养基25ml，每皿接种8_10个下胚轴)23°C每天光照14小时，光照强度为1600LUX，培养30天(图1-A)。按每10皿为一个重复统计，每个重复接种的下胚轴数目记为A，共设重复3个。诱导培养基的基础培养基是MS基本培养基(表1)。向MS基本培养基中添加2， 4-D、吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、葡萄糖和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该诱导培养基。在该诱导培养基中，2，4-D、IAA和KT的浓度均为0. 05mg/L，葡萄糖的浓度为25g/L，植物凝胶的浓度为2. 4g/L。灭菌前调pH值为5. 6，115°C高压灭菌20min。表1. MS基本培养基
权利要求
1.用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，由独立包装的培养基A、培养基B和培养基C组成；所述培养基A为由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和凝固剂组成的培养基；所述培养基B为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和氨基酸添加物组成的培养基；所述培养基C为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖、氨基酸添加物和凝固剂组成的培养基；所述改良MS基本培养基由下述质量份的营养成分组成NH4NO3 825 份、KNO3 3800 份、KH2PO4 170 份、CaCl2 · 2H20 440 份和 MgSO4 · 7H20370 份； KI 0. 83 份、Na2MoO4 · 2H20 0. 25 份、H3BO3 6. 2 份、CuSO4 · 5H20 0. 025 份、MnSO4 · 4H20 22. 3 份、CoCl2 · 6H20 0. 025 份和 ZnSO4 · 4H20 8. 6 份；Na2EDTA 37. 3 份和 FeSO4 · 7H20 27. 8 份； 烟酸0. 5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0. 1份、盐酸吡哆素0. 5份和甘氨酸2. 0份；所述激素为吲哚丁酸和激动素，所述吲哚丁酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0. 3份-1. 0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3 ；所述激动素和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0. 05 份-0. 3份所述激动素/825份NH4NO3 ；所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基A、培养基 B和培养基C中的质量份之比均为(7.00-3.00) 1 ；所述葡萄糖和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足25000份-35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3 ；所述氨基酸添加物为谷氨酰胺和天冬氨酸，所述谷氨酰胺和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3 ；所述天冬氨酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700 份所述天冬氨酸/825份NH4NO315
2.用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，由独立包装的培养基Al、培养基Bl和培养基Cl组成；所述培养基Al为向液体培养基D中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基D由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下=NH4NO3 0. 825g/L、 KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H200. 37g/L、KI 0. 83mg/L、 Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、 烟酸0. 5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L-l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、激动素 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述培养基Bl为液体培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下NH4N03 0 . 8 2 5g/L、KNO3 3. 8g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、 MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/ L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、吲哚丁酸 0. 3mg/L_l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、 激动素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或25g/L 或 30g/L 或 35g/L、谷氨酰胺 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；所述培养基Cl为向液体培养基E中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基 E由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下=NH4NO3 0. 825g/L、KN03 3. 8g/L、 KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KIO. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/L、Na2EDTA37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、 肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、吲哚丁酸0. 3mg/ L-l. Omg/L 或 0. 3mg/L 或 0. 6mg/L 或 1. Omg/L、激动素 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L、谷氨酰胺 0. 3g/ L-0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L 和天冬氨酸 0. 3g/L_0. 7g/L 或 0. 3g/L 或 0. 5g/L 或 0. 7g/L ；所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基D、所述培养基Bi、所述培养基E、所述培养基Al和所述培养基Cl中的质量比为(7.00-3.00) 1。
3.根据权利要求2所述的成套培养基，其特征在于所述培养基D、所述培养基Bi、所述培养基E、所述培养基Al和所述培养基Cl的pH值均为5. 6-6. 2或5. 6或5. 8或6. 2 ；所述凝固剂为植物凝胶，所述植物凝胶在所述培养基Al和所述培养基Cl中的浓度均为 2. 4g/L-3. 0g/L 或 2. 4g/L 或 2. 6g/L 或 3. 0g/L。
4.利用权利要求2或3所述的成套培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株1)将棉花愈伤组织在所述培养基Al中培养，获得胚性愈伤组织；2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基Bl中，获得原胚；3)将所述步骤幻中获得的所述原胚在所述培养基Cl中培养，获得棉花再生植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤2、包括如下步骤将所述步骤 1)中获得的所述胚性愈伤组织在所述培养基Bl中进行第一次悬浮培养，使所述胚性愈伤组织增殖，再转接入所述培养基Bl中进行第二次悬浮培养，得到所述原胚。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤幻中，所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的温度、振荡频率和培养时间如下23-30°C、70-130转/分钟、振荡培养10-14天。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的光照条件为每天M小时中光照14-18小时，其余时间黑暗。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于50目的愈伤组织接入所述培养基Bi。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)的培养在如下条件进行23-30°C、光照条件为每天M小时中光照14-18 小时，其余时间黑暗；所述步骤幻的培养在如下条件进行23-30°C、光照条件为每天M小时中光照14-18 小时，其余时间黑暗。
10.根据权利要求4-9中任一所述方法，其特征在于所述棉花愈伤组织是通过如下诱导培养基培养棉花子叶苗的下胚轴得到的向液体培养基F中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基F由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下=NH4NO3 1. 65g/L、KNO3 1. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MgSO4 · 7H20 0. 37g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 CuSO4 ·5Η20 0. 025mg/L、MnS04 ·4Η20 22. 3mg/L、CoCl2 ·6Η200· 025mg/L、ZnSO4 · 4H20 8. 6mg/ L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、2，4_D 0. 05mg/L_0· 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、吲哚乙酸 0. 05mg/L_0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. 3mg/L、 激动素 0. 05mg/L-0. 3mg/L 或 0. 05mg/L 或 0. 15mg/L 或 0. :3mg/L、葡萄糖为 25g/L_35g/L 或 25g/L 或 30g/L 或 35g/L ；所述诱导培养基中的所述2，4-D、所述吲哚乙酸和所述激动素的质量之比为 1:1:1;所述诱导培养基的PH值为5. 6-6. 2或5. 6或5. 8或6. 2。
全文摘要
本发明公开了一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基。本发明的培养基为用于棉花体细胞再生植株的成套培养基，由培养基A、培养基B和培养基C组成，所述培养基A由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和凝固剂组成；所述培养基B由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和氨基酸添加物组成；所述培养基C由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖、氨基酸添加物和凝固剂组成；本发明的方法是使用所述成套培养基，将棉花愈伤组织培养成再生植株的方法。本发明不受棉花基因型的限制，且培养周期短、重复性高，使棉花具高效获得大量体细胞胚胎与植株再生的能力，从而为棉花的细胞工程、基因工程以及棉花遗传改良等相关研究提供重要平台。
文档编号A01H4/00GK102405835SQ20111024320
公开日2012年4月11日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者刘正杰, 华金平, 张园, 王彦霞, 王玉美 申请人:中国农业大学