专利名称：应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法。
背景技术：
植物遗传转化是一种重要和先进的育种技术。目前，植物遗传转化的技术已经基本成熟，而最为通常的转化方法是应用农杆菌介导法将外源基因导入到受体植物的细胞并整合到染色体基因组中以实现外源基因稳定的遗传。在采用农杆菌转化大豆下胚轴外植体的过程中，以往都是把外植体整个浸泡在农杆菌菌液中，使整个外植体都沾上菌液。为了抑制外植体表面的农杆菌在培养基上的过旺增殖以防止植物材料的腐烂，通常是在培养基中添加抗生素。但是，抗生素在抑制农杆菌增 殖的同时也对外植体不定芽再生产生不利影响。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有农杆菌转化大豆下胚轴外植体的技术不足，提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，该装置可以有效保证部分外植体粘上菌液并避免整个外植体都沾上菌液。本发明的另一个目的是提供一种新的应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法，本发明一方面基于本发明上述装置，只对有再生不定芽潜能的下胚轴外植体的形态学上端切口附近进行局部的农杆菌侵染处理。因为经过局部侵染处理后农杆菌仅存在于外植体上端切口附近，在不定芽再生的培养过程中外植体上端切口附近不需要接触培养基，因此不需要在培养基中添加旨在抑制农杆菌的抗生素。避免了抗生素在抑制农杆菌增殖的同时也对外植体不定芽再生产生的不利影响，另一方面，本发明方法对侵染的关键步骤和工艺进行了优化，适宜的装置以及步骤和工艺的优化最终保证了本发明良好的转化效率。本发明通过以下技术方案实现上述发明目的
本发明首先提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，包括培养皿及培养皿盖，在培养皿中固定有一基板，基板上设置有贯通柱孔，所述贯通柱孔至少下端伸出基板并保证其下端底部与培养皿底距离为I mm 2 mm;所述贯通柱孔的孔内径大小与外植体茎径大小相适配。所述装置可置于高压蒸汽灭菌锅中进行常规灭菌。所述贯通柱孔可以为若干个。作为优选，本发明所述装置包括培养皿及培养皿盖，在培养皿中固定有一块通常用于核苷酸片段扩增的PCR板，切掉PCR板底部的小管形成贯通柱孔(整齐地切掉PCR板底部的小管)，保留四个角上的小管作支架，支架将PCR板支撑在培养皿中。根据实验室常用的培养皿大小和PCR板大小，本发明采用4cmX 6cm的PCR板。
基于上述装置，本发明同时提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法，具体包括以下步骤
(I)制备用于局部侵染处理下胚轴外植体的农杆菌菌液；
作为优选，用已灭菌的接种环从保存有农杆菌菌种的小管中蘸取少许菌液，在固体培养基上划线接种之后，把培养皿放置于28°c生化恒温培养箱培养3天，待培养基上长出单菌落后，再用接种针挑取单菌落接种至盛有20mL液体农杆菌培养基的大离心管(已灭菌)中，恒温摇床(28°C，200rpm)上培养24小时后，12000rpm离心lOmin，保留沉淀倒掉上清液，再向大离心管中加入20mL液体共培养基，悬浮沉淀，恒温摇床(28°C，200rpm)中培养I小时，调整菌液的OD值为O. 5 1.0。所述农杆菌培养基5 g/L牛肉浸膏+lg/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L鹿糖+0. 4g/100 mL MgSO4 · 7H20，用 I mg/L NaOH 溶液调整 pH 至 7. 4。培养基在 121 °C, O. I MPa 的条件下灭菌15 min，待培养基冷至60 °C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌 的100 mg/mL氯霉素母液和50 mg/mL的卡那霉素母液,使两者终浓度分别为100 mg/L和50 mg/L;其中固体培养基中加入7 g/L琼脂。所述液体共培养基:MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8. 6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解络蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮,用I mg/LNaOH溶液调整pH至5. 5。培养基在121 °C, O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60°C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其终浓度为100 mg/L。(2)获取大豆下胚轴外植体供体材料和下胚轴外植体；
作为优选，选取大小均一的成熟大豆种子，经常规灭菌后，接种至无激素MSB5培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养5天，获得具有长度大于I cm的胚轴的大豆幼苗作为下胚轴外植体供体材料，对幼苗进行切割，获取长度为I cm左右的下胚轴切段为外植体，切口平齐。所述MSB5培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、
8.6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8 6. O。培养基在121 °C >O. I MPa的条件下灭菌15 min。(3) BA溶液处理下胚轴外植体；
作为优选，在超净工作台上，把切好的下胚轴外植体逐个插入本发明所述的装置的各个贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下(接触培养皿底)，然后向该装置组成部分的培养皿中倒入30 mg/L BA处理溶液至约I mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的BA溶液。所述BA处理溶液的配制准确称取一定量的分析纯BA药品，用I mg/L NaOH充分溶解，再用去离子水定容，配制成30 mg/L的BA处理溶液。采用I mg/L HCl调整pH值为5. 8 6. O ;在121°C、0. I MPa的条件下，对已配制好的高浓度的BA处理溶液进行15 min灭菌。(4)对下胚轴外植体进行农杆菌侵染前的预培养；
作为优选，把经过步骤(3) BA溶液短期处理后的外植体以竖插方式(外植体的形态学上端朝上)接种至无激素MSB5培养基(同步骤(3))上，在室温为25 °C、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时的条件下培养I 2天。更为优选地，预培养时间为I天。
所述预培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L 二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8-6. O。培养基在121 0C,O. I MPa的条件下灭菌15 min。(5)对下胚轴外植体进行局部农杆菌侵染；
作为优选，在超净工作台中，把经过步骤(4)预培养后的下胚轴外植体逐个插入本发明所述的装置的各个贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下(接触培养皿底)，然后向所述装置组成部分的培养皿中倒入步骤(I)所述的农杆菌菌液至约I _深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉农杆菌菌液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的农杆菌菌液。在此过程中要特别注意外植体的其他部位不要接触到农杆菌。(6)对侵染后的下胚轴外植体进行共培养；
作为优选，把经过步骤(5)农杆菌局部侵染后的下胚轴外植体以竖插方式(外植体的形态学上端朝上)接种至无抗生素的固体共培养基上，在室温为25 °C、黑暗条件下，共培养3 6天。接种操作和整个培养过程要注意外植体上端有农杆菌的部位不要与培养瓶壁以及培养基接触。更为优选地，共培养时间为3天。所述共培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L 二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解络蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮+8 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 5。培养基在121 °C, O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60 °C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其终浓度为100 mg/L。(7)对侵染后的下胚轴外植体进行恢复再生培养；作为优选，把经过步骤(6)共培养后的下胚轴外植体以竖插方式(外植体的形态学上端朝上)接种至无抗生素的恢复培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养20天。接种操作和整个培养过程要注意外植体上端有农杆菌的部位不要与培养瓶壁以及培养基接触。所述恢复培养基:MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、
8.6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8-6. O。培养基在121 °C, O. I MPa的条件下灭菌15 min。
(8)对侵染后的下胚轴外植体再生的不定芽进行筛选培养；
作为优选，把经过步骤(7)所述恢复培养后已经再生不定芽的下胚轴外植体以横放方式接种至筛选培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养30天。所述筛选培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、
8.6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌剂(200 mg/L羧苄青霉素和200 mg/L头孢霉素)+筛选剂(3 mg/L草胺磷)+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8 6. O。培养基在121 0C,O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60 V左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的抑菌剂母液和筛选剂母液至所定浓度。(9)抗性芽生根培养与抗性苗驯化移栽；
作为优选，经过步骤(8)筛选培养后将仍然鲜绿的抗性芽从外植体上切割分离I cm 2 cm，以竖插方式接种至生根培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养一段时间后，从培养瓶中取出生根的抗性苗，洗净抗性苗根上的培养基后，即可栽植到干净的细砂基质中，进行常规的保湿炼苗。几天之后，即可把抗性苗种植在一般的土壤中进行常规管理，最后可以获得完整的抗性植株。所述生根培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8. 6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L 肌醇)+0. 5 mg/L NAA +25 g/L 鹿糖+300 mg/L 蛋白胨 + 抑菌剂(200 mg/L 羧苄青霉素和200 mg/L头孢霉素)+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8 6. O。培养基在121 0C,O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60 °C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的抑菌剂母液(200 mg/L羧苄青霉素和200 mg/L头孢霉素)至所定浓度。本发明的有益效果是
本发明为了保证大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌效果和效率，主要从两个方面进行了优化，一方面创造性地设计了一种装置，可很好地应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染，设计巧妙，取材简单，但可以有效保证部分外植体粘上菌液并避免整个外植体都沾上菌液，采用最简单的方法解决了长期困扰本技术领域的技术难题，不仅避免使用抗生素从而保证了转化效率，而且因为不使用抗生素，也大大降低生产成本；本发明进一步巧妙地利用核苷酸片段扩增的PCR板制备所述装置，就地取材，容易实现推广应用；第二方面是对侵染步骤和条件进行了进一步地优化，尤其是在预培养和共培养方面进行了优化，进一步保证侵染效率。本发明转化方法中除了筛选培养基和生根培养基中添加抗生素之外，其他培养基中都不用添加抗生素，由此可降低大豆下胚轴外植体遗传转化受体系统的药剂成本，更重要的是由于不定芽再生培养基中没有抗生素，由此可以消除抗生素对不定芽再生的不利影 响，显著提高转化工作效率。
图I本发明农杆菌局部侵染处理下胚轴外植体的装置；
图2大豆下胚轴外植体的恢复培养；
图3大豆不定芽的筛选培养；
图4抗性芽生根培养；
图5移栽种植的抗性苗参考 图6转基因大豆的PCR鉴定(检测目的基因)；
其中，I :阳性对照(菌液质粒)；2 :阴性对照(野生型植物)；3 =Marker 3 ;4 6 :抗性植
株;
图I转基因大豆的PCR鉴定(检测筛选标记基因)；
其中，I :阳性对照(菌液质粒)；2 :阴性对照(野生型植株)；3 Marker 3 ;4 6 :抗性植株。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。附图中，显示的大豆品种“华春2号”等仅为说明本发明思路描述方便，并不因此限定本发明范围，本技术领域可以采用其他常用的大豆品种。实施例I
本实施例提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，见附图I所示，包括培养皿I及培养皿盖2，在培养皿中固定有一基板3，基板上设置有贯通柱孔4，所述贯通柱孔4至少下端伸出基板并保证其下端底部与培养皿底距离为Imm 2mm ;所述贯通柱孔的孔内径大小与外植体茎径大小相适配。所述装置可置于高压蒸汽灭菌锅中进行常规灭菌。所述贯通柱孔可以为若干个。作为优选，所述基板采用一块通常用于核苷酸片段扩增的PCR板3，整齐地切掉PCR板底部的小管形成贯通柱孔4，保留四个角上的小管作支架，支架将PCR板3支撑在培养皿中。根据实验室常用的培养皿大小和PCR板大小，本发明采用4cmX6cm的PCR板。基于上述装置，本实施例同时提供一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法，具体包括以下步骤
(I)制备用于局部侵染处理下胚轴外植体的农杆菌菌液；
用已灭菌的接种环从保存有EHA 105农杆菌菌种(由华南农业大学生命科学学院郭振飞研究员惠赠，本技术领域技术人员也可以采用其他已报道用于大豆侵染的农杆菌菌种)的小管中蘸取少许菌液，在固体培养基上划线接种之后，把培养皿放置于28°C生化恒温培养箱培养3天，待培养基上长出单菌落后，再用接种针挑取单菌落接种至盛有20mL液体农杆菌培养基的大离心管(已灭菌)中，恒温摇床(28°C，200rpm)上培养24小时后，12000rpm离心lOmin，保留沉淀倒掉上清液，再向大离心管中加入20mL液体共培养基，悬浮沉淀，恒温摇床(28°C，200rpm)中培养I小时，调整菌液的OD值为O. 5 I. O。
所述农杆菌培养基5 g/L牛肉浸膏+lg/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L鹿糖+0. 4g/100 mL MgSO4 · 7H20，用 I mg/L NaOH 溶液调整 pH 至 7. 4。培养基在 121 °C, O. I MPa 的条件下灭菌15 min，待培养基冷至60 °C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL氯霉素母液和50 mg/mL的卡那霉素母液,使两者终浓度分别为100 mg/L和50 mg/L;其中固体培养基中加入7 g/L琼脂。所述液体共培养基:MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8. 6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解络蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮,用I mg/LNaOH溶液调整pH至5. 5。培养基在121 °C, O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60°C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其终浓度为100 mg/L。(2)获取大豆下胚轴外植体供体材料和下胚轴外植体；
选取大小均一的成熟大豆种子，经常规灭菌后，接种至无激素MSB5培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养5天，获得具有长度大于I cm的胚轴的大豆幼苗作为下胚轴外植体供体材料，对幼苗进行切割，获取长度为Icm左右的下胚轴切段为外植体，切口平齐。所述MSB5培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8.6 mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8 6. O。培养基在121 °C >O. I MPa的条件下灭菌15 min。(3) BA溶液处理下胚轴外植体；在超净工作台上，把切好的下胚轴外植体逐个插入本发明所述的装置的各个贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下(接触培养皿底)，然后向该装置组成部分的培养皿中倒入30 mg/L BA处理溶液至Imm 2mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的BA溶液。所述BA处理溶液的配制准确称取一定量的分析纯BA药品，用I mg/L NaOH溶液充分溶解，再用去离子水定容，配制成30 mg/L的BA处理溶液。采用I mg/L HCl溶液调整pH值为5. 8 6. O ;在121°C、0. I MPa的条件下，对已配制好的高浓度的BA处理溶液进行15 min灭菌。(4)对下胚轴外植体进行农杆菌侵染前的预培养；
把经过步骤(3)BA溶液短期处理后的外植体以竖插方式(外植体的形态学上端朝上)接种至无激素MSB5培养基(同步骤(3))上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养I天。
所述预培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、I. 7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L 二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8-6. O。培养基在121 0C,O. I MPa的条件下灭菌15 min。(5)对下胚轴外植体进行局部农杆菌侵染；
在超净工作台中，把经过步骤(4)预培养后的下胚轴外植体逐个插入本发明所述的装置的各个贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下(接触培养皿底)，然后向该装置组成部分的培养皿中倒入步骤(I)所述的农杆菌菌液至I mm 2 mm深度，盖上培养皿盖，静置20min后倒掉农杆菌菌液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的农杆菌菌液。在此过程中要特别注意外植体的其他部位不要接触到农杆菌。(6)对侵染后的下胚轴外植体进行共培养；
把经过步骤(5)农杆菌局部侵染后的下胚轴外植体以竖插方式(外植体的形态学上端朝上)接种至无抗生素的固体共培养基上，在室温为25 °C、黑暗条件下，共培养3天。接种操作和整个培养过程要注意外植体上端有农杆菌的部位不要与培养瓶壁以及培养基接触。所述共培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、I. 7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L 二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解络蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮+8 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 5。培养基在121 °C, O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60 °C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其终浓度为100 mg/L。(7)对侵染后的下胚轴外植体进行恢复再生培养；把经过步骤(6)共培养后的下胚轴外植体以竖插方式(外植体的形态学上端朝上)接种至无抗生素的恢复培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养20天，见附图2所示。接种操作和整个培养过程要注意外植体上端有农杆菌的部位不要与培养瓶壁以及培养基接触。所述恢复培养基:MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、1.7 g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、
8.6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8-6. O。培养基在121 °C, O. I MPa的条件下灭菌15 min。(8)对侵染后的下胚轴外植体再生的不定芽进行筛选培养；
把经过步骤(7)所述恢复培养后已经再生不定芽的下胚轴外植体以横放方式接种至筛选培养基上，在室温为25 °C、光照强度为2000 lx、光照时间为每天12小时的条件下培养30天，见附图3所示。所述筛选培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L 二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、
8.6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌剂(200 mg/L羧苄青霉素和200 mg/L头孢霉素)+筛选剂(3 mg/L草胺磷)+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8 6. O。培养基在121 0C,O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60 V左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的抑菌剂母液和筛选剂母液至所定浓度。(9)抗性芽生根培养与抗性苗驯化移栽；
经过步骤(8)筛选培养后将仍然鲜绿的抗性芽从外植体上切割分离(长度为Icm 2cm),以竖插方式接种至生根培养基上，见附图4所示，在室温为25 °C、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时的条件下培养一段时间后，从培养瓶中取出生根的抗性苗，洗净抗性苗根上的培养基后，即可栽植到干净的细砂基质中，进行常规的保湿炼苗。几天之后，即可把抗性苗种植在一般的土壤中进行常规管理，最后可以获得完整的抗性植株，见附图5所示。附图5中仅以移栽种植的抗性苗的实际生长形态作为参考，其它背景图案不作为本说明书保护内容。所述生根培养基MS培养基配方的无机成分(16. 5 g/L硝酸铵、19 g/L硝酸钾、
1.7g/L磷酸二氢钾、3. 7 g/L七水硫酸镁、4. 4 g/L二水氯化钙、16. 9 mg/L—水硫酸锰、8. 6mg/L七水硫酸锌、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化钾、O. 25 mg/L二水硫酸钥二钠、O. 025 mg/L五水硫酸铜、O. 025 mg/L六水氯化钴、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸钠、27. 8 mg/L七水硫酸亚铁)+B5培养基配方的有机成分(10 mg/L盐酸硫胺素、I mg/L盐酸卩比卩多醇、I mg/L烟酸、100 mg/L 肌醇)+0. 5 mg/L NAA +25 g/L 鹿糖+300 mg/L 蛋白胨 + 抑菌剂(200 mg/L 羧苄青霉素和200 mg/L头孢霉素)+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 8 6. O。培养基在121 °C,O. I MPa的条件下灭菌15 min，待培养基冷却至60 °C左右时，加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的抑菌剂母液至所定浓度。实施例2预培养时间对下胚轴外植体筛选存活率的影响
本实施例，对苗龄为5天的大豆幼苗进行切割获取下胚轴外植体，对其进行短期BA溶液(同实施例I)处理后，再进行0、1、2天的预培养，采用OD值为O. 5 I. O的农杆菌菌液对外植体的形态学上端进行局部侵染20 min处理，经过3天的共培养后，把外植体以竖插方式接种至无抗生素恢复培养基上培养20天，最后把外植体以横放方式接种至筛选培养基上培养30天。实验结果如表I所示。表I预培养时间对外植体存活率的影响
时间/d I存活率/% ~ 20.83b ~ 45.83a 2~ 丨40· 28a
注数据采用SPSS Statistics 17. O统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P含O. 05)，数据后字母不同表示显著差异。表I的结果表明，预培养时间为I天时，外植体存活率达最大值，为45. 83 %，显著高于不经过预培养而直接进行筛选实验组的20. 83 % ;观察还发现，不经过预培养的外植体，在筛选过程中，被农杆菌侵染过的部分容易发黄且外植体不易存活。实施例3共培养时间对下胚轴外植体筛选存活率的影响
本实施例，对苗龄为5天的大豆幼苗进行切割获取下胚轴外植体，对其进行短期BA溶液处理后，再进行I天的预培养，采用OD值为O. 5 I. O的农杆菌菌液对外植体的形态学上端进行局部侵染20 min处理，经过再经过0、3、6天的共培养后，把外植体以竖插方式接种至无抗生素恢复培养基上培养20天，最后把外植体以横放方式接种至筛选培养基上培养30天。实验结果如表2所示。表2共培养时间对外植体存活率的影响
时间/d I存活率/%
~ 20. OOb355.83a
662. 50a
注数据采用SPSS Statistics 17. O统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P含O. 05)，数据后字母不同表示显著差异。表2的结果表明，经过共培养3天和6天后，外植体存活率分别为55.83 %和62. 50%，显著高于不经过共培养而直接进行恢复培养的20. 00 %。实施例4对局部侵染法所获得的抗性植株的分子检测
对苗龄为5天的大豆幼苗进行切割获取下胚轴外植体，对其进行短期BA溶液处理后，再进行I天的预培养，采用OD值为O. 5 I. O的农杆菌菌液对外植体的形态学上端进行局部侵染20 min处理，经过再经过0、3、6天的共培养后，把外植体以竖插方式接种至无抗生素恢复培养基上培养20天，最后把外植体以横放方式接种至筛选培养基上培养30天，筛选后所得的抗性芽经过生根培养后得到抗性苗，对其进行驯化移栽，最后可以获得完整植株。以大豆抗性植株的叶片为材料，采用SDS法抽提总DNA用于PCR检测。所述SDS法抽提总DNA :取新鲜的大豆叶片O. I g左右，加液氮研磨叶片至粉末状，将粉末倒入已经加有O. 8 mL SDS微量抽提液的2 mL离心管中；将离心管置于恒温加热板加热30 min，温度调为65°C，每隔几分钟，轻轻摇晃离心管I次；加热结束后，向离心管加入O. 8 mL氯仿异戊醇乙醇=76:4:20混合液后，离心管在旋转仪上慢速旋转10 min ;将离心管置于离心机中，在12000 rpm、4 °C条件下离心12 min ;离心后，取上清液500 yL置于新的2 mL离心管中，加入50 μ L 3 mol/L醋酸钠和500 μ L异戊醇，轻轻摇匀，静置3-5min ;在12000 rpm、20 °C条件下离心5 min,去上清，留沉淀；采用500 μ L 75 %乙醇清洗沉淀，在12000 rpm、20 °C条件下离心3 min,取上清留沉淀,清洗沉淀2次；超净工作台上吹干离心管中的残留的乙醇；待沉淀干燥后，加入20 UL TE保存DNA。所述PCR检测把加入了引物、模版DNA、TagDNA聚合酶、TagDNA聚合酶buffer(含有Mg2+)、2m dNTP、去离子水的PCR反应管放入PCR仪的反应槽中，设置PCR反应参数；
其中检测目的基因时设置的PCR反应参数为94 °C预变性5min ；94 V变性30s，55 °C退火30 s，72 °C延伸90s，35个循环；最后72 °C充分延伸lOmin，采用20μ L的反应体系(上游引物5’ -GCGCAGATCTAGATGTCTACTATCC-3’ ;下游引物:5，-GCAAGGTGACCGAGCTAGTCGGA-3，)；
检测筛选标记基因时设置的反应参数为94 °C预变性5 min ；94 °C变性30 S，56 V退火30 S，72 °C延伸30 S，30个循环；最后72 1充分延伸10 min，PCR采用20 μ L的反应体系(上游引物 5’ -CCGTACCGAGCCGCAGGAAC-3’，下游引物5’ -CAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC-3，)；
两种PCR反应的阳性对照均为pCAMBIA3301质粒(由华南农业大学生命科学学院郭振飞研究员实验室提供)，其中包含目的基因和筛选标记基因ifer ;阴性对照均为野生型大豆叶片总DNA。对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像系统进行观察、拍照，获取电泳图，见附图6和附图7所示。由附图6和附图7可知，4号植株和6号植株经PCR检测为阳性植株。
权利要求
1.一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，其特征在于包括培养皿和培养皿盖，在培养皿中固定有一基板，基板上设置有贯通柱孔，所述贯通柱孔至少下端伸出基板并保证其下端底部与培养皿底距离为Irnm 2mm ;所述贯通柱孔的孔内径大小与外植体茎径大小相适配。
2.根据权利要求I所述的装置，其特征在于包括培养皿和培养皿盖，在培养皿中固定有一基板，所述基板为用于核苷酸片段扩增的PCR板；切掉PCR板底部的小管形成贯通柱孔，保留PCR板四个角上的小管作为支架，置于培养皿中。
3.一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法，其特征在于包括以下步骤 (1)制备用于局部侵染处理下胚轴外植体的农杆菌菌液； (2)获取大豆下胚轴外植体供体材料和下胚轴外植体； (3)将下胚轴外植体插入权利要求I或2所述装置的贯通柱孔中，使下胚轴外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，权利要求I或2所述装置的培养皿中倒入BA处理溶液至Imm 2mm深度，盖上培养皿盖，静置20min后倒掉BA溶液； (4)对经步骤(3)处理的下胚轴外植体进行农杆菌侵染前的预培养； (5)将经过步骤(4)预培养后的下胚轴外植体插入权利要求I或2所述装置的贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，权利要求I或2所述装置的培养皿中倒入步骤(I)所述的农杆菌菌液至Imm 2mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉农杆菌菌液； (6)对侵染后的下胚轴外植体进行共培养； (7)对侵染后的下胚轴外植体进行恢复再生培养； (8)对侵染后的下胚轴外植体再生的不定芽进行筛选培养； O)抗性芽生根培养与抗性苗驯化移栽； 其中，步骤(4)所述预培养为I 2天；步骤(6)所述共培养为3 6天。
4.根据权利要求3所述的侵染方法，其特征在于步骤(4)所述预培养为I天。
5.根据权利要求3所述的侵染方法，其特征在于步骤(6)所述共培养为3天。
6.根据权利要求3所述的侵染方法，其特征在于包括以下步骤 (1)用已灭菌的接种环蘸取EHA105农杆菌菌种菌液，在固体培养基上划线接种之后，培养至长出单菌落，再用接种针挑取单菌落接种至盛有液体农杆菌培养基的大离心管中，恒温摇床培养，离心，保留沉淀，再向大离心管沉淀中加入液体共培养基，悬浮沉淀，恒温摇床培养，调整菌液的OD值为O. 5 I. O ; (2)大豆种子经灭菌后接种至无激素MSB5培养基上培养,获得大豆幼苗作为下胚轴外植体供体材料，从幼苗切割下胚轴切段为外植体； (3)把切割好的下胚轴外植体插入权利要求I或2所述装置的贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，然后所述装置的培养皿中倒入BA处理溶液至Imm 2mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的BA溶液； (4)把经过步骤(3)BA溶液处理后的外植体以竖插方式接种至无激素MSB5培养基上，预培养；(5)把经过步骤(4)预培养后的下胚轴外植体插入权利要求I或2所述装置的贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，然后向所述装置的培养皿中倒入步骤(I)所述的农杆菌菌液至Imm 2mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉农杆菌菌液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的农杆菌菌液； (6)把经过步骤(5)农杆菌局部侵染后的下胚轴外植体以外植体的形态学上端朝上的竖插方式接种至无抗生素的固体共培养基上共培养； (7)把经过步骤(6)共培养后的下胚轴外植体以外植体的形态学上端朝上的竖插方式接种至无抗生素的恢复培养基上培养； (8)把经过步骤(7)所述恢复培养后已经再生不定芽的下胚轴外植体以横放方式接种至筛选培养基上培养； (9)把经过步骤(8)筛选培养后仍然鲜绿的抗性芽从外植体上切割分离Icm 2cm，以竖插方式接种至生根培养基上培养，取出生根的抗性苗，洗净抗性苗根上的培养基后，栽植到干净的细砂基质中保湿炼苗。
7.根据权利要求6所述的侵染方法，其特征在于步骤(I)所述农杆菌培养基5g/L牛肉浸膏+lg/L 酵母膏+5 g/L 蛋白胨+5 g/L 鹿糖+0.4 g/100 mL MgSO4 · 7H20,用 I mg/LNaOH溶液调整pH至7. 4，培养基灭菌冷却后加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100mg/mL氯霉素母液和50 mg/mL的卡那霉素母液,使两者终浓度分别为100 mg/L和50 mg/L ;其中固体培养基中加入7 g/L琼脂； 步骤(I)所述液体共培养基:MS培养基配方的无机成分+B5培养基配方的有机成分+500 mg/L水解络蛋白+30 g/L蔗糖+100 mg/L乙酰丁香酮，用I mg/L NaOH溶液调整pH至5. 5;培养基灭菌冷却后加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其终浓度为100 mg/L ； 步骤(2)所述MSB5培养基为MS培养基配方的无机成分+B5培养基配方的有机成分+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH值为5. 8 6. O ; 步骤(3)所述BA处理溶液的配制用I mg/L NaOH溶液充分溶解BA药品，再用去离子水定容，配制成30 mg/L的BA处理溶液，采用I mg/L HCl溶液调整pH值为5. 8 6. O后灭菌处理； 步骤(7)所述恢复培养基MS培养基配方的无机成分+B5培养基配方的有机成分+25g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH值为5. 8 6. O后灭菌处理； 步骤(8)所述筛选培养基MS培养基配方的无机成分+B5培养基配方的有机成分+25g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌剂+筛选剂+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH值为5. 8 6. 0，培养基灭菌冷却后加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的抑菌剂母液和筛选剂母液至所定浓度。
8.根据权利要求6所述的侵染方法，其特征在于步骤(4)所述预培养基:MS培养基配方的无机成分+B5培养基配方的有机成分+25 g/L鹿糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂,用I mg/L NaOH溶液调整pH值为5. 8 6. O后灭菌处理。
9.根据权利要求6所述的侵染方法，其特征在于步骤(6)所述共培养基:MS培养基配方的无机成分+B5培养基配方的有机成分+500 mg/L水解络蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮+8 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH值为5. 5，培养基灭菌冷却后加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其终浓度为100 mg/L。
10.根据权利要求6所述的侵染方法，其特征在于步骤(9)所述生根培养基:MS培养基配方的无机成分+B5培养基配方的有机成分+0. 5 mg/L NAA +25 g/L鹿糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌剂+7 g/L琼脂，用I mg/L NaOH溶液调整pH值为5. 8 6. 0，培养基灭菌冷却后加入经过孔径为O. 22微米滤膜过滤灭菌的抑菌剂母液至所定浓度。
全文摘要
本发明公开一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置和侵染方法。为了抑制外植体表面的农杆菌在培养基上的过旺增殖以防止植物材料的腐烂并且不使用抗生素，本发明提供了一种设计简单的装置成功应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌侵染，避免把整个外植体浸泡在农杆菌菌液中，只对有再生不定芽潜能的下胚轴上端切口附近进行农杆菌侵染处理。本发明进一步对侵染方法条件进行了优化。应用本发明可以降低大豆下胚轴外植体遗传转化受体系统的药剂成本和提高转化工作效率。
文档编号C12M1/00GK102827756SQ20121020969
公开日2012年12月19日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者杨跃生, 刘颖, 张奇, 于磊, 郭振飞, 年海 申请人:华南农业大学