本发明涉及植物病理学技术。具体是一种避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法。
背景技术：
稻曲病是水稻上的重要病害，可给水稻生产造成重大损失。该病害由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染造成。分生孢子是稻曲病菌的无性繁殖体，在稻曲病的病害循环和病害流行中发挥重大作用。在实验室内，分生孢子也是稻曲病研究不可缺少的材料。有关孢子的形成发育生理、对不良环境的生存适应性或抵抗性，孢子与寄主的识别互作反应等研究，都需要使用孢子形态的材料；新型防治药物研发方面的有关研究，如药剂对孢子的致毒效应等，也需要孢子；分子生物学领域的有关研究，如致病相关基因的诱变、定位与克隆等；也离不开孢子；可见，分生孢子是稻曲病日常研究的重要的菌体形态。而且在许多工作中，往往要求研究所用的分生孢子纯净无污染。
稻曲病菌可形成两种形态的分生孢子，一种为厚壁分生孢子，另一种为薄壁分生孢子。在实验室工作中，由于培养制备厚壁分生孢子存在较大的技术困难，因而多使用其薄壁分生孢子，后文的“分生孢子”或“孢子”均指稻曲病菌的薄壁分生孢子。
长期以来，文献公开的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法，主要是液体培养方法，该方法的主要技术步骤是，先培养准备稻曲病菌的菌丝体，再将菌丝体移植入液体培养基进行液体振荡培养，直至获得孢子；该培养方法可以获得大量的分生孢子，不过，实践工作中也发现一些不足，如耗时较长，整个过程一般需要15天以上；培养产物混合液中包含有大量的培养基组分、菌体代谢产物和菌丝团等；培养工作需要振荡培养设备；由于该孢子较小且培养产物呈粘稠状态，要沉淀获得较为单纯的孢子液，往往需要高速离心机设备。
随着研究探索的进展，最近已经建立了稻曲病菌薄壁分生孢子的固体培养方法，即用培养皿作培养器具，用琼脂固体培养基培养制备孢子。该方法可弥补上述液体培养方法的一些不足，不过又出现另一弊病，就是缘于培养皿的结构特性，制备培养的孢子成品容易被污染。
一般实验室使用的培养皿由皿底和皿盖组成，限于当前培养皿的制作工艺技术，皿底与皿盖间很难达到均匀贴合的程度，大多数培养皿的皿底与皿盖间存在较大缝隙，培养皿内外的空气流动可畅通无阻。因此，利用普通培养皿制备培养的分生孢子产物容易受外界污染空气的干扰，容易得到带有杂菌污染的孢子成品。尤其是一般的植物病理学实验室，当前均偏好于配置具有降温/升温功能的培养箱，该类培养箱通常为了实现工作室内快速恒温及温度均匀分布状态，往往将工作室设计为循环空气的模式。利用这类培养箱进行的产孢培养，培养皿周围空气处于常流动状态，造成培养皿内材料污染的机率相当高，通常培养5天可造成50％以上的培养平板被杂菌污染，即使一些培养平板上看不到明显的青霉菌等污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染机率仍然较大。因此，利用培养皿制备培养稻曲病菌分生孢子，在技术上很难排除污染的可能。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法，制备培养方法的步骤如下：
1.采用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。
2.基底培养基的制备及空白三角瓶的灭菌
按配比为：马铃薯100g、琼脂20g、水900mL，制备基底培养基，并分装入步骤1准备的三角瓶；另取步骤1准备的三角瓶直接套瓶塞成空白三角瓶；然后把基底培养基与空白三角瓶一起进行常规高压高温灭菌，备用。
3.核糖的非高温灭菌
按配比为：核糖10g、水100mL，用清水将核糖配成核糖溶液，在无菌条件下用细菌过滤器将该核糖溶液进行过滤灭菌，备用。
4.马铃薯核糖瓶式培养基的配备
将步骤2制备的基底培养基加热熔化，水浴平衡至60℃，同时将步骤3过滤灭菌的核糖溶液在水浴中平衡至60℃，然后将二者同时转移到超净工作台无菌环境中，按体积比例：基底培养基/核糖溶液＝9/1，将基底培养基与核糖溶液混合，形成实际配比为：马铃薯100g、核糖10g、琼脂20g、水1000mL的马铃薯核糖培养基，混合摇动均匀后，分装入步骤2准备的灭菌空白三角瓶，形成瓶式产孢培养基。
5.母代稻曲病菌的移植
以实验室已有的稻曲病菌分生孢子液作母代菌体，用移液器将该母代孢子液移植入步骤4制备的瓶式产孢培养基，并使孢子液在培养基面上分散均匀。
6.产孢培养
将步骤5操作完备后的瓶式产孢培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养。
7.新一代孢子的收集
通常步骤6培养5天后，培养基面上已形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的分生孢子；用无菌水洗脱菌落上的孢子，并集中到灭菌容器内，即获得无杂菌污染的较高质量的稻曲病菌薄壁分生孢子液。
本发明的特色与优点是：
1)三角瓶配上常规瓶塞后，能阻隔普通微生物的通过，很好地保护三角瓶内不受杂菌污染，因而能高效避免污染，获得高质量的孢子成品。
2)无需振荡培养设备，获得的分生孢子液成品含菌丝体、培养基、及菌体代谢外泌产物等较少。
3)制备进程快速、效率高，稻曲病菌不仅产孢量大，而且产孢菌落没有形成大量茂密的气生菌丝。
4)三角瓶的保护可使得产孢菌落能随意放置一段时间而不受污染，并保持产孢状态，便于与需要孢子的工作程序衔接。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
本发明的关键技术是三角瓶与马铃薯核糖琼脂培养基的结合与应用。
三角瓶虽然属植物病理学实验室的日常器具，但其常规用途主要是装盛培养基灭菌；也常见用于装盛液体培养基、或植物组织类培养基(如籽粒、秸杆等)进行病原菌培养。
琼脂类培养基的应用，现有的技术规范都是使用培养皿作培养器具，将琼脂培养基加热熔化后，倒入培养皿制成培养基平板，并在该培养平板上培养病原菌。
稻曲病菌分生孢子在琼脂培养基上的制备培养，均为应用常规的技术规范，即利用培养皿结合琼脂类培养基的培养技术进行制备培养；至今还未见有利用三角瓶作培养器具，在琼脂类培养基上进行稻曲病菌产孢培养的孢子制备技术。可能原因是对培养皿的长期依赖及习惯沿用，以及通常认为病原菌产孢需要通气性良好的环境条件，而培养皿恰好能满足良好的通气性。
普通三角瓶套上瓶塞后，虽然形成通气性较差的封闭环境，但发明人反复试验发现，稻曲病菌能在该较为封闭的环境内的马铃薯核糖琼脂培养基上形成分生孢子；而三角瓶的应用，则正好解决应用培养皿容易导致污染的重大技术问题。
马铃薯核糖培养基一般很少用于病原菌的常规培养，发明人发现，该培养基经过常规高压高温灭菌后，抑制稻曲病菌的生长发育，但用不经过高温处理的核糖配制的培养基，却促进稻曲病菌的薄壁分生孢子形成；稻曲病菌在马铃薯核糖培养基上不仅产孢量大，而且菌落没有形成大量茂密的气生菌丝。本发明采用马铃薯核糖培养基制备稻曲病菌薄壁分生孢子，该培养基配比为：马铃薯100g，核糖10g，琼脂20g，水1000mL。
马铃薯核糖培养基除开组分核糖外，剩下的组分是马铃薯琼脂，该马铃薯琼脂组分提供凝固特性和基本营养，本发明将其称为“基底培养基”。由于核糖不能高温灭菌，因而马铃薯核糖培养基的灭菌需要两种灭菌技术的合成，即先用高压高温灭菌方法将基底培养基灭菌，并用非高温灭菌方法将核糖灭菌，再将已灭菌的二者在非高温条件下混合而成。
基底培养基与核糖液的混合无需特定的比例，但需要兼顾琼脂的凝固性和核糖溶液的过滤操作性，经测试比较，以体积混合比例为：基底培养基/核糖溶液组分＝9/1，为较适宜的混合比例。按这个混合比例，基底培养基的配比应为：马铃薯100g、琼脂20g、水900mL；而核糖溶液的配比应为：核糖10g、水100mL。
实际工作中，由于基底培养基灭菌冷却后变成固体，不能任意量取，因而需要在灭菌前定量装瓶；每瓶定量装入90mL(或135mL)的基底培养基，使用时加入10mL(或15mL)的核糖溶液，这样的混合方式，操作起来较为简单便捷。
使用时，取已灭菌的基底培养基加热熔化，并置于水浴锅内平衡至60℃，同时把已灭菌的核糖溶液也平衡至60℃，取核糖溶液15mL加入一瓶135mL基底培养基中混合，即获得配比为：马铃薯100g，核糖10g，琼脂20g，水1000mL的马铃薯核糖培养基，混合均匀后分装到已灭菌的空白三角瓶(规格250mL)，每瓶装20～30mL，即成为本发明的瓶式产孢培养基。
需要特别说明，在母代稻曲病菌的移植步骤中，稻曲病菌菌丝体不适合用作本发明移植入瓶式培养基的母代菌体，移植用的母代菌体必需使用稻曲病菌孢子本身；这母代孢子液可来源于常规液体培养方法培养所得，也可来源于本发明方法培养所得，母代孢子液的孢子量通常无需准确定量，一般孢子浓度为106个/mL的孢子液，移植20～50μL到一个三角瓶式培养基上，能满足正常制备培养新一代孢子的菌体量要求。将母代孢子植入三角瓶式培养基后，可用灭菌T形玻棒等工具轻轻抹动，使孢子液在三角瓶式培养基面上分散均匀。
产孢培养可在普通培养箱内实施，温度控制在稻曲病菌生长的适宜温度，本发明培养温度采用28℃；培养过程对光照条件和湿度条件无特别需求。
通常产孢制备培养5天后，三角瓶内的培养基面上已均匀形成大量的微小菌落，菌落上已形成大量的分生孢子。
在收集制备培养获得的新一代分生孢子操作中，可采用光滑的T形玻棒或灭菌小毛刷刷洗菌落，使孢子释放到洗孢液中；由于产孢菌落很小以及新一代孢子处于堆积密集状态，用小毛刷刷洗孢子的洗脱效率更高。
实施例1
应用本发明一种避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法，制备培养稻曲病菌菌株Uv-111的分生孢子，按如下步骤实施操作：
1.采用250mL普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。
2.基底培养基的制备及空白三角瓶的灭菌
按配比为：马铃薯100g、琼脂20g、水900mL，制备基底培养基，并分装入步骤1准备的三角瓶，每瓶装135mL；另取步骤1准备的三角瓶直接套瓶塞成空白三角瓶；把基底培养基与空白三角瓶一起进行常规高压高温灭菌，备用。
3.核糖的非高温灭菌
按配比为：核糖10g、水100mL，用清水将核糖配成核糖溶液，在无菌条件下用细菌过滤器将该核糖溶液进行过滤灭菌，备用。
4.马铃薯核糖瓶式培养基的配备
将步骤2制备的基底培养基加热熔化，水浴平衡至60℃，同时将步骤3过滤灭菌的核糖溶液在水浴中平衡至60℃，然后将二者同时转移到超净工作台无菌环境中，取核糖溶液15mL与一瓶基底培养基混合，形成实际配比为：马铃薯100g、核糖10g、琼脂20g、水1000mL的马铃薯核糖培养基，混合摇动均匀后，分装入步骤2准备的灭菌空白三角瓶，每瓶装30mL，形成瓶式产孢培养基。
5.母代稻曲病菌的移植
以实验室已有的稻曲病菌菌株Uv-111分生孢子液作母代菌体，用移液器将该母代孢子液50μL移植入步骤4制备的瓶式产孢培养基，并用灭菌T形玻棒轻轻抹动，使孢子液在培养基面上分散均匀。
6.产孢培养
将步骤5操作完备后的瓶式产孢培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养。
7.新一代孢子的收集
步骤6培养5天后，培养基面上形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的分生孢子；用无菌水15mL洗脱一瓶菌落上的孢子，可获得孢子浓度为21.47×106个/mL，无杂菌污染的分生孢子液。
实施例2
应用本发明一种避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法，制备培养稻曲病菌菌株Uv-110分生孢子，按实施例1的步骤1至步骤7操作实施，不同的只是步骤5的菌株是Uv-110；结果用无菌水15mL洗脱一瓶菌落上的孢子，可获得孢子浓度为5.74×106个/mL，无杂菌污染的分生孢子液。
实施例3
应用本发明一种避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法，制备培养稻曲病菌菌株Uv-105分生孢子，按实施例1的步骤1至步骤7操作实施，不同的只是步骤5的菌株是Uv-105；结果用无菌水15mL洗脱一瓶菌落上的孢子，可获得孢子浓度为4.55×106个/mL，无杂菌污染的分生孢子液。