大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的用途。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是一种土传的维管束系统病害，是由大丽轮枝菌引起的，其对棉花的 生产造成了严重的危害。自1935年，棉花黄萎病随着棉花种子的引进而传入我国，随后便 开始逐渐蔓延全国。尤其从20世纪90年代以后，棉花黄萎病在我国扩展蔓延极为迅速，其 中1993年棉花黄萎病最为严重，发病面积达266. 67万hm2,随后在1995、1996、1999、2000、 2002、2003年全国范围内连续爆发，损失十分严重，棉花黄萎病已对我国棉花生产以及可持 续发展构成极大威胁。
[0003] 棉花黄萎病是由半知菌亚门（Deutermycotina)淡色菌科（Mmonilaceae)轮 枝菌属（Verticillium)真菌引起，属内有若干个种，其中危害棉花的有大丽轮枝菌 (V. dahliae)和黑白轮枝菌（V. albo-atum)两个种。我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌 引起的。大丽轮枝菌没有寄主专化性，可以危害多种植物，从一年生的草本植物到多年生的 木本植物。大丽轮枝菌可以形成一种叫做黑色微菌核的休眠结构，可以在缺乏寄主的土壤 中存活长达数年。
[0004] 大丽轮枝菌主要以微菌核的形式越冬，微菌核作为其最主要的初侵染来源，在受 到植物根部分泌物的刺激时便会萌发。菌丝一般从植物根部侵入，随着植物的蒸腾作用向 植物的茎叶中扩展、定植，最终侵染整个植株。一般被大丽轮枝菌侵染过的植株都会表现出 萎蔫，干枯，叶脉失色，坏死等症状，维管束变褐是黄萎病最典型的症状。
[0005] 田黎等的研宄认为棉花黄萎病的发生发展与土壤中微菌核的数量密切相关。大丽 轮枝菌微菌核的多少通常与其致病力和抗逆性相关。有研宄显示，当土壤里棉花黄萎菌微 菌核达到〇. 03个/g 土时，就会导致棉花出现萎蔫症状，当土壤中微菌核含量达到0. 3个/g 土~I. 0个/g 土时，就会有20 %~50%的棉花植株发病，当土壤中微菌核含量达到3. 5个 /g 土以上，棉花植株都会发病。另有研宄表明，当土壤中微菌核含量达到0. 5个/g 土为引 起棉花发病的临界值。在田里面，当黄萎菌侵染莴苣后，土壤中的微菌核数量为至少50个 /g 土，而病害很重的田块，微菌核数目高达2400个/g 土。
[0006] 棉花是目前世界上种植面积最大的工业原料作物，在我国是仅次于粮食的第二大 农作物。棉花黄萎病是目前我国棉花生产过程中最具毁灭性的真菌病害。由于至今尚未研 制出效果显著的防治药剂和抗病品种，被称为棉花的"癌症"，因此如何控制黄萎病的猖獗 危害，已成为棉花生产可持续发展的关键问题。在这种情况下，研宄大丽轮枝菌的致病机 理，了解大丽轮枝菌与寄主的互作机理就显得更为重要。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2或其基因。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备分生孢子产量降低的重组大丽 轮枝菌的方法。
[0009] 本发明所提供的一种制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法，是抑制目 的大丽轮枝菌中大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因的表达，得到分生孢子 产量低于所述目的大丽轮枝菌的重组大丽轮枝菌；
[0010] 所述大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2为a)或b):
[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 1所示的蛋白质；
[0012] b)将SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的由a)衍生的 蛋白质。
[0013] 其中，SEQ ID No. 1由395个氨基酸残基组成。
[0014] 上述b)中所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述b)中所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。
[0016] 上述b)中所述蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 2所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到的。
[0017] 上述方法中，所述分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的分生孢子产量低于所 述目的大丽轮枝菌；所述目的大丽轮枝菌为含有所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2的基因的大丽轮枝菌，如大丽轮枝菌野生型菌株V592。
[0018] 上述方法中，所述抑制目的大丽轮枝菌中所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白 VdpdaA2的基因的表达是通过将所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因敲 除的方式实现的。
[0019] 上述方法中，所述基因敲除可通过同源重组实现。
[0020] 本发明提供的利用所述制备分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌的方法获得的 分生孢子产量降低的重组大丽轮枝菌也属于本发明保护的范围。
[0021] 本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2表达的物 质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质或降低所述大 丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的物质在培育抗大丽轮枝菌植物中的应用 也属于本发明保护的范围。
[0022] 上述应用中，所述抗大丽轮枝菌植物可为转基因植物。
[0023] 上述应用中，所述植物可为大丽轮枝菌的寄主；所述大丽轮枝菌的寄主可为双子 叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物可为棉花、番茄、向日葵、黄瓜等；所述单子叶植物 可为水稻、玉米、高粱、麦类、谷子等；所述大丽轮枝菌的寄主具体可为棉花。
[0024] 本发明所提供的抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2表达的物 质、抑制所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质或降低所述大 丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2活性的物质在制备大丽轮枝菌抑制剂中的应用 也属于本发明保护的范围。
[0025] 上述应用中，所述大丽轮枝菌抑制剂可通过所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋 白VdpdaA2或所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因为靶点进行筛选。
[0026] 上文中，所述抑制大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物 质可为干扰大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的基因表达的物质，如microRNA、 VdpdaA2的基因的反义基因表达的RNA。
[0027] 本发明还提供了所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2,或所述大丽轮 枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料在调控大_轮枝菌分生孢子产量中 的应用；
[0028] 所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2相关的生物材料为下述Al)至 A20)中的任一种：
[0029] Al)核酸分子；所述核酸分子为编码大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2 的核酸分子；
[0030] A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒；
[0031] A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体；
[0032] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0033] A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物；
[0034] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0035] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0036] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0037] A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0038] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0039] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0040] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0041] A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0042] A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0043] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0044] A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0045] A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0046] A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0047] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0048] A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0049] 上述应用中，所述调控大丽轮枝菌分生孢子产量可为降低大丽轮枝菌分生孢子产 量。
[0050] 上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸 分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0051] 所述核酸分子为如下1)-5)中任一所不的基因：
[0052] 1)其编码序列是SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0053] 2)序列是SEQ ID No. 3的cDNA分子或DNA分子；
[0054] 3)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0055] 4)与2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述大丽轮枝菌 分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0056] 5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述大丽 轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0057] 上述用于编码所述大_轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的核酸分子，本领 域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明 的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋白VdpdaA2的核酸分子的核苷酸序列进行突 变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述大丽轮枝菌分生孢子产量相关蛋 白VdpdaA2的核酸分子的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且编码所述大丽轮枝菌分 生孢子产量相关蛋白VdpdaA2,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0058] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 2的第1-1188位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。与本发明的SEQ ID No. 3的第1-1359位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或85%或更高， 或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软