专利名称：转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化体特异性pcr检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。特别是涉及一种鉴别转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化 体特异性PCR方法。
背景技术：
棉花是全球的主要经济作物，又是重要的纺织工业原料，同时也是关系国计民生 的特殊商品。目前转基因抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，截止2010年6月，我 国共发放转基因棉花生产应用安全证书1473项，以转Bt基因抗虫棉为主，分别应用在河 南、河北、安徽、山西等棉花种植省区，覆盖了我国长江流域、黄河流域等棉花生产区域(中 国生物安全网，http://www. stee. agri. gov. cn/biosafety/spxx/)。有文献报道，目前在我国种植的转基因棉花品种中，以中国农业科学院生物技术 研究所为代表研发的国抗系列转基因抗虫棉(如GK12，SGK321等)占据主要市场(张锐， 王远，等.国产转基因抗虫棉研究回顾与展望.中国农业科技导报.2007，9 (4) :32 42)； 但也有研究结果表明，我国的转基因棉花以Monsanto公司的转基因抗虫棉(如新棉33B) 为主。我国不同转基因棉花的分子特征和转化体特异性检测方法的缺乏是产生这种争议的 主要原因。转化体特异性检测是指以转化体特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接 区域)为检测靶标区域，是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基 因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法能够区分同一转化载体产生的不同转化植 株品系。鄂杂棉1号是湖北省审定的第1个杂交棉品种(鄂审棉001-2000)，高产、稳产性 好，抗病、抗逆能力强，特别是纤维品质突出，是湖北省首推的杂交棉品种(刘辉等，鄂杂棉 1号高产栽培及高效制种技术研究，湖北农业科学，2001，5 :21-23)。目前在我国批准种植 的棉花品种中，仅Monsanto公司报道了 M0N531和谢家建等人报道了 GK12、南农6号等少数 品系的转化体特异性序列和转化体特异性检测方法，而转基因棉鄂杂棉1号的转化体特异 性序列和转化体特异性检测方法尚未见报道。
发明内容
针对上述领域中的空白，提供了转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化体特异性序列以 及鉴别鄂杂棉1号的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速 准确鉴别出转基因抗虫棉鄂杂棉1号，以及以鄂杂棉1号为亲本的棉花品系。转基因棉鄂杂棉1号的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的正 向引物依据SEQ ID No. 1中1-600位序列设计，反向引物依据SEQ ID No. 1的601-1897位 序列设计。所述正向引物为EZl-Fl :5 ‘-GGACGAACGGATAAACCCTTT-3，，所述反向引物为EZl-Rl 5 ‘-CGAAAGAAGAACCGATGGAC-3，，增产物大小为 382bp。
所述PCR检测方法在检测鄂杂棉1号及以鄂杂棉1号为亲本的棉花品种中的应用。本发明通过genome walking方法扩增得到鄂杂棉1号的转化体特异性片段如 SEQ ID No. 1所示，该片段长1897bp，其l_600bp为外源转化载体的序列，601-1897为受体 棉花基因组的序列，该序列是鄂杂棉1号这个转基因品种所唯一拥有的序列。这种唯一性 由外源转化载序列以及外源转化载体在宿主基因组的特定插入位置决定。在转基因过程 中，载有外源基因的载体可能插入到宿主基因组的很多个位置，外源载体插入位置的不同 将得到不同的转基因品系，即得到不同的转化体特异性，即一种转化体特异性与一次转基 因事件所获得的其中一种转基因品种一一对应。本发明基于获得的转化体特异性片段SEQ ID No. 1与鄂杂棉1号的一一对应性，利用转化体特异性片段SEQ ID No. 1作为检测的靶 标片段，并根据该片段设计引物，正向引物设计在1 600bp位置，反向引物设计在3’端 601-1897bp位置，采用这对正反向引物对待测品系的基因组进行PCR扩增，是一种检测待 测棉花品种是否是鄂杂棉1号或虽命名为其它但其遗传物质与鄂杂棉1号完全一致，或者 以鄂杂棉1号为亲本的转基因棉花品种的有效手段。在检测中由于设计的正反向引物的正 确靶标序列就是其设计所依据的转化体特异性序列，即SEQ ID NO. 1，即事先已经非常清楚 引物在靶标序列上的识别位置和靶标序列片段长度，因此能够预先计算出扩增产物应该为 多长，当某个待测品系的基因组扩增产物出现相应长度的扩增片段时，说明该品系就是鄂 杂棉1号或者以鄂杂棉1号为亲本的转基因棉花品种。本发明的核心贡献在于获得并向公众提供了鄂杂棉1号的转化体特异性序列，基 于转化体特异性序列与转基因品系的一一对应性，提供了其在检测鄂杂棉1号上的应用， 即根据其设计特异性引物来鉴别待测品系是否是鄂杂棉1号或其子代。而根据一段已知 序列采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是 普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采用哪一对特异性引物，不同的人根据SEQ ID NO. 1及本发明的检测方法中的设计思路可能会设计出不同的引物对，但都是基于本发 明提供了转化体特异性序列SEQ ID NO. 1所示的序列这个前提，因此都在本发明的保护范 围内。发明人同时也提供了一对自己设计的特异性引物EZ1-F1/EZ1-R1进行检测的方法， 但该引物仅仅是一种优选方案。由于转基因抗虫棉鄂杂棉1号是我国目前广泛种植的转基因抗虫棉品系之一，因 此本发明为特异性鉴定转基因抗虫棉鄂杂棉1号提供了便利，该方法的优点在于快速、灵 敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。
图1转基因抗虫棉鄂杂棉1号转化体特异性序列的Genome Walking扩增M :DNA Marker DL2000 ； 1-4 :DL1_DL4 的 Walking 产物图2转基因棉鄂杂棉1号转化体特异性PCR检测结果M =DNA Marker DL2000 ；N,阴性对照；B，空白对照；1 21，21个棉花样品；22 鄂 杂棉1号。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等的分子克隆实验室手册(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。实施例1转基因抗虫棉鄂杂棉1号转化体特异性序列的克隆1实验材料1.1植物材料转基因抗虫棉鄂杂棉1号(润富棉839)(生厂商湖北中香米业有限责任公司， 分装日期2009-10，审定编号鄂审棉001-2000).1. 2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker等购自大连宝生物工 程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公 司合成。1. 3实验仪器PCR 扩增仪Mastercycle gradient (Eppendorf co.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA 电泳分析系统Kodak EDAS 290 (Kodak co.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2. 1棉花基因组DNA提取与检测2. 1. 1棉花基因组DNA提取取棉花种子做为DNA提取的材料，依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有 限公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。2.1.4 DNA 检测取5iU提取的DNA溶液，以0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判 断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。2. 2 Genome walking分离转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化体特异性序列Genome walking也是一种扩增已知序列的旁侧未知区域序列的方法，主要步骤为 基因组DNA酶切、与接头连接、两次巢式PCR扩增等。本实施例采用Genome walking的方法获 得了转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化体特异性序列。具体步骤参照Genome Walker Universal Kit(Takara大连公司)试剂盒说明，本实施例进行了部分改进，主要操作步骤如下。2. 2. 1基因组DNA酶切分别用Dra I、EcoR V、Stu I和Pvu II酶切鄂杂棉1号基因组DNA，标记为DL1 DL4。酶切体系为基因组 DNA(0. lug/uL),25uL;10X 酶切 Buffer，10 y L ；内切酶(10U/ u L), 8 u L ；ddH20，57 u L ；总体积100 u L。37°C温浴2h，取出离心管，低速离心5 10s，继续温浴16 18h。各取L进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全。2. 2. 2纯化酶切产物按回收试剂盒说明书纯化酶切产物。2. 2. 3连接反应连接反应体系纯化的酶切产物，4 iiL ；接头(25iiM)，1.9iiL ;10X连接Buffer， 1. 6u L ； T4 DNA 连接酶(6U/ u L) ,0. 5u L ； ddH20,8 u L ；总体积 16 u L。混合反应液，16°C温浴过夜，然后70°C变性5min。每管加入72yL ddH20，混 勻，-20°C保存备用。2. 2. 4PCR 反应Genome Walking共需要两轮PCR反应，其PCR的反应体系见表1。表1反应体系(ii L)
权利要求
转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的正向引物依据SEQ ID NO1中1 600位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的601 1897位序列设计。
2.根据权利要求1所述的转化体特异性PCR检测方法，所述正向引物为 EZl-Fl 5 ‘-GGACGAACGGATAAACCCTTT-3，， 所述反向引物为 EZl-Rl 5 ‘-CGAAAGAAGAACCGATGGAC-3，， 扩增产物大小为382bp。
3.权利要求1或2所述的转化体特异性PCR检测方法在检测鄂杂棉1号及以鄂杂棉1 号为亲本的棉花品种中的应用。
全文摘要
本发明“转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化体特异性PCR检测方法及其应用”，属于生物技术领域。转基因抗虫棉鄂杂棉1号的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的正向引物依据SEQ ID NO1中1-600位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的601-1897位序列设计。本发明提供的优选引物为EZ1-F15‘-GGACGAACGGATAAACCCTTT-3’，反向引物为EZ1-R15‘-CGAAAGAAGAACCGATGGAC-3’扩增区域位于SEQ ID NO1的579-960位，扩增产物大小为382bp。该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转基因抗虫棉鄂杂棉1号，以及以鄂杂棉1号为亲本的棉花品系。
文档编号C12Q1/68GK101935705SQ201010267818
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者孙爻, 彭于发, 汪巧, 苏长青, 谢家建 申请人:中国农业科学院植物保护研究所