专利名称：大丽轮枝菌分离的蛋白质多核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种能提高植物抗性和诱导植物防御反应来自于大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分离的蛋白质及编码该的蛋白质的核苷酸极其应用。
背景技术：
棉花黄萎病是一种危害性极大的维管束病害。每年给我国的棉花生产带来极大危害，严重影响我国棉花生产的品质和产量。棉花黄萎病菌在分类地位上属于半知菌亚门丝胞纲丝孢目淡色孢科轮枝菌属，它分属于黑白轮枝菌和大丽轮枝菌两个种，在我国危害最大的是大丽轮枝菌种(Verticillium dahliae)。目前对植物病害的防治主要采取化学防治和选育品种。但是它们往往存在着无法摒除的弊端。上世纪随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注。因此从该病原菌中寻找出具有新活性，新功能的有效物质已成为国内外科学家关注的热点。作为我国棉病主要病害的大丽轮枝菌，其产生的蛋白质作为激发子是一种重要的效应分子。它通过识别并作用植物细胞表面或亚细胞组分的受体分子来传递病原菌的激发子信号，启动植物的防卫系统，诱导植物的局部组织产生过敏性细胞坏死，并通过局部细胞信号物质的系统传递使植物最终产生系统获得性抗性。目前国内外研究的大丽轮枝菌中的激发子，主要起到毒素作用。已经从大丽轮枝菌中分离出许多能够引起植物抗病反应或致使植物发病的活性成分。如早在1982 年Buchner，V.等就在大丽轮枝菌的培养液中分离到一种脂多糖复合物PLPC(protein-lipopolysaccharidecomplex)，可以诱发与黄萎病菌类似的致病症状(Buchner，V.等， Physiol. Mol. PlantPath.，1989，35 :253-269)；同时 Kazakov，I 等用黄萎毒素处理棉苗， 显微观察显示其维管系统产生了胶滞体与侵填体(Kazakov，I等，Uzbekiston Biologija Zurnali. 1989, (5) :8-10)。Davis, D. Α.等从大丽轮枝菌发酵液中分离到一个约65-kDa 的糖蛋白，该糖蛋白的蛋白成分能有效地积累植保素，是主要活性成分，糖基起着结构作用 (Davis, D. Α.等，Physiological and Molecular Plant Pathology，1998，52，259-273)。国内上海植物生理研究所储昭庆等人分离了一个约沈-kDa的分泌型糖蛋白复合物，该糖蛋白能够诱导海岛棉培养细胞中棉酚等倍半萜的合成，棉酚的积累随着糖蛋白浓度成正比，但当该糖蛋白浓度达到较高的水平时会引起植物细胞死亡(储昭庆等， 植物学报1999，41 (9) :972 976)。上海植物生理研究所陈晓亚等从所制备的大丽轮枝菌EST序列中，获得了一个233个氨基酸残基组成的激发子蛋白。该蛋白能够诱导活性氧的爆发和相关I3R基因的表达，在较低的浓度下诱导棉花悬浮细胞棉酚等倍半菇类植保素的合成(APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2004，70，4989-4995 ；专利号 ZL 200310108076. 8)。所有已公开发表的文献表明，大丽轮枝菌确实可以分泌产生激发子，引起植物的防御反应提高植物的抗性。虽然该菌产生的激发子性质和种类各不相同，但是它们的蛋白
3质序列和基因序列报道的很少，所以寻找一种新的蛋白质激发子，明确它的序列信息为揭示功能和进一步提高植物的抗性是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一能够提高植物抗性及防御性的大丽轮枝菌分离蛋白质及其编码多核苷酸和该蛋白及其编码多核苷酸的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种分离的蛋白质，其中，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本发明的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。本发明的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其中，植物为烟草。一种分离性的多核苷酸，其中，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(1)编码如权利要求1蛋白质的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。一种编码如本发明的多核苷酸，其中，其多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。一种载体，其中，它含有本发明的多核苷酸序列。一种遗传工程的宿主细胞，其中，它含有本发明6的载体。一种本发明的蛋白质制备方法，其中，包含下列方法(1)在表达条件下，培养本发明7的宿主细胞；(2)从培养物中分离出本发明1的蛋白质。本发明的蛋白质，是指来自棉花黄萎病大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。本发明的优点为，该种蛋白质可以明显的提高植物的抗性，浓度低起效快，为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。
图1是接种TMV后叶片的照片图2氨基酸序列对比图
具体实施例方式下面通过具体实例进一步说明本发明特点。实施例1大丽轮枝菌的培养及发酵液制备将大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)菌株划线菌块接种于PDA取去皮马铃薯 200克，切成块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，121°C灭菌30分钟平板，25°C培养2周，挑去菌落边缘处接种于200mL盛有Czapek-Dox加水解络氨酸(Sigma)硝酸钠3. 0g，无水磷酸氢二钾1. Og,七水硫酸镁0. 5g，氯化钾KCl 0. 5g，七水硫酸亚铁0. Olg,蔗糖30. Og (北京化工厂，分析纯)，PH 5. 6，加去离子水至1L液体培养基的500ml三角瓶中，25°C、150r/min培养14天，得到大丽轮枝菌的发酵液。
实施例2粗蛋白质激发子的制备和监测取实施例1中所得的发酵液，在4 °C、5000rpm条件下离心Ih (或13000rpm， 30min)，收集上清液，用0.45mm的滤膜(Whatman)抽滤两次，直至没有菌体。加入硫酸铵粉末，使上清液中硫酸铵终浓度为80%来沉淀目标蛋白质，4°C透析48h，最后将获得的胞外总蛋白质溶解到Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)中，蛋白质终浓度为100yg/mL。蛋白质含量用 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)经 GF-M2000 型酶标仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)在波长590nm处测定。生物活性的监测以生长2个月，具有5-7片真叶的烟草为材料，Tris-HCl缓冲液和粗蛋白相同浓度的BSA溶液为对照。粗蛋白溶液浓度稀释到50yg/mL，利用ImL不带针头的注射器，将50 μ L溶液从叶子背面分别注射进叶片中去。经过24h观察是否有坏死斑形成。结果注射粗蛋白质激发子的叶片，注射部位4h后出现水渍斑，他后注射处叶片变得透明较薄一些，1 后可以呈现典型的过敏反应，有坏死斑形成。对照并无任何反应，和正常叶片一样。实施例3蛋白质激发子的分离纯化及生物活性测定使用AKTAexplore 10 (GE Healthcare)蛋白质纯化仪对所得的总蛋白质进行进一步纯化，样品首先通过HP Q HiTrap 阴离子交换柱(GE Healthcare)，用NaCl进行线性洗脱(0%-100%，30min)，获得到6个蛋白质洗脱峰，应用的蛋白浓度为50 μ g/mL，结果表明， 第3个蛋白质峰，可以强烈的引起烟草的过敏反应；该蛋白质峰再通过pheny HP疏水层析柱(GEHealthcare)和电洗脱的进一步纯化，得到有活性的单一蛋白质。以上纯化过程中蛋白质激发子活性的监测是按实施例2的方法进行。该单一蛋白质峰经15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带，说明蛋白质纯度高。该蛋白质表观分子量为17kD(pI=4.34)Jf 此蛋白质蛋白质激发子命名为 PevDl(￡rotein Elicitor of Verticillium dahliae 1)。 用实例2同样方法测试，设置不同浓度的PevDl (22 μ M，11 μ M，5 μ M，1 μ M，500ηΜ, IOOnM, IOnM)，1 μ M能够引起典型过敏性反应，最低能引起过敏反应的蛋白浓度为ΙΟΟηΜ。结果分离纯化的PevDl可以使烟草形成过敏反应的坏死斑。(1)氧爆发和H2A沉积取约0. lg/mL的烟草悬浮细胞，离心收集重悬于缓冲液(175mM甘露醇，0. 5mM氯化钙，0. 5mM硫酸钾(北京化工，分析纯)，IOmM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma) pH 5. 75) 中，孵育Ih在，150rpm。然后去250 μ L悬浮细胞加入HEPES缓冲液(和上边缓冲液一样配方同时添加0. 3mM发光氨(Luminol))中，同时加入PevDl使其终浓度为luM，开始用化学发光检测仪(Promega)，检测细胞所生成的活性氧。叶片处理方法如实例2，PevDl浓度为1 μ Μ,时间为Mh。取处理的叶片用蒸馏水洗净后将其置于 2mL 管中，取适量 DAB (3，3’ -Diaminbenzidine) (Sigma)染液(lmg.mL-1， pH3. 8)，用NaOH调pH值至5. 8，分别加入预处理的植物组织，室温避光保存8小时。随后去除各管中染液，加入95 %乙醇，沸水浴数分钟，去除各管液体，再加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿色完全脱去为止，再次吸出各管液体，将去浸泡在70%甘油中，赶出细胞间气泡显微镜观察。结果PevDl处理约30min后，烟草悬浮细胞出现氧爆发现象；在PevDl处理的叶片部位有明显的褐色沉积物质出现，并且处理部位的气孔上的保卫细胞也出现红褐色沉淀。(2)细胞培养基的碱化取约0. lg/mL的烟草悬浮细胞，重新转接到新的烟草悬浮细胞培养基中，25 °C， 150r/min培养3天后，加入蛋白质激发子PevDl处理，使其终浓度为ΙμΜ，继续摇培。此后每过IOmin用ρΗ剂测定培养基的ρΗ，直到处理后lOOmin。结果蛋白质激发子PevDl能够引起细胞培养基的碱化，在处理后50min培养基的 PH达到最高。(3)胼胝质的沉积酚类物质和木质素的积累取实施例2中方法，经IuM的PevDl处理24h后的叶片，将叶片放入缓冲液(1 %戊二醛，5mM柠檬酸，90mM磷酸氢二钠(北京化工，分析纯)pH 7.4)过夜。然后放入无水乙醇中煮lOmin，在放入50%乙醇中，接着转入缓冲液(67mM磷酸氢二钾(北京化工，分析纯)， PH 12)。在染色液(0. 苯胺蓝(Sigma)，67mM磷酸氢二钾(北京化工，分析纯)，ρΗ 12) 染色lh，放入70%甘油固定观察。取0. 5g烟草细胞，加入PevDl使其终浓度为luM，处理108h后，用6mol/L的2. 5% w/v间苯三酚(Sigma)处理，立即观察。取300 μ L烟草悬浮细胞，加入PevDl使其终浓度为1 μ Μ，处理10 后，在紫外荧光显微镜下观察酚类物质的积累。结果在PevDl处理的叶子，细胞壁出现胼胝质星状的积累；处理过的烟草悬浮细胞有木质素的积累；可以观察到酚类物质在细胞上的沉积。实施例4蛋白质激发子PevDl肽段序列的获得纯化的PevDl蛋白质经双向电泳检测，切取蛋白质单点分别经IOng/ μ 1测序级修饰胰蛋白质酶 Gequencing Grade Modified Trypsin，Promega) 30°C、ρΗ7· 5 酶解 30min lh，ESI-MS/MS为英国Micromass公司的Q-T0F2正交加速电喷雾串联质谱仪。配备纳升喷雾源。所有测定均在正离子方式下进行。质谱仪用Glu-fib的串联质谱碎片校正，质量准确度小于0. IDa。雾化气为氮气，碰撞气体为氩气。源温80°C，锥孔电压50V。TOF加速电压9. lkV。MCP检测器电压为2150V。毛细管电压800V。获得该蛋白质的多个肽段序列，这些序列和NCBI中GenBank NO. XP 003008076所编码的氨基酸序列相匹配。如图2所示，用黑体(下划线)表示的为测序获得的肽段序列。实施例5蛋白质激发子PevDl编码基因的克隆根据质谱测序结果和密码子的简并性设计4对引物，经筛选验证试验最终选定引物 PevDl-正向 5，-ATGCAGTTCACCCTYGCCG-3，和 PevDl-反向 5，-TTAAGCCTSGGCGGGAGC-3，， 并以大丽轮枝菌株抽提的mRNA为模板，选用HiFi反转录聚合酶进行PT-PCR(94°C 3min ； 94°C 30s, 67°C 30s, 72°C lmin, 35cycles ；72°C IOmin)，扩增出 468bp 的 DNA 片段， 其中包括468bp的完整开放阅读框，将其命名为pevDl基因，该基因的顺序如SEQ ID NO=I 所示。实施例6 pevDl基因的原核表达和纯化(1)表达载体的构建设计蛋白质激发子基因pevDl的特异性引物，引入带有酶切保护碱基的酶切位
6点，正向引物5，-CCGGAATTCATGCAGTTCACCCTCGCCG-3，,(下划线为Eco RI的酶切序列)，反向引物5，-CCCAAGCTTTTAAGCCTCGGCGGGAGC-3’,(下划线为HindIII的酶切序列)，扩增全长 pevDl 基因(94°C 3min ；94°C 30s, 67°C 30s, 72°C lmin, 35cycles ；72°C IOmin ；)。 先将pevDl基因目的片段克隆到pMD18-T simple载体，经Eco RI和HindIII酶切后，将 pevDl片段克隆到pET18a(+)载体(Novagen)的Eco RI/Hindlll位点，热激发转化到大肠杆菌TranslO (Transgene)，挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，酶切并测序验证。(2)诱导表达将步骤(1)中所获得表达载体用热激发转化到大肠杆菌BL21(DE!3)中。质粒提取及转化表达宿主菌株的方法同(1)，验证正确后，进行表达。将验证正确的重组表达菌株过夜活化，同时取pET28a空质粒的菌株作为对照。分别取ImL过夜培养液加入到含有100 μ g/ mLKan的IOOmL LB液体培养基中(1%接种量)，37°C，200r/min振荡培养2 汕培养至 0D600为0. 6 0. 8。加入诱导剂IPTG(终浓度为0. lmmol/L)，22. 5°C,220r/min继续振荡培养Mh，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液。经超声破碎菌体后，4°C高速离心，收集上清。取20yL上清液，加入5yL 5 X SDS上样缓冲液(变性)重悬菌体，沸水浴中加热lOmin，13000r/min离心lOmin，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。结果经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约20_kDa的融合表达蛋白 (His-PevDl)，与预测一致。(3)重组蛋白的纯化利用AKTAexplorerlO蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。选用Hitrap chelating Column柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和柱；取步骤( 离心后的重组蛋白液5mL 进样，流速为lmL/min，淋洗至基线后，洗脱缓冲液进行洗脱；收集的各洗脱峰，在大量体积的磷酸盐缓冲液中4°C透析过夜，随后进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色检测蛋白的纯度。生物活性测定采用实施例2中方法测定重组蛋白质激发子对烟草的活性。结果获得纯化的约20KD的融合表达蛋白(His-PevDl重组蛋白)实施例7重组蛋白(His-PevDl)在烟草上引起的反应用ImL不带针头的注射器，分别将约50mL，1 μ M融合表达蛋白(His-PevDl)，相同浓度的pET48a(+)空质粒表达蛋白及Tris-HCK20mM，pH 8.0)溶液分别从叶子背面分别注入不同的烟草叶片中。24h后观察叶片上的反应。如实例3中(1)的方法，观察重组蛋白诱导H2O2在处理叶片上的积累；如实例3中 (2)的方法，观察重组蛋白引起烟草细胞培养基的碱化。结果重组蛋白(His-PevDl)能够引起烟草叶片发生HR反应；His-PevDl使处理叶片获得H2A积累，产生红褐色沉淀；His-PevDl使处理的烟草悬浮细胞培养基碱化，培养基PH最高的时间和天然纯化的PevDl引起的基本一致。(1)抗性相关基因半定量RT-PCR分析取所需的样品液氮研磨成粉，按50-100mg/mL加入Trizol，室温5min静置， 12000rpm离心5min，弃沉淀；按200 μ L氯仿/mL Trizol，震荡混勻15min放置，4 °C， 12000rpm离心15min，吸取上层，加入0. 5mL异丙醇/mL Trizol，混勻，_20°C静置20min ；离心，75%乙醇漂洗，离心去除乙醇，5-lOmin晾干。加入DEPC处理水，测RNA浓度，调成相同浓度。第一链cDNA 的合成，采用 TransGen 公司的 TransScript Two-Step RT-PCR Kit。取 500ng 总 RNA，按照试剂盒说明书，用 iTransScript RT/RI Enzyme Mix,以 Anchored Oligo (dT) 18 为引物，42 °C 孵育 30min，85 °C 加热 5min 使酶失活。取 IyL 反转录产物做PCR，. β-actin为内标基因，以抗性相关基因特异引物做PCR(rai-a基因 F :5 ‘ -TGGATGCCCATAACACAGC-3 ‘ R5 ‘ -AATCGCCACTTCCCTCAG-3 ‘ ；PRl-b 基因 F 5 ‘ -GATGTGGGTTGATGAGAAGC-3 ‘ R 5 ‘ -CTCCAATTACCAGGTGGATC-3 ‘ ；PDF1. 2 基因 F :5 ‘ -GGAAATGGCAAACTCCATGCG-3 ‘ R 5 ‘ -ATCCTTCGGTCAGACAAACG-3 ‘ ；NPRl 基因 F :5 ‘ -ACATCAGCGGAAGCAGTAG-3 ‘ R 5 ‘ -GTCGGCGAAGTAGTCAAAC-3 ‘ ；ACSl 基因 F 5' -GAGAATGAGAAGAACAGCTCA-3‘ R 5' -TTCTAGCACAATTAACGACGG-3‘)，观察抗性相关基因的表达情况。结果经过半定量RT-PCR结果可见His-PevDl在处理烟草叶片后2天，就可以诱导抗性相关基因的表达，但是ACSl除外，至始至终没有表达。(2)诱导减少TMV对烟草的危害通过预实验可知1 μ M融合表达蛋白对烟草抗TMV有较佳效果。将50 μ L、纯化后的His-PevDl(IyM)溶液通过无针头的注射器，从背面注入烟草叶片中。以Tris-HCL缓冲液作对照，每处理10株，重复3次。TMV的接种方法为取新鲜TMV病叶加0. 01mol/L磷酸缓冲液(pH = 7.4)研磨成勻浆，病汁液浓度为每克病叶加15mL磷酸缓冲液。分别确定最佳接种时间和最佳诱导时间(a)最佳接种时间分别于重组蛋白处理后1、3、5和7d，在处理叶的上一位叶摩擦接种TMV。于接种后3天，调查枯斑数量，计算枯斑抑制率。抑制率(％)=[(坏死斑个数/直径-处理组坏死斑个数/直径)/坏死斑个数 /直径]X 100结果如下表。
权利要求
1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。
3.根据权利要求2所述的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其特征在于，所述的植物为烟草。
4.一种多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(1)编码如权利要求1所述蛋白质的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。
5.一种编码如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4或5所述的多核苷酸序列。
7.一种遗传工程的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.—种权利要求1所述的蛋白质制备方法，其特征在于，包含下列方法(1)在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(2)从培养物中分离出权利要求1所述的蛋白质。
全文摘要
一种能在烟草等植物上引起抗性过敏性反应的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)蛋白质，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。一种编码如本发明所述的蛋白质的基因，其中，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明所述的蛋白质能够引起烟草的抗病相关防御信号分子的生成。在较低的浓度下蛋白质可以诱导植物抗病相关基因的表达；次生代谢物的增多来加强细胞壁的防御病原菌的能力。将该蛋白质注射烟草植株，在形成坏死斑的同时提高了整株烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的能力。本发明的优点为，该种蛋白质可以明显的提高植物的抗性，浓度低起效快，为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。
文档编号A01P21/00GK102558320SQ201010593488
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者曾洪梅, 杨秀芬, 王炳楠, 袁京京, 邱德文, 郭立华 申请人:中国农业科学院植物保护研究所